CN105324832A - 激光烧蚀单元 - Google Patents

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Abstract

激光烧蚀单元(1)包括流道(11)，其具有基本上不变的横截面积，以便确保流道中的严格地层流。样本室(21)被提供邻近流道的侧向开口(14)。激光束(41)通过侧向窗口(16)进入样本室(21)，并撞击在样本(23)的表面(24)上以从样本烧蚀材料。样本可被定位在距离流道的一定距离处，使得激光生成的气雾剂质量分布具有在流道内的其中心。这导致短的气雾剂冲洗时间。激光烧蚀单元特别良好地适于包括成像应用的电感耦合等离子体质谱仪(ICPMS)中的气雾剂生成。

Description

激光烧蚀单元
技术领域
本发明涉及激光烧蚀单元，涉及烧蚀装置以及采用该种激光烧蚀单元的电感耦合等离子体(ICP)离子源，并涉及使用该种激光烧蚀单元(例如以用于生物材料的成像)的方法。
背景技术
电感耦合等离子体质谱仪(ICPMS)提供关于工业、地质、环境和生物样本的主要元素、微量元素、痕量元素和超痕量元素的准确定量信息。在ICPMS中，气雾剂样本由运载气体流运载到所谓的ICP喷灯(torch)。在该喷灯中，气体经受密集的高频率电磁场，其通过感应现象导致等离子体的形成。来自等离子体的离子然后被提取到质谱仪中，其中它们基于它们的质荷比被分离。
ICPMS可与激光烧蚀(LA)耦合以用于烧蚀来自固体样本的材料，以便创建ICP所需的气雾剂。烧蚀可直接在ICP喷灯中执行，或者样本可被放置在ICP喷灯的上游的外部激光烧蚀单元中，并且通过激光烧蚀创建的气雾剂由运载气体流传送到ICP喷灯。例如，参考文献1示出激光烧蚀单元(所谓的HEAD单元)，其中气雾剂喷射方向平行于运载气体的方向。在参考文献2中示出了基于类似原理的另一个激光烧蚀单元设计。
自九十年代上半期开始，已经作出通过在样本表面上扫描激光光斑来将激光烧蚀ICPMS(LA-ICPMS)用作化学成像工具的尝试。许多研究已经基于相当多的各种各样的硬样本和软样本证明了LA-ICPMS的潜在的成像能力。这些研究中的大部分显示大约5-100μm的有效空间分辨率。尽管LA-ICP-MS提供单细胞中的抗原表达的高度多重定量分析，但是其当前缺少组织样本内的单细胞的成像所需的分辨率。
然而，诸如组织切片的诊断分析的一些应用要求更高的空间分辨率，例如，以便可视化细胞间变异性。通过与系统分散卷曲(convolute)的激光光斑尺寸来确定有效的空间分辨率。系统分散反过来通常由每个激光射出之后的气雾剂冲洗时间和扫描速度之间的折衷控制。冲洗时间越长，如果扫描速度保持固定，那么更多的重叠将发生在源自相邻样本点的信号之间。因此，气雾剂冲洗时间通常为用于提高分辨率而不增加总扫描时间的关键限制因素中的一个。
最快的冲洗时间可通过喷灯内烧蚀实现，导致几毫秒的单射出信号持续时间。然而，喷灯内烧蚀局限于非常小的样本，并且激光光斑的扫描非常难于通过喷灯内烧蚀实现。因此，对于成像应用，通常采用外部激光烧蚀单元。然而，即使通过最好的已知单元设计，冲洗时间通常为秒的量级，并且在100毫秒以下的短冲洗时间是难于实现的。
本发明的目的在于提供进一步的和改善的激光烧蚀单元，以及包含该类单元的烧蚀装置(例如，链接到ICP-MS)，该类单元在用于生物材料(诸如组织样本、单层细胞和生物膜)的成像的技术中具有应用，并特别地使LA-ICP-MS适于用作单细胞成像技术。
发明概述
在第一方面，本发明提供具有实现短的气雾剂冲洗时间的可能性的激光烧蚀单元。权利要求1中指定了该种激光烧蚀单元。从属权利要求中主张了本发明的进一步的实施例。
因此，提供了包括流道的激光烧蚀单元，所述流道具有用于将运载气体供给到流道的入口并具有出口。侧向开口被提供在流道的第一壁部分中，并且侧向窗口被放置在流道的第二壁部分中与侧向开口相对。样本室被提供邻近侧向开口。样本室被配置以一种方式接收样本以使得得激光束通过侧向窗口和侧向开口进入样本室，并撞击在样本的表面上，以便从样本表面烧蚀材料并且创建气雾剂。样本室具有用于将屏蔽气体(sheathgas)供给到样本室的入口。
流道的入口和出口可连接到管道，所述管道具有基本上与流道本身的横截面积相同的横截面积。以这种方式，流道基本上像单件管道一样起作用。本发明的烧蚀单元可因此被认为具有“管单元”设计。通过最小化流道的横截面积(并优选地还有横截面形状的)的变化，该“管单元”设计允许维持流道中的基本层流模式，从而尽可能地避免湍流。此外，设计允许将样本定位为足够靠近流道，使得较大比例的激光引起的气雾剂烟流被直接引入运载气体的流中。这些措施显著地减小了分散。在实践中，本单元设计允许将冲洗时间减小到低于30ms(1％最大值处的全宽度)，并使样本冲洗的拖尾减少到最低程度。这种改进被观察到用于跨越整个原子质量范围的元素。
流道优选地具有基本上不变或者最多微弱变化的横截面积。具体地，流道的横截面积优选地在侧向开口的附近基本上不变。如果横截面中的任何变化不显著地扰乱层流，则流道的横截面积可被视为最多微弱地变化。具体地，对于沿流道的任何横截面平面，如果流道的平均直径的变化沿管轴每1mm长度小于1.5mm，优选地沿管轴每1mm长度小于0.5mm，更优选地，沿管轴每1mm长度小于0.2mm，，则可认为横截面积最多微弱地变化。优选地是，流道在侧向开口处不形成显著的收缩，以便避免显著的吸入效应(如在文丘里管中)，并且流道在侧向开口的附近不显著地拓宽，以便避免运载气体被产生的正压力差推入样本室中。
就绝对数目而言，横截面积可采用宽范围的值，这取决于激光光斑尺寸和激光能量。流道的平均直径(被计算为其中A为横截面积)可例如在从50微米到5毫米的范围之间，优选地在从200微米到5毫米的范围之间。
流道的入口和出口之间的角度优选地为至少160°(准确地说，在160°和200°之间)，更优选地为至少170°(准确地说，在170°和190°之间)。换句话说，流道优选地为基本上直的或者在任何方向中弯曲不超过20°(或最好不超过10°)。可以选择相对于流道的方向的屏蔽气体入口的任意方向。优选地，屏蔽气体入口垂直于横向方向延伸。
流道和样本室由分离壁分离，其形成其中布置侧向开口的流道的第一壁部分。为了允许样本被定位为足够靠近流道，分离壁优选地具有小于500微米的最小厚度，更有选地具有小于200微米的最小厚度。应注意的是，分离壁的厚度可沿流道的周长变化；分离壁将通常在紧邻于管和样本室之间的开口处具有其最小厚度，并且厚度将在垂直于管轴的平面中远离开口增大。厚度可进一步沿流道的长度变化。
为了最小化由侧向开口引起的流动扰乱，该开口的横截面积应被保持为小的。另一方面，可以期望的是，使开口足够大，以便使得激光束能够在样本表面上扫描，而不相对于开口移动样本。作为折衷，侧向开口的横截面积优选地不超过大约20mm2，更优选地不超过大约7mm2。相对于流道的横截面积表达的，开口的横截面积和流道的横截面积的比率优选地不超过大约5，更优选地不超过大约3，最优选地不超过大约1。为了使激光束能够通过侧向开口，侧向开口应优选地具有至少大约0.01mm2的横截面积。横向于流道的侧向开口的宽度优选地小于流道的平均直径的80％，并更优选地小于流道的平均直径的50％。侧向开口在流道的方向中的长度优选地不超过五倍的流道的平均直径，并更优选地不超过三倍甚至1.5倍的流道的直径。
为了实现简单的样本更换，激光烧蚀单元优选地具有两部分设计，包括容纳流道的第一单元部分(在以下中被称为“单元顶部”)以及形成样本室的第二单元部分(在以下中被称为“单元底部”)。单元底部优选地可从单元顶部可移除，以用于更换样本。单元底部优选地朝向单元顶部打开，即，样本室和流道之间的分离壁优选地由单元顶部而非单元底部形成。术语“顶部”和“底部”被理解为不定义这些部分的绝对取向；这些术语仅用于更好地区分不同的单元部分，并且激光烧蚀单元也可用于反向取向中，其中单元顶部指向地板且单元底部指向天花板。
本发明还涉及包括如上所述的烧蚀单元的完整烧蚀装置。烧蚀装置进一步包括特别地用于将激光束射出通过侧向窗口和侧向开口并射到样本表面上的激光器(特别地，UV激光器)以及用于改变样本和激光束之间的相对位置的定位设备。定位设备可包括例如以下项中的任一个：x-y或x-y-z平台，以用于相对于激光器移动整个激光烧蚀单元；x-y或x-y-z平台，以用于在激光烧蚀单元内移动样本，同时保持烧蚀单元和激光器之间的相对位置固定；光束偏转器，以用于使激光束偏转，同时保持烧蚀单元和激光器之间的相对位置固定；等等。定位设备可被采用以在样本表面上扫描激光束。可随后相对于其元素或同位素组成来分析得到的气雾剂(例如，通过ICPMS)。以这种方式，可根据其元素或同位素组成来对样本表面进行成像。然而，本发明不限于结合ICPMS成像来使用烧蚀单元，并且还可以其中要求短的气雾剂脉冲的其他方法来使用。
本发明进一步提供包括如上所述的烧蚀单元的ICP离子源。ICP源进一步包括连接到烧蚀单元的出口的ICP喷灯，以及将所述烧蚀单元连接到ICP喷灯的管道。优选地，管道具有横截面积基本上等于烧蚀单元的流道的横截面积或者与流道的横截面积相比，仅微弱地改变，以便以管道的整个长度上的最小分散维持层流。
本发明还包括ICPMS系统，其包括该种ICP离子源以及耦合到离子源的质量分析器。质量分析器可为例如四极质量分析器、飞行时间(TOF)质量分析器或扇形场质量分析器(特别地，Mattauch-Herzog质量分析器)。然而，本发明不限于任何特定类型的质量分析器。
本发明进一步提供操作如上所述的烧蚀单元的方法。方法包括以下项(不必以给定顺序)：
将样本放置在样本室中，使得样本的表面面向侧向开口；
将运载气体供给到流道的入口；
将屏蔽气体供给到样本室的入口；以及
通过将脉冲激光束射出通过侧向窗口和侧向开口并射到所述表面上来从表面烧蚀材料。
激光束的方向、侧向窗口和侧向开口的取向以及因此样本的取向在空间中可为任意的。例如，激光束可指向上方、下方、侧面等等，并且样本表面可以以允许激光束到达样本表面的任何取向进行定向。
每个激光脉冲将导致准瞬时的激光生成的气雾剂质量分布(“烟流”)。这里，“准瞬时”表示比通过运载气体流和屏蔽气体流的质量运输的时间标度短很多的时间标度。激光生成的气雾剂质量分布单独由激光脉冲的行为引起(忽略运载气体和屏蔽气体的正常气流)。在激光脉冲和样本的第一交互之后的少于1毫秒内建立该质量分布。样本被优选地定位在离流道的一定距离处，使得准瞬时的激光生成的气雾剂质量分布的中心在侧向开口和侧向窗口之间的流道内。以通常的方式(以与刚体的质心相同的方式)来定义质量分布的中心，对整个气雾剂烟流进行积分。以该方式，大部分的气雾剂烟流被直接注入运载气体的流中，并且可通过最小分散由运载气体的流运输走。
样本表面和流道的中心轴之间的最优距离将取决于激光器的类型、激光束的能量、运载气体和屏蔽气体的类型以及气体的流率。例如，对于具有在纳秒范围中的脉冲的标准ArF准分子激光器，氩气作为运载气体(流率为1.1L/min，以及氦气作为屏蔽气体(流率为0.6L/min))，已经证明大约2mm的距离为最优的。更概括而言，对于范围为50飞秒到50纳秒的激光脉冲，应优选地以如下方式来定位样本，样本的表面距离流道的中心轴具有范围在0.5毫米到4.5毫米的距离。
因此，样本表面以及使样本室与流道分离的分离壁之间的最优距离将取决于各种参数。该距离可在从小于50微米到1毫米或更多的范围中。距离应足够大，以允许屏蔽气体沿样本的表面流动，并通过侧向开口进入流道中。
屏蔽气体完成至少三个任务：其以气雾剂注入方向的轴线冲洗气雾剂，这帮助摄取运载气体流中的气雾剂颗粒；其在样本表面上形成“保护区域”，并确保烧蚀在受控环境下实施；以及其增加流道中的流速。优选地，屏蔽气体的粘度低于主要运载气体的粘度。这有助于将气雾剂限制在流道的中心，并最小化在烧蚀单元下游的气雾剂分散。特别地，运载气体优选地为氩气(Ar)。氩气特别良好地适用于在气雾剂到达流道的壁之前阻止气雾剂膨胀，并且其还被要求用于大部分的基于Ar气体的ICP中的改进的仪器灵敏度。屏蔽气体优选地为氦气(He)。然而，屏蔽气体可由其他气体替换或包含其他气体(例如，氢气、氮气或水蒸气)。优选地，屏蔽气体的主要部分为氦气(例如，按体积计至少50％)。在25℃，Ar具有22.6μPas的粘度，而He具有19.8μPas的粘度。
运载气体和屏蔽气体的最优流率将取决于多种因素，首先，取决于几何结构，特别是取决于流道的横截面积。第二，它们将取决于侧向开口的几何结构。然而，优选地是，屏蔽气体的体积流率小于运载气体的体积流率，特别地，是运载气体的体积流率的0.3倍到1.0倍。屏蔽气体的流率可被调整用于帮助靠近流道的中心注入气雾剂烟流的中心。
本发明的方法特别适用于化学成像。为此，以上方法可包括在表面上扫描激光束并分析得到的气雾剂，以获得样本表面的化学图像。分析可由质谱分析法(特别地由ICPMS)来完成，但也可由任何其他合适的方法来完成。
本方法良好地适用于生物样本的调查研究，特别地，适用于人类或动物组织的组织样本的调查研究。然而，方法不限于生物样本并且也可应用于其他种类的样本。当对生物样本执行时，本发明的方法可以以亚细胞水平处、以细胞水平或以更低的分辨率(其中组织内的单独细胞不被单独地分辨)来执行。
附图简述
以下参考附图描述本发明的优选实施例，所述附图是用于说明本发明的本优选实施例的目的并且不用于对其进行限制的目的。在附图中，
图1在透视图中示出根据本发明的激光烧蚀单元的示意略图(未按比例)；
图2在中心纵剖面中示出图1的激光烧蚀单元的示意略图(未按比例)；
图3示出激光烧蚀单元中激光生成的烟流的示意图(未按比例)；
图4以示意性方式示出激光烧蚀单元的流道中的气体流的模拟结果；(a)部分示出He和Ar之间的混合分布模式，其中烧蚀的气雾剂位于侧向开口上方的混合界面处，混合的程度以灰度来指示，白色表示混合物的最高程度；(b)部分示出所模拟的气体流速模式，流速以灰度来指示，白色表示最高流速；
图5以高度示意性方式示出采用图1的激光烧蚀单元的完整的LA-ICPMS系统；
图6示出通过改变(a)样本表面和侧向开口之间的间隙空间；(b)运载气体(Ar)流率；以及(c)屏蔽气体(He)流率来说明激光烧蚀单元的性能优化的结果的图示；所有图示示出基于以1％最大准则的全宽被归一化为峰面积的峰宽；
图7示出说明如以各种重复率通过质谱仪中的27Al强度论证的激光烧蚀单元的性能的图示：(a)关于约1Hz的重复率的瞬态信号；(b)(a)部分的括号部分的放大视图；(c)关于约10Hz的重复率的瞬态信号；(d)关于约30Hz的重复率的瞬态信号；
图8示出说明各种同位素的激光烧蚀单元的特征描述的图示；(a)峰宽；(b)从峰面积计算的丰度归一化灵敏度；
图9示出获得的关于Pt涂覆测试模式的图像，其具有以字母“ETH”形式的Au薄膜以及以字母“PSI”形式的覆盖的Ag薄膜；通过(a)光学显微镜；(b)扫描扫描电子显微镜；(c)和(d)采用图1的激光烧蚀单元的LA-ICP-四极-MS来实施成像；以及
图10示出通过LA-ICP单个检测器扇形场MS获得的乳腺癌组织的薄片切割中的人类表皮生长因子受体2(HER2)分布的图像。
优选实施方式的描述
激光烧蚀单元
图1和图2以示意性方式示出根据本发明的示例性实施例的激光烧蚀单元1，在以下其也被称为“管单元”。烧蚀单元1包括两部分：第一部分或单元顶部10以及第二部分或单元底部20。管状流道11形成于单元顶部10中，并从运载气体入口12延伸到混合气体出口13。在单元顶部10的底壁部分15中，形成了侧向开口14。在单元顶部10的顶壁部分17中，形成了横向孔并由UV透明硅窗口16封闭。在单元底部20中，提供了样本室21。屏蔽气体入口22通向样本室21。尽管屏蔽气体入口22被示出为平行于流道11(反)延伸，但是可选择屏蔽气体入口的任意方向。优选地，屏蔽气体入口垂直于横向方向延伸。样本23被放置在样本室21中，并且单元底部20被安装到单元顶部10，使得样本23的顶表面24位于侧向开口14下面。
为了操作烧蚀单元，运载气体G1被供给到流道11的入口12，并且屏蔽气体G2被供给到样本室21的入口22。UV激光束41进入窗口16，横穿流道11，通过侧向开口14离开流道11，并撞击在样本23的顶表面24上。
每个激光脉冲生成气雾剂烟流25(如图3中示意性说明的)。该烟流为激光脉冲的行为的直接结果；紧接着激光脉冲的结束的烟流中的初始质量分布仅受到运载气体G1流和屏蔽气体G2流的极小影响。激光烧蚀单元1的设计允许将激光生成的气雾剂质量分布的中心恰当地放置在流道中，而不需要首先通过屏蔽气体流将气雾剂运输到流道。运载气体G1和屏蔽气体G2然后朝向出口13运走气雾剂，其中它们作为混合气体流G3离开烧蚀单元。
作为运载气体G1，氩气(Ar)是优选的。作为屏蔽气体，优选地选择氦气(He)。Ar有益于阻止通常发生在纯He环境中的气雾剂膨胀。从样本容器添加He具有三个优点：a)该设置以气雾剂注入方向在轴上冲洗气雾剂，这帮助摄取颗粒；b)He气体在样本表面上形成“保护”区域，并确保烧蚀在He环境下进行；c)混合已经在管单元中的Ar和He，不仅避免了分散气体适配器(Ar/He混合球状物)的需要，与仅使用He作为运载气体的常规设置相比，而且增大了流速和气体粘度，从而减小了气雾剂分散。
图4示出使用ANSYSCEX12软件包(德国柏林的ANSYS公司)完成的计算流体动力学模拟的结果。模拟中考虑湍流的剪切应力运输模型。针对以下参数模拟被完成：侧向开口的长度：L＝4.5mm；侧向开口的宽度：1.5mm；底壁部分的最小厚度：w＝50微米；流道的总长度：50mm；圆柱形样本室的直径：23mm；样本23的顶表面24和底壁部分15之间的距离：d＝350微米。入口处的Ar流被设置为2.6m/s(1.1L/min)的恒定速度，而使用1.4m/s(0.6L/min)来模拟He。
图4(a)中示出两种入口气体的混合物分布。两种气体的混合以灰度来指示，白色为混合物的最高程度。侧向开口14处的尖锐界面通过进入Ar流的He流来形成。氦气显著地控制开放区域并与氩气一起形成边界层。由于侧向开口14处的两种气体的最小混合程度，以及指示激光烧蚀的气雾剂容易穿透He而不容易穿透Ar的先前结果，可假定气雾剂不扩散到氩气环境中，因此不达到流道的整个横截面，并保持为非常密集。初始非常尖锐的界面在开口的下游的几毫米内变宽。通过改变入口气体流的组合，边界层的高度并因此烧蚀的气雾剂的高度可被控制。
图4(b)中示出模拟的气体流速分布。侧向开口14上游的Ar入口流表示流道中的典型层流分布(为管中心中的最快流，并朝向管壁逐渐减小)。模拟两种气体的出现显示没有显著的湍流。然而，所计算的雷诺数(～2000)接近从层流到湍流的过渡(2300～4000)。然而，使用湍流模型指示严格层流。因此，可推论由于缺乏湍流，因此应实现激光气雾剂靠近管单元的中心的限定停止距离，所述限定停止距离匹配最高气体速率、低的气雾剂分散。
图5示意性说明完整的LA-ICPMS系统。激光束由激光器40生成。激光烧蚀单元1被安装在X-Y-Z平台5上，以便能够改变样本相对于激光束的位置。激光烧蚀单元1的出口13通过管道61被连接到ICP喷灯6。管道61具有基本上与激光烧蚀单元1的流道11相同的内径，以便确保出口气体G3的层流。ICP喷灯通过RF线圈62的操作生成等离子体源；其以常规方式进行构造。ICP喷灯在本领域中为已知的，并且不要求进一步的说明。ICP喷灯经由ICP源71连接到质量分析器7。质量分析器可为四极质量分析器、飞行时间(TOF)质量分析器、扇形质量分析器等等。
当然，激光烧蚀单元和LA-ICPMS设置的许多修改是可能的，而不不离开本发明的范围。特别地，本发明不限于用于激光烧蚀单元的材料的特定选择、不限于样本室的特定几何结构或尺寸、不限于烧蚀单元中的流道的特定几何结构、长度和直径、不限于烧蚀单元中的侧向开口的特定几何结构和尺寸、不限于特定窗口尺寸或材料、不限于用于烧蚀的激光器的特定类型、不限于被引入到烧蚀单元中的特定气体类型等等。
LA-ICP-MS和大量细胞计数法(masscytometry)
本发明涉及可耦合到电感耦合的等离子体质谱仪(LA-ICP-MS)的激光烧蚀单元，所述等离子体质谱仪在对生物样本成像中具有应用。因此，本发明提供LA-ICP-MS，其包括(i)根据本发明的激光烧蚀单元以及(ii)质量分析器。在一个应用中，样本中的不同目标分子可被标记有不同的标记原子，并且LA-ICP-MS然后跨越所标记的生物样本的多个细胞来使用。通过将所检测的信号与引起那些信号的激光烧蚀单元中激光烧蚀的已知位置联系起来，方法允许所标记的目标分子到样本上的具体位置的定位，并因此构造样本的图像。
LA-ICP-MS涉及使组织样本经受激光脉冲，所述激光脉冲从样本生成烧蚀材料的烟流，并且这些烟流被作为气雾剂传送到ICP-MS仪器以用于分析。样本中的标记原子可由MS区分，并且因此它们的检测揭示烟流中多个目标的存在或缺乏。
以该方式生成的信号的空间分辨率取决于两种主要因素：(i)当信号在被烧蚀的总面积上积分时，激光的光斑尺寸；以及(ii)相对于以其正在生成烟流的速度，以其可分析烟流以便避免来自连续烟流的信号的重叠的速度。
因此，为了分析单独的细胞，应使用不大于这些细胞的激光光斑尺寸，并且更特别地，应使用可烧蚀材料的具有亚细胞分辨率的激光光斑尺寸。该尺寸将取决于样本中的特定细胞，但通常激光光斑将具有小于4μm的直径(例如，在范围0.2-4μm、0.25-3μm或0.4-2μm之内)。因此，激光光斑可具有大约3μm、2μm、1μm或0.5μm的直径。在优选实施例中，激光光斑直径在0.5-1.5μm的范围内，或为大约1μm。可使用缩小的较宽激光束和近场光学器件来实现小的光斑尺寸。1μm的激光光斑直径对应于1μm的激光聚焦点，但由于将激光束传递到样本表面上的目标的数值孔径，激光聚焦点可改变±20％。
为了组织样本的快速分析，需要高频率(例如，10Hz或更大(即，每秒10次烧蚀，产生每秒10次烟流))的烧蚀。在优选实施例中，烧蚀的频率在范围10-200Hz内、在范围15-100Hz内或者在范围20-50Hz内。至少20Hz的烧蚀频率允许在合理的时间中实现典型组织样本的成像。如以上所指出的，在这些频率下，仪器必须能够足够快速地分析烧蚀的材料，以便避免连续烧蚀之间的大量信号重叠。优选地是，源自连续烟流的信号之间的重叠在强度上<10％(更优选地<5％，并且理想地<1％)。烟流的分析所需的时间将取决于烧蚀单元的冲洗时间、烟流气雾剂到达和通过ICP的渡越时间、以及分析电离的材料所花费的时间。
具有长冲洗时间的单元将限制以其可生成图像的速度或者将导致源自连续样本点的信号之间的重叠(例如，参考文献3，其具有超过10秒的信号持续时间)。因此，气雾剂冲洗时间为用于实现高分辨率而不增加总扫描时间的关键限制因素。使用本发明，实现最终的图像中每空间分辨的像素的时间小于100ms是可能的。
通过将烧蚀单元定位在ICP附近以及通过确保足够的气体流用于以适当的速度将气雾剂直接运输到ICP来简单地控制烟流气雾剂到达和通过ICP的渡越时间。使用氩气和氦气的运输提供良好的结果。
分析电离的材料所花费的时间将取决于用于离子的检测的质量分析器的类型。例如，使用法拉第杯的仪器通常对于分析快速信号来说太慢。总的来说，期望的成像速度(并因此烧蚀频率)、分辨率(并因此激光光斑尺寸和烧蚀单元)以及多路复用的程度将指示应使用的质量分析器的一种类型或多种类型(或相反地，质量分析器的选择将决定可实现的速度、分辨率和多路复用)。
例如使用点离子检测器，每次检测在仅一个质荷比(m/Q，在MS中通常被称为m/z)的离子的质谱仪仪器将给出使用多个标记的单个细胞成像中的不良结果。第一，在质荷比之间切换所花费的时间限制以其可确定多个信号的速度，并且第二，如果离子处于低丰度，那么当仪器聚焦于其他质荷比时，信号可被遗漏。因此，尽管其为灵敏的，但是基于四极的检测器不很好地适用于利用多个标记的成像，这是因为，通过设计，不同质荷比的离子顺序地通过并且因此多个标记的数据获取为慢的。类似地，其他注解仪器(诸如ThermoFisherElementXR和Element2)每次仅分析一个m/Q，并且当测量在超过静电场跳跃的范围的范围内的多个m/Q值时，具有关于磁体跳跃的大建立时间。
因此，优选地使用该技术，其提供具有不同m/Q值的离子的大致同时检测。例如，可能使用阵列检测器(例如，参见参考文献4的29章)而不是使用点离子检测器参考文献。可使用多收集器扇形场ICP-MS仪器(例如，ThermoScientificNeptunePlus、NuPlasmaII和NuPlasma1700系统)，并且特别是具有Mattauch-Herzog几何结构的那些仪器(例如，SPECTROMS，其可使用半导体直接电荷检测器在单个测量中同时记录从锂到铀的所有元素)。这些仪器可大致同时测量多个m/Q信号。可通过在检测器中包括电子倍增器来增加它们的灵敏度。然而，阵列扇形仪器不是理想的，因为尽管它们对检测增大的信号有用，但是当信号水平正在减小时，它们不太有用，并且因此它们不很好地适用于其中标记以高度可变的浓度存在的情况中。
用于与本发明一起使用的最优选的MS方法基于飞行时间(TOF)检测，其可准同时地在单个样本中记录多个质量。理论上，由于它们的空间电荷特征，TOF技术并不理想地适用于ICP离子源，但发明人已经示出TOF仪器可足够快速地和足够灵敏地分析ICP离子气雾剂，以允许可行的单细胞成像。然而，TOF质量分析器对于原子分析来说通常是不受欢迎的，这是因为用于处理TOF加速器和飞行管中的空间电荷效应所需的的折衷，本发明的组织成像方法通过检测仅标记的原子可为有效的，并且因此可移除其他原子(例如，具有低于100的原子质量的那些原子)。这导致不那么密集的离子束，其富集于(例如)100-250道尔顿区域中的质量，其可被更有效地操纵和聚集，从而促进TOF检测并利用TOF的高光谱扫描率。因此，可通过使TOF检测与选择样本中不常见的标记原子结合以及例如通过使用较高质量过渡元素理想地使质量高于未标记样本中所看到的质量来实现快速成像。使用标记质量的较窄窗口因此意味着TOF检测将被用于有效的成像。
合适的TOF仪器可购自Tofwerk、GBC科学仪器(例如，Optimass9500ICP-TOFMS)和加拿大富鲁达(例如，CyTOFTM和CyTOFTM2仪器)。这些CyTOFTM仪器具有比Tofwerk和GBC仪器更大的灵敏度，并且由于它们可快速地和灵敏地检测稀土金属的质量范围中的离子(特别在100-200的m/Q范围中)[5]，因此被已知用于大量细胞计数法。因此这些为用于与本发明仪器一起使用的优选仪器，并且它们可用于通过本领域中已知的仪器设置进行成像。它们的质量分析器可以以高频率激光烧蚀的时间标度上的高质谱获取频率准同时地检测大量的标志。它们可测量标记原子的丰度，其中每个细胞的检测极限为约100，从而允许组织样本的图像的灵敏构造。由于这些特征，大量细胞计数法可现在用于满足以亚细胞分辨率的组织成像的灵敏度和多路复用需要。先前，大量细胞计数法仅被用于分析悬浮液中的细胞，并且关于组织或肿瘤微环境内的细胞-细胞交互的信息已经因此丢失。通过使大量细胞计数法仪器与高分辨率激光烧蚀系统和快速渡越低分散烧蚀腔室组合，可能允许通过实际时间标度上的高多路复用来构造组织样本的图像。可在参考文献6中找到关于大量细胞计数法的进一步细节。
用于样本的烧蚀的激光器的波长和功率的选择可遵循通过ICP-MS的细胞分析中的正常使用。激光必须具有足够的能量密度(fluence)，以导致烧蚀到达所需的深度，而基本上不烧蚀支撑样本保持器。以20Hz的在2-5J/cm2之间的激光能量密度(例如，从3-4J/cm2或大约3.5J/cm2)通常为合适的。理想地，单个激光脉冲将足以烧蚀细胞材料以用于分析，使得激光脉冲频率匹配通过其生成烧蚀烟流的频率。激光器将通常为准分子激光器或复合受激态激光器。可使用氟化氩激光器(λ＝193nm)获得合适的结果。使用25μm的孔径，可通过25倍的缩小将该激光成像到组织样本上，以便产生具有1μm直径的光斑尺寸。这些激光器的10-15nm的脉冲持续时间可实现充分的烧蚀。还可使用飞秒激光器(即，脉冲持续时间<1ps)，并且由于传送到样本中的热量减少，所述飞秒激光器将是有益的，但它们非常昂贵且可在没有它们的情况下实现良好的成像结果。
总的来说，结合MS检测器的响应特征来选择激光脉冲频率和强度，以便允许区别单独的激光烧蚀烟流。结合使用小的激光光斑以及具有短冲洗时间的烧蚀单元，快速和高分辨率成像现在是可行的。
构造图像
LA-ICP-MS可为烟流中的多个标记原子提供信号。通过本发明的激光烧蚀单元产生的烟流中的标记的检测揭示其同源目标在烧蚀位置处的存在。通过在样本的表面上的已知空间位置处生成一系列烟流，MS信号揭示样本上标记的位置，并且因此信号可用于构造样本的成像。通过用可区别的标记来标记多个目标，可能使标记原子的位置与同源目标的位置相关联，以便构建复杂图像，从而达到远超过使用现在技术可实现的那些的多路复用水平。发明人已经示出所生成的图像可重现染色模式以及表示如通过IFM确定的给定标志的细胞的比例，从而确认本发明适合用于成像。
理想地，将通过在组织样本上执行激光的光栅扫描来构造图像。光栅扫描中连续烧蚀的间距(步长)以及光栅扫描中相邻线之间的间距理想地与所使用的激光光斑尺寸相同(例如，对于1μm激光光斑，间距为1μm)，以便实现感兴趣的区域的完整覆盖。然而，在一些实施例中，方法可使用小于激光光斑尺寸的步长(例如，至少2倍、4倍或5倍更小)，因为这可导致更小的烧蚀面积并因此提高成像分辨率。为了实现扫描，可能移动激光器，但通常移动烧蚀单元(或单元的内含物)是更方便的。移动速度将取决于烧蚀频率和光栅间距，例如，在1μm光栅间距和20Hz烧蚀的情况下，烧蚀单元将具有20μm/s的平移速度。可实现1μm或更小的步长的支撑平台是可用的(例如，具有500nm或200nm步长(或甚至更小))。
通常，基于烧蚀的表面层的内含物生成样本的二维(2D)图像。可通过组合来自在z轴中相邻的单个样本的切片的大量的2D图像的堆叠(在x、y平面中)来制备组织的3D图像。然而，作为以该方式组合2D图像的可选方案，可执行直接3D成像。这可以以各种方式来实现。例如，如果烧蚀导致具有基本上恒定深度的气化，那么在单个x、y点处的重复烧蚀揭示z轴中的逐渐加深的信息。如果烧蚀不具有基本上恒定的深度，那么可测量烧蚀材料的体积(例如，相对于已知体积标准)，并且该体积可被容易地转化为z轴深度。在执行3D成像的情况下，可能执行多个z轴烧蚀，同时维持x、y位置(“钻孔”)，或者逐层烧蚀样本(即，在移动到更深的z轴层之前执行x、y区域的烧蚀)。逐层烧蚀为优选的。3D成像的准确性由诸如烧蚀材料的再沉积、维持恒定烧蚀深度的能力以及标记刺入样本中的能力的因素限制，但仍可在这些限制的范围内实现有用的结果。
将信号组合为图像将使用计算机，并且可使用已知的技术和软件包来实现。例如，可使用来自Kylebank软件的GRAPHIS包，但还可使用诸如TERAPLOT的其他包。使用来自诸如MALDI-MSI的技术的MS数据的成像在本领域中是已知的，例如，参考文献7公开了用于在Matlab平台上查看和分析MS成像文件的“MSiReader”界面，并且参考文献8公开了两种软件仪器(例如，“DatacubeExplorer”程序)，其用于全空间和光谱分辨率中2DMSI数据集和3DMSI数据集两者的快速数据探索和可视化。
可以进一步分析(例如以分析IHC结果的相同的方式)使用本发明获得的图像。例如，图像可用于描绘样本内的细胞亚群体，并且可提供对临床诊断有用的信息。类似地，SPADE分析可用于从本文明提供的高维细胞计数法数据提取细胞层次结构[9]。
组织样本的标记
可从已经被标记有单个标记原子或多个不同标记原子的样本获得图像，其中通过ICP-MS检测在激光烧蚀的烟流中的标记原子。对多个不同原子的参考意味着多于一个的原子种类用于标记样本。可使用ICP-MS区分这些原子种类(例如，它们具有不同的m/Q比)，使得烟流内两种不同标记原子的存在产生两种不同的MS信号。
本发明可用于比两种不同的标记原子多得多的同时检测，从而允许多重标记检测(例如，至少3种、4种、5种、10种、20种、30种、32种、40种、50种或甚至100种不同的标记原子)。标记原子还可以以组合方式来使用，以便甚至进一步增加可区分标记的数目。示例论证成像方法中32种不同标记原子的使用，但LA-ICP-MS本质地适用于较高数目的不同原子的并行检测(例如，甚至超过100种不同原子种类[5])。通过以不同的标记原子来标记不同的目标，在单个图像中确定多个目标的细胞位置是可能的(例如，参见参考文献10)。
可与本发明一起使用的标记原子包括任何种类，其通过LA-ICP-MS是可检测的并且基本上不存在于未标记的组织样本中。因此，例如，12C原子将不适于用作标记原子，因为它们是自然界大量存在的，而11C原子在理论上可以使用，因为其为不自然发生自然存在的人造同位素。然而，在优选实施例中，标记原子为过渡金属，诸如稀土金属(15号镧系元素，加上钪和钇)。这些17种元素提供可容易地被ICP-MS区分的许多不同的同位素。可获得以浓缩同位素的形式的很多种的这些元素以浓缩同位素的形式可获得，例如，钐具有6种稳定同位素，并且钕具有7中稳定同位素，其全部可以浓缩方式可获得。15号镧系元素提供具有非冗余唯一质量的至少37种同位素。适于用作标记原子的元素的示例包括镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钷(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镥(Lu)、钪(Sc)和钇(Y)。除了稀土金属之外，其他金属原子(例如，金(Au)、铂(Pt)、铱(Ir)、铹(Rh)、铋(Bi)等等)适用于通过ICP-MS进行检测。放射性同位素的使用不是优选的，因为它们不便于处理且不稳定，例如，在镧系元素当中，Pm不是优选的标记原子。
为了促进TOF分析(参见以上)，使用具有在范围80-250内(例如，在范围80-210内或在范围100-200内)的原子质量的标记原子是有用的。该范围包括全部的镧系元素，但排除Sc和Y。100-200的范围通过使用不同的标记原子允许理论上的101-丛(plex)分析，同时允许本发明利用TOFMS的高光谱扫描率。如以上所提及的，通过选择其质量位于高于未标记样本中所看到的那些的窗口中的标记原子(例如，在100-200的范围内)，TOF检测可用于提供生物学显著水平的快速成像。
标记组织样本通常要求标记原子附接到特定结合对(sbp)的一个成员。该标记的sbp与组织样本接触，使得其可与sbp的另一个成员(目标sbp成员)交互(如果其存在)，从而将标记原子定位到样本中的特定位置。将标记递送到目标分子的sbp在本文也被称作特定标记构建体。可检测标记原子在该特定位置处的存在，并且该信息被转化为其中目标sbp成员存在于该位置处的图像。可通过已知技术将稀土金属和其他标记原子结合到sbp成员，例如，参考文献11描述镧系元素原子到用于ICP-MS检测的寡核苷酸探针的附接，参考文献12描述使用钌以用于标记寡核苷酸，并且加拿大富鲁达公司出售MaxParTM金属标记试剂盒，其可用于将超过30种不同的标记原子结合到蛋白质(包括抗体)。
各种数目的标记原子可附接到单个sbp成员，并且当更多标记原子附接到任何sbp成员时，可实现更大的灵敏度。例如，大于10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个标记原子可附接到sbp成员。例如，可使用包含多个单体单元的单分散性聚合物，每个包含诸如DTPA的螯合剂。例如，DTPA结合具有解离常数为大约10-6M的3+镧系元素离子。这些聚合物可在巯基反应性基团(例如，马来酰亚胺)中终止，所述巯基反应性基团可用于附接到sbp成员。例如，巯基反应性基团可结合到抗体的Fc区域。其他功能性基团(例如，诸如N-羟基琥珀酰亚胺酯的胺反应性基团，或者针对羧基或针对抗体的糖基化具有反应性的基团)还可用于这些聚合物的结合。任何数目的聚合物可结合到每个sbp成员。可使用的聚合物的特定示例包括直链(“X8”)聚合物或第三代树枝状(“DN3”)聚合物，这两者都可用作MaxParTM试剂。金属纳米颗粒的使用还可用于增加标记中原子的数目。
如以上所提及的，标记原子附接到sbp成员，并且该标记的sbp成员与组织样本接触，其中其可发现目标sbp成员(如果存在的话)，从而形成标记的sbp。标记的sbp成员可包括任何化学结构，其适用于附接到标记原子并然后使用本发明用于成像。
一般来说，本发明可与任何sbp一起使用，所述任何sbp被已经已知用于确定组织样本中目标分子的位置(例如，如用于IHC中或荧光原位杂交FISH中)，但与样本接触的sbp成员将携带通过ICP-MS可检测的标记原子。因此可容易地通过使用可用的IHC和FISH试剂、仅仅通过修改标记来实施本发明，所述标记先前已经用于例如修改FISH探针以便携带可被激光烧蚀和被ICP-MS检测的标记。
Sbp可包括以下项中的任一项：核酸双链体；抗体/抗原复合物；受体/配体对；或适体/目标对。因此，标记原子可附接到核酸探针，其然后与组织样本接触使得探针可在其中与互补核酸杂交(例如，以便形成DNA/DNA双链体、DNA/RNA双链体或RNA/RNA双链体)。类似地，标记原子可附接到抗体，其然后与组织样本接触，使得其可结合到其抗原。标记原子可附接到配体，其然后与组织样本接触，使得其可结合到其受体。标记原子可附接到适体配体，其然后与组织样本接触，使得其可结合到其目标。因此，标记的sbp成员可用于检测样本中的多种目标(包括DNA序列、RNA序列、蛋白质、糖、脂质或代谢物)。
在本发明的典型使用中，标记的sbp成员为抗体。可以通过将结合分子的一个或多个标记原子结合到抗体来实现抗体的标记(例如，使用如以上所描述的MaxParTM结合试剂盒)。识别对成像有用的细胞蛋白质的抗体已经广泛地可用于IHC用途，并且通过使用标记原子而不是当前标记技术(例如，荧光)，这些已知的抗体可容易地适用于本发明，但具有增加的多重能力的益处。与本发明一起使用的抗体可识别细胞表面上的目标或细胞内的目标。抗体可识别多种目标，例如，它们可特别地识别单独的蛋白质，或者可识别共享共同表位的多个相关蛋白质，或者可识别蛋白质上的特定翻译后修改(例如，以便在感兴趣的蛋白质上的酪氨酸和磷酸-酪氨酸之间进行区分、以便在赖氨酸和乙酰基-赖氨酸之间进行区分、以便检测泛素化等等)。在结合到其目标之后，结合到抗体的标记原子可被检测以揭示样本中该目标的位置。
标记的sbp成员将通常直接与样本中的目标sbp成员交互。然而，在一些实施例中，标记的sbp成员与目标sbp成员间接地交互是可能的，例如，在夹心分析法模式中，第一抗体可结合到目标sbp成员，并且标记的第二抗体可然后结合到第一抗体。然而，通常依赖于直接交互，因为所述直接交互可更容易地实现并允许较高的多路复用。然而，在两种情况下，样本与可结合到样本中的目标sbp成员的sbp成员接触，并且在稍后阶段，检测附接到目标sbp成员的标记。
本发明的一个特征是其检测样本中多个(例如，10个或多于10个，并且甚至达到100个或多于100个)不同目标sbp成员的能力(例如，以便检测多个不同的蛋白质和/或多个不同的核酸序列)。为了允许这些目标sbp成员的差异检测，它们各自的sbp成员应携带不同的标记原子，使得它们的信号可由ICP-MS区分。例如，在检测十种不同蛋白质的情况下，可使用十种不同的抗体(每个特定于不同的目标蛋白质)，其每个携带唯一的标记，使得可区分来自不同抗体的信号。在一些实施例中，期望的是针对单个目标使用多个不同的抗体(例如，所述多个不同的抗体识别相同蛋白质上的不同表位)。因此，由于该类型的冗余性，方法可使用多于目标的抗体。然而，通常，本发明将使用多个不同的标记原子以检测多个不同的目标。
如果使用了多于一个标记抗体，那么优选的是，抗体应具有针对它们各自抗原的类似亲和性，因为这帮助确保通过LA-ICP-MS检测的标记原子的数量和组织样本中目标抗原的丰度之间的关系将在全部不同sbp内更加一致(特别在高扫描频率下)。
如果目标sbp成员位于细胞内，则通常有必要在样本与标记接触之前或期间渗透细胞膜。例如，当目标为DNA序列但标记的sbp成员不能渗透活细胞的膜时，可固定和渗透组织样本的细胞。标记的sbp成员可然后进入细胞并与目标sbp成员形成sbp。在这方面，可利用用于与IHC和FISH一起使用的已知协议。
通常，本发明的方法将检测至少一个细胞内目标和至少一个细胞表面目标。然而，在一些实施例中，本发明可用于检测多个细胞表面目标同时忽略细胞内目标。总的来说，由于本发明将提供样本中所选择目标的位置的图像，因此目标的选择将通过从方法所需的信息来确定。
生物样本
本发明提供对生物样本进行成像的方法。在一些实例中，该样本是组织样本。组织样本包括多个交互细胞，并且方法使多个这些细胞经受激光烧蚀，以便提供组织样本中这些细胞的图像。通常，本发明可用于分析目前通过IHC技术研究但是使用了适用于通过LA-ICP-MS进行检测的标记的组织样本。
使用本文描述的LA-ICP-MS系统的激光烧蚀单元、离子源、装置来分析任何合适的组织样本。例如，组织可以是上皮组织、肌肉组织、神经组织等等以及它们的组合。出于诊断或预测目的，组织可来自肿瘤。在一些实施例中，样本可来自已知的组织，但样本是否包含肿瘤细胞可为未知的。成像可揭示指示肿瘤的存在的目标的存在，因此促进诊断。组织样本可包括乳腺癌组织(例如，人类乳腺癌组织或人类乳腺上皮组织(HMLE))。组织样本可包括福尔马林固定的、石蜡包埋(FFPE)组织。可从任何活的多细胞有机体(但将通常是人类)获得组织。
组织样本将通常为切片(例如，具有在2-10μm范围内(诸如在4-6μm之间)的厚度)。用于制备该类切片的技术(例如，使用切片机，包括脱水步骤、包括包埋等等)在IHC的领域是所众所周知的。因此，组织可为化学上固定的并且然后可在所需平面中制备切片。冷冻切片或激光捕获显微切割还可用于制备组织样本。样本可被渗透(例如，以便允许用于细胞内目标的标记的试剂(参见以上内容))。
尽管最大尺寸将由激光烧蚀装置指定，并且特别地由可适合其烧蚀单元的样本的尺寸指定，但是将被分析的组织样本的尺寸将类似于当前IHC方法。多达5mmx5mm的尺寸为典型的，但更小的样本(例如，1mmx1mm)也是有用的(这些维度指的是切片的尺寸，不是其厚度)。
除了对组织样本进行成像是有用的之外，本发明可反而用于细胞样本(诸如单层的粘附细胞或单层固定化在固体表面上的细胞(如在传统免疫细胞化学中))的成像。这些实施例特别地对分析粘附细胞是有用的，所述粘附细胞不可被容易地溶解用于细胞悬浮液大量细胞计数法。因此，和对增强当前免疫组织化学分析有用一样，本发明可用于增强免疫细胞化学。本发明还可用于对生物膜进行成像。生物膜的分析在医疗环境中是重要的，因为感染性试剂的生物膜可在身体中的粘膜上或例如在留置导管上形成。
根据本发明，在被制备之后，样本将被放置在激光烧蚀单元中，并且然后经受分析。
示例
A.实验的
激光烧蚀单元的制造
单元顶部10由矩形长方体的丙烯酸玻璃(聚(甲基丙烯酸甲酯)，PMMA)制成。3mm内径的纵向孔沿长轴钻穿长方体，从而形成流道11。在单元顶部10的顶壁部分17中，具有长度L＝4.5mm和1.5mm宽度的横向的、稍微椭圆形形状的孔形成并由UV透明石英窗口16封闭。具有与顶侧上的孔类似维度的侧向开口14在单元顶部10的底壁部分15中形成。底壁部分15然后被加工用于将流道11的区域中底壁部分的最小厚度w减小到约50微米。流道11的总长度为大约50mm。
单元底部10由另一个PMMA长方体制成。具有约23mm直径的圆柱形样本室21被研磨为长方体。径向延伸孔被钻入单元底部以形成屏蔽气体入口22。屏蔽气体入口相对于流道11以10°角度延伸。样本23被放置在样本室21中。单元底部20在四个螺丝钉的帮助下被安装到单元顶部10(附图中未示出)。不要求垫片或密封件，但垫片或密封件可以可选地被提供以更好地密封单元顶部10和单元底部20之间的接触区域。样本23的顶表面24面向侧向开口14。样本23的顶表面24和底壁部分15之间的距离d为大约350微米。因此，样本表面24和流道11的中心轴之间的总距离为约1.9毫米(流道的半径＝1.50mm，壁厚度w＝0.05mm，距离d＝0.35mm)。
关于管单元性能、优化和特征描述的实验设置
具有均匀激光束轮廓的ArF准分子激光器系统(德国哥廷根LambdaPhysik)耦合到安捷伦7500csICP-四极-MS仪器(德国瓦尔德布隆的安捷伦科技的ICP-Q-MS)。激光能量密度为17.3J/cm2。为了提高置信水平，通过10μm的激光光斑尺寸和相邻射出之间的15μm的间距，从3×3单射出矩阵扫描(除非另外说明)获得所有的数据点。到ICP喷灯的连接管由连接到混合气体出口13的3mm内直径内径PTFE(聚四氟乙烯)管道组成。类似的管被用作到Ar入口12的供给管。Ar运载气体流被调节为1.1L/min。50cm长连接管直接连接到ICP喷灯，而不改变直径。被提供通过样本室的He屏蔽气体流被调节为0.6L/min。使用10ms的停留时间来实施管单元性能测量。为了描述单元的冲洗，在NIST610参考玻璃上在1Hz、10Hz和30Hz激光烧蚀期间执行单一同位素27Al获取。ICP在1470W下操作并且四极MS在峰值跳跃模式中被设置为每峰值1点。
执行各种操作参数的优化，操作参数包括：运载管开口和样本表面之间的间隙距离；Ar运载气体流率；以及He屏蔽气体利率。当优化一个参数时，基于初步优化将其他两个参数设置为“预优化”条件，例如，间隙距离为350μm、Ar流为1.1L/min、He流为0.6L/min。基于归一化峰宽来评估数据，归一化峰宽为峰宽除以在每个峰值(峰面积)内收集的总数。对于每个峰值，1％最大值(FW0.01M)处的全宽用于确定峰宽。在1％最大位置不与任何数据点相一致的情况下，应用最靠近的两个点的线性内插。对于峰面积，由于峰拖尾导致小于1％的总数，因此峰宽内的所有数据点被积分并且不要求内插。
使用与如上所述相同的参数来实施用于常规分析的细胞的特征描述。然而，在不同的轮次中记录从低、中等到高m/Q的多个同位素。对峰面积灵敏度进行丰度校正。
用于“硬”物质的成像的样本制备
通过激光引起的正向传递方法产生用于论证成像能力的样本。对于供体基底的制备，高质量熔融硅玻璃被涂覆有UV吸收三氮烯聚合物(TP)层，作为其上沉积不同薄膜材料的牺牲动态释放层(DRL)。在传递过程中，308nmXeCl准分子激光束被成像在‘ETH’(或‘PSI’)中空掩模上并且在冲击在供体基底的背侧之前被4倍缩小。TR-DRL被烧蚀并且生成的冲击波朝向玻璃接收器基底推进薄膜，所述玻璃接收器基底涂覆有PEDOT:PSS(与聚(苯乙烯磺酸)混合的聚(3,4-乙烯二氧噻吩))。通过底部上的60nm厚Au‘ETH’薄层以及顶部上的80nmAg‘PSI’(Au/Ag)来制备样本。为了通过扫描电子显微镜(SEM)控制两个标识的沉积，5nmPt薄膜在模式沉积之后被均匀地涂覆在接收器基底上。
组织样本制备
将富含乳腺癌组织的福尔马林固定石蜡包埋的人类表皮生长因子受体2(HER2)切成6μm的切片。样本在CC1m表位恢复条件下在发现XT平台(Ventana医疗系统)上被处理。然后，通过磷酸缓冲盐水(PBS)/1％牛血清白蛋白(BSA)/0.1％TritonX封闭样本30分钟，并用200μL165Ho(以5ug/mL)标记的抗HER2培养50分钟。样本在PBS/0.1TritonX中洗涤三次并在室温下干燥。对于与165Ho结合的抗体，采用商业MAXPAR抗体标记试剂盒(DVS科学)。
用于“硬”物质的成像的仪器和操作条件
如被描述用于管单元特征描述的类似构造被用于实验。852×408μm2的面积由10Hz重复率行扫描覆盖。基于4μm激光凹坑，连续激光射出之间的距离以及行扫描之间的侧向距离两者都为4μm。实际激光束尺寸为1～2μm。然而，观察到较大的受影响面积，其可通过放大的热渗透量(金属薄膜中的高的热扩散，以及ns的光-材料交互时间)来解释。三种同位素(107Ag、195Pt和197Au)在峰值跳跃模式中测量，其中每种同位素具有600μs停留时间。然而，由于每种同位素的几毫秒的仪器四极建立时间，整组同位素的读数不可在小于10ms的时间中完成。明显地，该大的开销部分(低占空比)确实限制在快速、高分辨率成像实验期间可获得的信号质量。数据分析基于每个单射出信号的积分(梯形积分方案)。
用于组织成像的仪器和操作条件
组织成像在～1μm空间分辨率下在耦合到ArF准分子激光器的Element2(ThermoFisher科技)上进行。操作条件被优化用于快速瞬态信号的最大灵敏度。因此，仅记录165Ho。对于图像分析，在20Hz的激光频率下以及1×1μm2的图像像素尺寸下逐行扫描样本。根据所应用的激光烧蚀率，MS的停留时间被设置为50ms。
B.结果和讨论
管单元优化
图6(a)中描绘了管单元底部和样本表面之间的间隙上的分散的依赖性。所绘制的峰宽被归一化为在FW0.01M中收集的总数。观察到在～350μm的间隙宽度处的最小峰宽。使用该优化的间隙距离，执行Ar气体流率优化和He气体流率优化。基于归一化的峰宽在图6(b)和图6(c)中示出了相应结果。所有三个优化为归一化的峰宽产生明显的～10-3ms/计数的最小值。使用样本间隙和气体流率的优化值进行以下部分中记录的所有测量结果。根据不同的设置，该类优化值可变化。
管单元的实验评估
使用～1Hz的激光频率来表征管单元。图7(a)中总结了典型瞬态信号(以对数标度示出)。对FW0.01M来说，主要元素的单冲洗信号持续大约30ms。瞬态峰值仍具有稍微不对称形状的稍微拖尾，其由气雾剂的延时的冲洗造成。在峰值最大值之后，信号在20ms内下降超过2个数量级，其表示超过99.98％的总积分信号。总信号的剩余部分(0.02％的积分信号面积)在峰值的拖尾中被找到，其在40-50ms之后到达背景。第二信号衰减的斜率不同于快速冲洗的斜率，从而指示不同的过程，这被怀疑与从表面对再沉积材料的摄取相关。这最可能是由于He屏蔽气体流入管单元底部开口，其平行于最有效地冲洗凹坑周围的区域的激光烟流注入。通过1s空白间隔单射出指示未发生进一步的样本移除。
图7(b)示出在10Hz激光频率下所获得的瞬态信号。峰宽和形状类似于在1Hz下所测量的那些信号。图7(c)中示出使用30Hz行扫描的激光频率的进一步增大。峰的宽度和形状类似于在1Hz和10Hz下测量的信号。信号结构指示两个相邻峰不可被彼此分离到背景。然而，两个连续峰之间的重叠在强度上小于1％。因此，可推论即使30Hz也将允许将与两个数量级一样大的浓度差进行成像，这使得该烧蚀单元对于激光烧蚀成像非常具有吸引力。整个评估论证冲洗被显著地提高到30-50ms的时间范围中。关于广泛的同位素范围的管单元特征描述
图8中记载了管单元性能的进一步特征描述。针对从低m/Q(7Li)直到高m/Q(238U)的不同同位素示出从峰面积计算的峰宽和灵敏度。如从图8(a)中看出，所有同位素测量结果的平均峰宽落入30-35ms的狭窄范围中。基于FW0.01A计算所记录的信号持续时间。整个m/Q范围内的标准偏差最可能是由于气体流动力学中的差异引起的烧蚀质量、魂蝶效应和波动的结果。图8(b)进一步示出峰面积的归一化灵敏度，其在单射出烧蚀模式中使用10μm凹坑来确定。相比在单射出模式中通常使用的烧蚀单元设置，峰面积灵敏度提高了10倍。这与提高的样本运输效率或改善的电离无关，并且仅仅基于从烧蚀位置到ICP的所保留的样本密度。
通过顺序Q-MS的快速成像
通过各种成像技术研究了“硬”样本。图9中示出了结果。通过光学显微镜(图9(a))和扫描电子显微镜(SEM，图9(b))首先对模式的特征细节进行成像。这些图像用于针对197Au(图9(c))和107Ag(图9(d))评估高灵敏度、高空间分辨率LA-ICPMS的质量。光学和SEM图像指示薄膜模式在均匀性、形状和几何结构方面不是完美的。然而，样本被认为很好地适用于由LA-ICPMS进行分析。LA-ICPMS产生具有尖锐模式边界的高度一致的图像。从薄膜到背景(或向后)的快速信号变化被认为是大约1μm的高空间分辨率的指示符。抓痕(scratch)在从一个实验室到另一个实验室的样本运输期间被引入到‘T’的左臂，并且甚至这个在图9(c)中由LA-ICPMS对其进行了成像，并且其与图9(a)中被认为控制图片的光学显微图像一致。
通过同步Mattauch-Herzog质谱仪的快速成像
标准四极质谱仪的严格限制为它们的顺序m/Q分析方案。从低分散管单元得到的短信号脉冲持续时间限制多个同位素的记录，除非准-或同步质谱仪耦合到LA-ICP。该类先进MS的示例包括Mattauch-HerzogMS(MH-MS)和飞行时间-MS(TOF-MS)。为了说明MH-MS仪器的多元素成像能力，耦合如被描述用于四极ICPMS的相同LA-ICP系统。通过该系统获得的图像具有关于四极MS的类似的质量和分辨率。这里应提及的是，LA-ICP-TOF-MS耦合将同样地适用于该类快速化学成像应用。
组织成像
在目前公开的元素成像LA-ICPMS系统的许多可能应用当中，决定通过研究生物组织薄切片中的生物标志分布来论证其潜能。第一，该类分析要求低μm分辨率，以便分辨最小生物单元(细胞)的形态并在最小生物单元(细胞)内定位生物标志。该信息在生物过程的研究中以及对于全面的诊断目的是至关紧要的。第二，该类分析要求每像素短的测量时间，如使用目前公开的烧蚀单元是可行的；在生物和生物化学分析中，通常大量的样本和大组织面积(500×500μm2)需要被分析用于统计目的。因此，乳腺癌组织切片被分析用于研究图6中示出的单独细胞的人类表皮生长因子受体2(HER2)状态。图像示出在细胞膜上高度表达的HER2蛋白质。HER2是初始乳腺癌诊断之后的无复发存活时间、转移时间和总存活时间的主要决定因素。在分析中，实现～1μm的空间分辨率。该类高空间分辨率和化学灵敏度允许乳腺癌组织中的高度精确的HER2确定。用于乳腺癌分析的重要生物标志的该亚细胞分辨率可适用于在它们的各种治疗选择中引导病理学家。
将理解的是，以上仅通过示例的方式描述了本发明，并且可作出修改，同时保持在本发明的范围和精神之内。
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Claims (16)

1.一种用于对样本材料进行激光烧蚀的烧蚀单元(1)，所述烧蚀单元包括：
流道(11)，其具有用于将运载气体(G1)供给到所述流道(11)的入口(12)并具有出口(13)；
侧向开口(14)，其在所述流道(11)的第一壁部分(15)中；
侧向窗口(16)，其被布置在所述流道的第二壁部分(17)中，与所述侧向开口(14)相对；以及
样本室(21)，其邻近所述侧向开口(14)，所述样本室被配置为以如下方式接收样本(23)：使激光束(41)能够通过所述侧向窗口(16)和所述侧向开口(14)进入所述样本室(21)并能够撞击在所述样本(23)的表面(24)上，所述样本室(21)具有用于将屏蔽气体(G2)供给到所述样本室的入口(22)。
2.根据权利要求1所述的烧蚀单元，其中所述流道具有横截面积，所述横截面积基本上为不变的或者仅微弱地变化以至于横截面中的任何变化不显著地扰乱通过所述流道的层流。
3.根据权利要求1或2所述的烧蚀单元，其中所述流道的所述入口(12)和所述出口(13)被取向以包括在160℃和200℃之间的角度。
4.根据前述权利要求中任一项所述的烧蚀单元，其中所述流道(11)和所述样本室(21)由分离壁分离，所述分离壁形成所述流道(11)的第一壁部分(15)，所述分离壁具有最小厚度(w)，所述最小厚度(w)小于500微米，优选地小于200微米。
5.根据前述权利要求中任一项所述的烧蚀单元，其中所述侧向开口(14)的横截面积不超过所述流道(11)的横截面积的五倍。
6.根据前述权利要求中任一项所述的烧蚀单元，其中所述烧蚀单元包括容纳所述流道(11)的单元顶部(10)以及形成所述样本室(21)的单元底部(20)，所述单元底部(20)可从所述单元顶部(10)移除以用于更换所述样本(23)。
7.一种烧蚀装置，包括：
根据前述权利要求中的任一项所述的烧蚀单元(1)；
激光器(4)，其用于通过所述侧向窗口(16)和所述侧向开口(14)将激光束(41)射出到所述样本(23)；以及
定位设备(5)，其用于改变所述样本(23)和所述激光束(41)之间的相对位置。
8.一种ICP离子源，包括：
根据权利要求1-6中任一项所述的烧蚀单元(1)；
ICP喷灯(6)；以及
管道(61)，其将所述烧蚀单元连接到所述ICP喷灯(6)，所述管道(61)的横截面积基本上与所述烧蚀单元(1)的所述流道(11)的横截面积相同或者相对于所述烧蚀单元(1)的所述流道(11)的横截面积仅微弱改变，横截面中的任何改变不显著地扰乱通过所述流道和所述管道的层流。
9.一种用于操作根据权利要求1-6中任一项所述的烧蚀单元(1)的方法，所述方法包括，不必按以下的给定顺序：
将样本(23)放置在所述样本室(21)中，使得所述样本的表面(24)面向所述侧向开口(14)；
将运载气体(G1)供给到所述流道(11)的所述入口(12)；
将屏蔽气体(G2)供给到所述样本室(21)的所述入口(22)；以及
通过将脉冲激光束(41)照射通过所述侧向窗口(16)和所述侧向开口(14)并照射到所述表面(24)上来从所述表面(24)烧蚀材料。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述脉冲激光束(41)的每个脉冲导致准瞬时的激光生成的气雾剂质量分布(25)，并且其中所述样本(23)被定位在离所述流道(11)的一定距离处，使得所述激光生成的质量分布(25)的中心在所述侧向开口(14)和所述侧向窗口(16)之间的所述流道(11)内。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述样本(23)被以如下方式定位，所述样本(23)的表面(24)距所述流道(11)的中心的距离在0.5毫米到4.5毫米的范围中。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中所述运载气体(G1)具有第一粘度，并且其中所述屏蔽气体(G2)具有低于所述第一粘度的第二粘度。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的方法，其中所述主要运载气体(G1)是氩气，并且所述第二运载气体(G2)是包括至少50％氦气的气体。
14.根据权利要求9-13中任一项所述的方法，
其中所述主要气体(G1)被以第一体积流率供给到所述流道(11)的所述入口(12)，
其中所述第二气体(G2)被以第二体积流率供给到所述样本室(21)的所述入口(22)，以及
其中所述第二体积流率是所述第一体积流率的0.3到1.0倍。
15.根据权利要求9-14中任一项所述的方法，包括：
在所述表面(24)上扫描所述激光束(41)；以及
分析所产生的气雾剂，以获得所述表面(24)的化学图像。
16.根据权利要求9-15中任一项所述的方法，其中所述样本(23)是生物样本，特别地，是人类或动物组织的组织样本、单层固定化细胞或生物膜。
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