CN111024953A - 一种莱克多巴胺、盐酸特伦克罗的复合免疫磁珠净化试剂盒 - Google Patents
一种莱克多巴胺、盐酸特伦克罗的复合免疫磁珠净化试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明所提供的净化试剂盒包括偶联有莱克多巴胺抗体、盐酸特伦克罗抗体的免疫磁珠固相载体和装载该免疫磁珠固相载体的配套试试剂盒。所述的复合免疫磁珠净化试剂盒是将偶联有莱克多巴胺抗体、盐酸特伦克罗抗体的免疫磁珠固相载体放入特定的试剂盒，该试剂盒配合免疫磁珠纯化仪，可全自动化完成动物组织、水产品、肉制品等产品中莱克多巴胺、盐酸特伦克罗的富集与分离，分离能力强，后与高效液相色谱法、酶联免疫吸附法等联合使用，可高效、准确检测样品中莱克多巴胺、盐酸特伦克罗的含量。
Description
技术领域
本发明属于样本前处理领域，具体涉及一种莱克多巴胺、盐酸特伦克罗的复合免疫磁珠净化试剂盒。
背景技术
莱克多巴胺、盐酸特伦克罗是人工合成的β肾上腺受体激动剂，该药物具有实现促进瘦肉生长、抑制肥肉生长的功能。属于中度蓄积性药物，尤其是在猪的肝脏等内脏器官残留较高，在动物组织内的蓄积与其计量和给药时间密切相关，其残留量随停药期的延长逐渐下降。近年来动物性产品中的兽药残留对生态食物链和人类健康造成了严重危害，所以我国明确规定禁止莱克多巴胺、盐酸特伦克罗及其制品在食品动物的饲养过程中使用，加强对动物食品中兽药残留的检测是必要的。
目前检测莱克多巴胺、盐酸特伦克罗的方法是免疫学法和色谱分析法。这两种方法虽然灵敏度高，但样本前处理及测定操作繁琐，费用高，不适宜于大量样本的筛查，鉴于此，为了实现快速地对样本中的莱克多巴胺、盐酸特伦克罗的含量进行定量分析，建立一种高效、快速、简单、富集纯化效果高的莱克多巴胺、盐酸特伦克罗的样本前处理方法具有非常重要的意义。。
发明内容
本发明的目的是在于针对现有技术存在的不足，提供一种莱克多巴胺、盐酸特伦克罗的复合免疫磁珠净化试剂盒，用于样本中盐莱克多巴胺、盐酸特伦克罗富集与净化，以解决莱克多巴胺、盐酸特伦克罗样本样品净化分离操作复杂、分离效率低的等技术问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种莱克多巴胺、盐酸特伦克罗的复合免疫磁珠净化试剂盒，包括偶联有莱克多巴胺抗体、盐酸特伦克罗抗体的免疫磁珠固相载体和装载该免疫磁珠固相载体的配套试试剂盒，所述的复合免疫磁珠净化试剂盒是将偶联有莱克多巴胺抗体、盐酸特伦克罗抗体的免疫磁珠固相载体放入特定的试剂盒，其以免疫磁珠为固相载体，经过化学反应活化，使得磁珠表面带有亲和配基，活化后磁珠与莱克多巴胺抗体、盐酸特伦克罗抗体偶联，制得能够对莱克多巴胺、盐酸特伦克罗实现快速富集和纯化的样本前处理试剂盒，以便后续HPLC或酶联免疫吸附法的测量。
优选地，免疫磁珠浓度为5-100mg/mL。
优选地，每个免疫磁珠净化试剂盒中所含抗莱克多巴胺单克隆抗体、抗盐酸特伦克罗单克隆抗体分别为0.5-5mg/mL、1-5mg/mL。
优选地，免疫磁珠保存液为pH7.4，0.02mo1/L的PBS缓冲液。
优选地，所述试剂盒的具体使用步骤具体为：将偶联有莱克多巴胺抗体、盐酸特伦克罗抗体的免疫磁珠从冰箱中取出恢复至室温，旋转混匀，将预先处理的样本溶液放入试管中，后将免疫磁珠转移至试管中，充分旋转重悬，室温下旋转捕获20min，以实现最大程度地捕获样本中的莱克多巴胺和盐酸特伦克罗，利用磁架进行磁分离，缓慢弃去上清液；将已捕获过样本的免疫磁珠利用清洗液清洗数次，轻摇重悬磁分离；已实现莱克多巴胺和盐酸特伦克罗的样本富集净化液；将上述得到的样本富集净化液利用有机溶剂为洗脱液进行洗脱，室温震荡几秒钟，磁分离，上清液即为待测的莱克多巴胺、盐酸特伦克罗的样本，可用于后续的HPLC或酶联免疫吸附法测定。
一种莱克多巴胺、盐酸特伦克罗的复合免疫磁珠净化试剂盒，具体制备方法为：
（1）抗体预处理：将已纯化好的抗莱克多巴胺单克隆抗体、抗盐酸特伦克罗单克隆抗体置于pH6.5 50mmol/L缓冲液透析过夜12h；
（2）活化：取一定量的磁珠于反应管中，超声分散重悬混匀，分别加入配制的EDC和NHS，在室温下放置于血液混匀仪进行活化反应2h，使溶液一直保持着悬浮混匀状态；
（3）偶联：用磁架进行磁分离，缓慢倒出上清液，同上PBS缓冲液洗涤三次，混匀仪上重悬。将已预处理好的抗莱克多巴胺单克隆抗体、抗盐酸特伦克罗抗体加入到已活化好的的免疫磁珠中，室温下反应过夜，放置于混匀仪上旋转保持悬浮状态；
（4）封闭：用磁架进行磁分离，倒出上清液，加入40μL的乙醇胺溶液和BSA封闭液，37℃封闭2h，保持悬浮状态；
（5）保存：用PBS清洗免疫磁珠3次，磁分离，弃上清液，于4℃保存于免疫磁珠保存液中。
本发明相对于现有技术的有益效果是：
1. 应用免疫磁珠分离技术，无需提取后再进行纯化步骤，该操作简便，方便可行。
本发明可在短时间迅速、有选择地分离内将样品中的莱克多巴胺和盐酸特伦克罗的富集与纯化，避免了大量使用有机溶剂，有效地减少了背景物质的干扰，提高了检测的准确性和精准性；
该操作不需要大型仪器和特殊培训的专业人员，样品不需要特殊前处理，对低于检测极限的莱克多巴胺和盐酸特伦克罗样品，通过免疫磁珠的富集作用以及免疫磁珠在液体中充分扩散使得结合表面积扩大，反应更加彻底，从而能够改变检测极限，提高检测的灵敏度，避免漏检的现象。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好的理解本发明的技术方案，下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围，本发明具体实施方式如下。
实施例1
一、抗莱克多巴胺单克隆抗体、抗盐酸特伦克罗单克隆抗体的免疫磁珠的制备：
1．取磁珠放入离心管中，加入活化缓冲液洗涤磁珠，反复三次，每次间隔3分钟，除去活化缓冲液后加入活化剂EDC和NHS各180μL，混匀，于37℃旋转孵育2小时，进行磁珠活化；
2．用偶联缓冲液洗涤磁珠三遍，加入0.8mg抗莱克多巴胺单克隆抗体、1mg抗盐酸特伦克罗单克隆抗体，混匀，于37℃孵育3小时，制备成含抗莱克多巴胺单克隆抗体抗盐酸特伦克罗单克隆抗体的复合免疫磁珠；
3．用洗涤缓冲液洗涤免疫磁珠反复三次，每次间隔3分钟。用封闭液于37℃孵育2小时，置于保存缓冲液中4℃保存待用；
4.将清洗好的复合免疫磁珠装载入免疫磁珠固相载体的配套试试剂盒，以供后续使用。
二、一种莱克多巴胺、盐酸特伦克罗的复合免疫磁珠净化试剂盒对饲料样品中莱克多巴胺、盐酸特伦克罗富集的应用：
1、称取5.0 g的饲料样品，装入试管中，放入一定的样本提取液，预处理样品，离心旋转，取上清液，放入样本管位中；
2、将含有抗莱克多巴胺单克隆抗体、抗盐酸特伦克罗单克隆抗体的免疫磁珠取出恢复至室温，轻摇悬浮，不沉降；
3、取步骤（1）中的上清液，用磁棒将含有抗莱克多巴胺单克隆抗体、抗盐酸特伦克罗单克隆抗体的免疫磁珠加至其中，充分混匀后于37℃孵育15分钟，反应完成后，置于磁力架上捕获磁珠，慢慢倾倒出上清液。用缓冲液清洗3次，即可得到富集样本中莱克多巴胺和盐酸特伦克罗的免疫磁珠；
4、步骤（3）中富集的莱克多巴胺和盐酸特伦克罗的免疫磁珠用有机溶剂进行洗脱，室温震荡几秒钟，磁分离，上清液即为样本中待测的莱克多巴胺和盐酸特伦克罗，可用于HPLC法或酶联免疫吸附法测定。
实施例2
一、抗莱克多巴胺单克隆抗体、抗盐酸特伦克罗单克隆抗体的免疫磁珠的制备：
1．取磁珠放入离心管中，加入活化缓冲液洗涤磁珠，反复三次，每次间隔3分钟，除去活化缓冲液后加入活化剂EDC和NHS各200μL，混匀，于37℃旋转孵育2小时，进行磁珠活化；
2．用偶联缓冲液洗涤磁珠三遍，加入4mg抗莱克多巴胺单克隆抗体、1.5mg抗盐酸特伦克罗单克隆抗体，混匀，于37℃孵育3小时，制备成含抗莱克多巴胺单克隆抗体抗盐酸特伦克罗单克隆抗体的复合免疫磁珠；
3．用洗涤缓冲液清洗复合免疫磁珠反复清洗三次，每次清洗时间间隔3分钟。用封闭液于37℃孵育2小时，置于保存缓冲液中4℃保存待用；
二、一种莱克多巴胺、盐酸特伦克罗的复合免疫磁珠净化试剂盒对饲料样品中莱克多巴胺、盐酸特伦克罗富集的应用：
1、将动物组织样品用肉搅碎机捣碎，或用刀剁碎（浆状）；
2、称取5.0 g捣碎的组织样品，装入5 mL的冷冻管中，拧紧管盖；将装有样品的冷冻管在沸水中煮10分钟后（肉熟透为准）取出冷却至室温备用。制成样品匀液，放入样本管位中；
3、将含有抗莱克多巴胺单克隆抗体、抗盐酸特伦克罗单克隆抗体的免疫磁珠取出恢复至室温，轻摇悬浮，不沉降。取步骤（2）中的样品匀液，用磁棒将含有抗莱克多巴胺单克隆抗体、抗盐酸特伦克罗单克隆抗体的免疫磁珠加至其中，充分混匀后于37℃孵育15分钟，反应完成后，置于磁力架上捕获磁珠，慢慢倾倒出上清液。用缓冲液清洗3次，即可得到富集样本中莱克多巴胺和盐酸特伦克罗的免疫磁珠；
4、步骤（3）中富集的莱克多巴胺和盐酸特伦克罗的免疫磁珠用有机溶剂进行洗脱，室温震荡几秒钟，磁分离，上清液即为样本中待测的莱克多巴胺和盐酸特伦克罗，可用于HPLC法或酶联免疫吸附法测定。
以上所述实施例的各个技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合均进行描述，然而，只要认为这些技术特征的组合不存在矛盾，都应认为是本说明书记载的范围。
以上的实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解对专利范围的限制，应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都是属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种莱克多巴胺、盐酸特伦克罗的复合免疫磁珠净化试剂盒，其以免疫磁珠为固相载体，经过化学反应活化，活化后免疫磁珠与莱克多巴胺抗体、盐酸特伦克罗抗体偶联，装载该免疫磁珠固相载体的配套试试剂盒，制得能够仅对莱克多巴胺抗体、盐酸特伦克罗抗体实现快速富集和纯化的样本前处理试剂盒。
2.根据权利要求1所述的一种莱克多巴胺、盐酸特伦克罗的复合免疫磁珠净化试剂盒，其特征在于所述的免疫磁珠浓度为5-100mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种莱克多巴胺、盐酸特伦克罗的复合免疫磁珠净化试剂盒，其特征在于每个免疫磁珠净化试剂盒中所含抗莱克多巴胺单克隆抗体、抗盐酸特伦克罗单克隆抗体分别为0.5-5mg/mL、1-5mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种莱克多巴胺、盐酸特伦克罗的复合免疫磁珠净化试剂盒，其特征在于使用具体步骤以下：
将偶联有莱克多巴胺抗体、盐酸特伦克罗抗体的免疫磁珠从冰箱中取出恢复至室温，缓慢旋转混匀，将预处理的样本溶液放入试管中，后将免疫磁珠通过磁棒转移至该试管中，充分旋转重悬，室温下旋转捕获15min，以实现最大程度地捕获样本中的莱克多巴胺和盐酸特伦克罗，利用磁架进行磁分离，缓慢弃去上清液；将已捕获过样本的免疫磁珠利用清洗液清洗数次，轻摇重悬磁分离；已实现莱克多巴胺和盐酸特伦克罗的样本富集净化。
5.根据权利要求1所述的一种莱克多巴胺、盐酸特伦克罗的复合免疫磁珠净化试剂盒，其特征在于将上述得到莱克多巴胺和盐酸特伦克罗的免疫磁珠用有机溶剂进行洗脱，室温震荡几秒钟，磁分离，上清液即为待测的克多巴胺、盐酸特伦克罗，可用于HPLC法或酶联免疫吸附法测定。
6.根据权利要求1所述的一种莱克多巴胺、盐酸特伦克罗的复合免疫磁珠净化试剂盒，其特征在于免疫磁珠保存液为pH7.4，0.02mo1/L的PBS缓冲液。
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|---|---|---|---|---|
| US5660995A (en) * | 1992-03-02 | 1997-08-26 | Enfer Technology Ltd. | Veterinary drug residue surveillance method |
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2020
- 2020-01-13 CN CN202010030795.6A patent/CN111024953A/zh active Pending
Patent Citations (5)
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