CN105301234A - 一种克仑特罗免疫磁珠分离富集试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种克仑特罗免疫磁珠分离富集试剂盒。包括偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠、复溶液和磁铁，偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠是由克仑特罗单克隆抗体与磁珠的质量比为1：500-1000混合并溶于2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物中偶联制备而成，克仑特罗单克隆抗体是由克仑特罗半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得，克仑特罗半抗原是由克仑特罗与对羟基苯丙酸经重氮化反应，在氨基上引入待羧基间隔臂，得到克仑特罗半抗原。本发明还涉及一种采用所述的克仑特罗免疫磁珠分离富集试剂盒分离克仑特罗的样品前处理方法，本方法对克仑特罗具有较高的特异性、回收率和准确度，简化样品前处理步骤，避免样品前处理过程中使用多种和大量的有机溶剂。

Description

一种克仑特罗免疫磁珠分离富集试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种克仑特罗免疫磁珠试剂盒及其对样品中克仑特罗的分离富集方法。属于免疫学领域。

背景技术

克仑特罗(Clenbuterol)，异名克喘素、氨哮素，俗名“瘦肉精”，化学名为α[(叔丁胺基)甲基]-4-氨基-3,5-二氯苯甲醇盐酸盐。克仑特罗是一种β-兴奋剂，20世纪80年代初，美国一家公司开始将其添加到饲料中，增加瘦肉率。猪食用后能提高生长速度，在代谢过程中促进蛋白质合成，加速脂肪的转化和分解，提高了猪肉的瘦肉率，因此成为瘦肉精；它还使猪毛颜色红润光亮，收腹，卖相好；屠宰后，肉色鲜红，脂肪层极薄，往往是皮贴着瘦肉，瘦肉丰满。但是肥猪饲喂瘦肉精后，会产生四肢震颤无力、心肌肥大、心力衰竭等毒副作用[2]。人如果摄入量过大或无病摄入该药，就可能出现副作用或中毒事故，表现为：肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、肌肉痛、目眩、恶心、呕吐、发烧、战栗。我国和其他许多国家现已禁止在饲料中添加使用克仑特罗，农业部第235号公告中规定克仑特罗及其盐、酯类化合物在所有食品动物和所有可食组织中不得检出，农业部第176号公告中规定克仑特罗禁止在饲料和动物饮用水中使用。

克仑特罗残留量常用的仪器分析检测高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)等。由于上述检测方法的样品前处理均需要使用净化装置，包括C18柱、石墨化碳固相萃取柱、弗罗里硅土固相萃取柱、硅胶SPE固相萃取柱等。上述固相萃取柱价格昂贵，约为500-2000元/支，且净化步骤繁琐，需要多种有机溶剂。克仑特罗免疫磁珠分离技术由于内含Fe₃O₄的纳米磁珠的表面修饰官能团可与克仑特罗特异性单克隆抗体结合构成克仑特罗免疫磁珠，通过外加磁场利用抗体的特异性免疫反应从混合溶液中富集和分离克仑特罗，克仑特罗免疫磁珠的净化载体为分散状，可提高特异性单克隆抗体与检测靶物质的结合概率，从而提高样品中克仑特罗的回收率，增加了克仑特罗检测方法的准确度。免疫磁珠的磁珠与抗体之间的结合键为化学结合键，结合程度较为牢固；免疫亲和柱是利用抗原和抗体的特异性结合性质的特殊的SPE小柱。抗体与载体存在的共价键为疏水作用力及离子交换作用力等物理结合力，其结合力度没有免疫磁珠的化学结合键的结合力度大。而且免疫亲和柱的载体为固相，抗体与检测靶物质的结合概率与免疫磁珠相比较会低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种克仑特罗免疫磁珠分离富集试剂盒，采用该试剂盒进行样品中克仑特罗的分离富集时具有较高的特异性、回收率和准确度，简化样品前处理步骤，避免样品前处理过程中使用多种和大量的有机溶剂。

为实现上述目的，本发明提供一种克仑特罗免疫磁珠分离富集试剂盒，其包含有：偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠、复溶液和磁铁，所述偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠是由克仑特罗单克隆抗体与磁珠的质量比为1：500-1000混合并溶于2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物中偶联制备而成，所述克仑特罗单克隆抗体是由克仑特罗半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。

所述克仑特罗半抗原是由克仑特罗与对羟基苯丙酸经重氮化反应，在氨基上引入待羧基间隔臂，得到克仑特罗半抗原，其结构式如式Ⅰ所示。

(式Ⅰ)

所述复溶液含有0.2-0.8％牛血清白蛋白、0.01-0.05％吐温-20以及0.02％NaN₃的磷酸盐缓冲液或pH7.2～pH7.6的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，所述百分含量均为质量百分含量，所述偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠在复溶液中保存。

所述磁铁产生外加磁场，使偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠聚集在磁铁上，达到分离磁珠的目的。

本发明还提供了分离富集样品中克仑特罗的方法，包括下列步骤：

1)用试剂盒进行样品中克仑特罗的分离富集；

2)将富集有克仑特罗的偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠用甲醇洗脱，回收甲醇液，用于检测分析。

本发明的有益效果如下：

1)本发明试剂盒的具有较高的特异性和准确性，对克仑特罗的捕获浓度可达到20ng/mg(每毫克免疫磁珠可以捕获20ng克仑特罗)，样品添加回收率≥85％；

2)本发明试剂盒中的偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠与液体经磁力作用容易快速分离开来，分离过程简单，可省去离心和过滤等繁琐的操作过程，节约时间，在撤去外加磁场时，磁珠无磁性记忆，能够均匀分散，不出现聚集现象；

3)磁珠具有一定的机械度和化学稳定性，能耐受一定浓度的酸碱溶液和微生物的降解，其结构内的磁性物质不易被氧化，磁性微粒的这种物理化学性质稳定特点，使其磁性不易下降；

4)磁珠的润洗和洗脱分别用去离子水和甲醇，0.1mL的偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠只需1mL甲醇洗脱即可，所用试剂的量较少，磁珠的润洗和洗脱过程较环保。

附图说明

图1为克仑特罗半抗原合成反应式。

图2为克仑特罗半抗原核磁共振氢谱图。

具体实施方式

实施例1：试剂盒具体组分的制备

1.克仑特罗半抗原合成

克仑特罗半抗原是由盐酸克仑特罗与对羟基苯丙酸经重氮化反应，在氨基引入带羧基的间隔臂，得到的克仑特罗半抗原。取0.2-0.5g盐酸克仑特罗加入到2-4mL1mol/L稀盐酸中溶解，再加10mL蒸馏水，搅拌，溶液冷却到0℃，再加入0.1-0.2g亚硝酸盐，搅拌2h，得到重氮盐溶液。取0.3-0.5g对羟基苯丙酸，加入到5mL乙醇中溶解，再加入0.2-0.35g碳酸钾，搅拌溶解，溶液冷却到0℃，加入重氮盐溶液，搅拌4h，停止反应，在向反应液中加入适量的水，用乙酸乙酯萃取，分离掉有机相，加盐酸调节pH值至5，加乙酸乙酯萃取，分离掉水相，干燥蒸干，经过硅胶柱分离纯化，用二氯甲烷：甲醇＝10:1(体积比)的混合溶剂洗脱分离，得到克仑特罗半抗原产物，收率为94.8％。合成反应式如图1所示。取上述克仑特罗半抗原产物经核磁氢谱测定，如图2所示，化学位移δ＝11ppm的位置为羧基氢共振吸收峰，化学位移δ＝2.51、2.79的位置为苯丙三酸的支链氢共振吸收峰，证明间隔臂连接成功，克仑特罗半抗原合成成功。核磁鉴定结果：¹HNMR(CDCl₃,300MHZ)δ:11.0(s,1H,COOH),7.10-7.75(d,5H,ArH),5.35(s,1H,OH),4.87(m,1H,CH-O),3.65(s,1H,OH),2.51(t,2H,-CH2-),2.79(t,2H,-CH2-),2.9(d,2H,-CH2-),2.0(s,1H,NH),2.00(m,4H,-CH2-),1.27(s,9H,-CH3)。

2.免疫原的制备

取8-10mL克仑特罗半抗原，溶解于1mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中；取25-30mg二氯乙烷(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)用0.2-0.5mL水充分溶解后，加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取牛血清白蛋白(BSA)50mL，使之充分溶解在4mLpH值为7.2的磷酸盐缓冲液中，将反应液A逐滴缓慢滴加到BSA溶液中，并于室温下搅拌24h；用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液于4℃透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，得到克仑特罗免疫原；分装，于-20℃保存备用。

3.克仑特罗单克隆抗体的制备

1)动物免疫：用上述制备出的免疫原(RAC-BSA)按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6～8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。

2)细胞融合：按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)混合，然后在45秒内缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。

3)杂交瘤细胞的筛选：细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原(预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度)包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入克仑特罗标准品溶液50μL，再加入细胞上清液50μL和羊抗鼠IgG-HRP50μL，于37℃反应30min，洗板，再加入底物液显色液100μL，于25℃下避光反应15min，再加入终止液50μL，测定OD_450nm值下降到对照孔的50％以下，判为阳性，经2～3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。

4)单克隆抗体制备：将2～3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8～10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7～10日后腹腔注射杂交瘤细胞1～2×10⁶/只，7～10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存备用。

5.偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠的制备

1)磁珠活化

表面有-COOH基团的磁珠(购于DYNAL，粒径为2.8μm)，其含量是0.1eq/g～0.3eq/g，取100μL磁珠，用含有pH5.0、0.05％的吐温-20的浓度为25mmol/L的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物(MES)100mL洗涤两次，磁分离后移除上清；磁珠活化前，用4℃贮存的上述MES溶液分别配制50mmol/L的EDC和NHS溶液；分别向装有磁珠的离心管中加入新配置的EDC和NHS溶液各50μL，涡旋混匀，室温活化30min；将离心管置于磁分离架上进行磁分离4min，移除上清液，再向其中加入100μL、pH5.0、25mmol/L的MES清洗2～3次后即可得到表面有羧基活化的磁珠。所述百分含量为质量百分含量。

2)偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠的制备

将5μg克仑特罗单克隆抗体溶解到60μL、pH5.0、25mmol/L的MES中，向其中加入5mg活化的磁珠，或将10μg克仑特罗单克隆抗体溶解到60μL、pH5.0、25mmol/L的MES中，向其中加入5mg活化的磁珠，并用上述浓度MES溶液调节总体积至100μL，轻柔地混匀磁珠与克仑特罗单克隆抗体；室温条件下偶联30min或4℃偶联2h，该期间可利用涡旋仪使磁珠保持混匀状态；离心管置于磁分离架上进行磁分离5min，移除上清液；为了淬灭未反应的-COOH，可加入100μL，pH7.2～pH7.6的三羟甲基氨基甲烷(TRIS)反应15min或100μL、pH8.0、乙醇胺浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液封闭磁珠；用100μL、0.2％BSA、0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液清洗封闭好的磁珠3～5次，将磁珠复溶于含0.2％的BSA、0.08％吐温-20、0.02％NaN₅的磷酸盐缓冲液中，于2℃～8℃保藏。所述百分含量为质量百分含量。

实施例2：试剂盒的组建

组建检测克仑特罗磁免疫磁珠分离富集试剂盒，使其含有下列组分：

偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠

复溶液

磁铁

将偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠加入到复溶液中，至终浓度为10mg/mL。

实施例3：试剂盒对样品中克仑特罗的分离富集方法

1)取溶有偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠复溶液0.1mL于10mL离心管中，用5mL去离子水润洗磁珠1-2次，将离心管在磁铁上静置2-3min，确保磁珠全部吸附在磁铁上，每次用磁铁分离磁珠和洗液；

2)将尿液样品5mL加入到装有润洗好的偶联克仑特罗单克隆抗体磁珠的10mL的离心管中，混匀，室温下反应20min；或者将动物组织、饲料样品用均质器均质后，称取5.0±0.05g样品至样品瓶中，分别加入1.5±0.05g氯化钠，20mL50％甲醇溶液，用涡旋仪涡旋5min，室温下3000r/min离心5min，或静置后取10mL上清液过滤代替离心过程，吸取5mL离心上清液/滤液，加入5mL去离子水，混匀，吸取离心上清液/滤液与去离子水的混合液5mL与偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠混匀，在室温下反应20min；

3)反应完成后，用磁铁分离磁珠，用5mL去离子水清洗磁珠，清洗两次；

4)将1mL甲醇加入到装有经过步骤3)清洗过的磁珠的10mL离心管中，混匀，静置

1min，用磁铁分离磁珠，回收甲醇溶液，用于检测分析。

实施例4：试剂盒质量的测定

1.试剂盒的捕获量和回收率

试剂盒捕获量的定义为：每毫克偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠可以捕获克仑特罗的最大量。制备克仑特罗浓度分别为10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL样品溶液，每份猪尿、牛尿、羊尿、饲料、猪肉、猪肝、牛肉、羊肉样品溶液为1mL，取克仑特罗单克隆抗体免疫磁珠0.1mL分别加入至上述样品中，用试剂盒进行样品中克仑特罗的分离和富集，并用克仑特罗酶联免疫(ELISA)检测试剂盒对用偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠处理过样品进行检测，偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠捕获量和样品添加回收率如表1所示：

表1偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠捕获量和样品添加回收率结果

由表1可以看出，样品中克仑特罗浓度为10ng/mL、15ng/mL和20ng/mL时，经克仑特罗免疫磁珠分离富集试剂盒对样品中克仑特罗分离富集后，再经ELISA检测方法检测，得出克仑特罗添加回收率范围为91.9％-99.7％，当样品中克仑特罗浓度为25ng/mL和30ng/mL时，得出克仑特罗添加回收率范围为68.4％-83.5％，表明克仑特罗免疫磁珠分离富集试剂盒对样品中克仑特罗的捕获量为20ng/mL。

2.特异性

以克仑特罗作为标准，设克仑特罗的交叉反应率为100％，用于试剂盒交叉反应性研究的药物均为与克仑特罗结构或者功能相似的竞争药物：沙丁胺醇、莱克多巴胺、苯乙醇胺A、溴氯布特罗、溴布特罗、特布他林、羟甲基克仑特罗、西马特罗、妥布特罗、马喷特罗、赛布特罗、克仑潘特、齐帕特罗、喷布特罗、克仑丙罗、马布特罗、氯丙那林。猪尿、牛尿、羊尿、饲料、猪肉、猪肝、牛肉、羊肉样品中分别添加上述18种药物(包括克仑特罗)浓度为20ng/mL，按试剂盒步骤操作，对样品中克仑特罗进行分离富集后，利用ELISA检测方法对样品进行检测，检测结果列于表2：

表2试剂盒特异性试验

从表2可以看出，试剂盒对克仑特罗具有较高的特异性，对与克仑特罗结构或者功能相似的竞争药物均无交叉反应。

Claims (5)

1.一种克仑特罗免疫磁珠分离富集试剂盒，其特征在于包括偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠、复溶液和磁铁，所述偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠是由克仑特罗单克隆抗体与磁珠的质量比为1：500-1000混合并溶于2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物中偶联制备而成，所述克仑特罗单克隆抗体是由克仑特罗半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述克仑特罗半抗原是由克仑特罗与对羟基苯丙酸经重氮化反应，在氨基上引入待羧基间隔臂，得到克仑特罗半抗原，其结构式如式Ⅰ所示。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述复溶液含有0.2-0.8％牛血清白蛋白、0.01-0.05％吐温-20以及0.02％NaN₃的磷酸盐缓冲液或pH7.2～pH7.6的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，所述百分含量均为质量百分含量，所述偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠在复溶液中保存。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁铁产生外加磁场，使偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠聚集在磁铁上，达到分离磁珠的目的。

5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒分离富集样品中克仑特罗的方法，包括下列步骤：

1)用权利要求1-4任一项所述的试剂盒进行样品中克仑特罗的分离富集；

2)将富集有克仑特罗的偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠用甲醇洗脱，回收甲醇液，用于检测分析。