CN105296522A - Bt蛋白表达系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及Bt蛋白表达系统，属于生物技术领域。本发明Cry1Ab/Ac融合蛋白表达载体，其特征在于：载体pHT315插入有mcry1Ab/ac-C2序列，其启动子为cry1Ac启动子，所述mcry1Ab/ac-C2序列如SEQ？ID？NO：6所示。据此建立的Bt蛋白表达系统，能获得大量高纯度的Cry1Ab/Ac融合蛋白，为华恢1号等转基因水稻的安全评价及Cry1Ab/Ac蛋白标准物的制备奠定基础。

Description

Bt蛋白表达系统

技术领域

本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种表达Cry1Ab/Ac融合蛋白的Bt蛋白表达系统。

背景技术

水稻是我国主要的粮食作物之一，转基因水稻主要有抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆环境以及提高水稻品质等多个品种。转cry1Ab/Ac水稻(华恢1号)是华中农业大学自主培育的对二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等具有较强杀虫活性的水稻品种(FieldperformanceoftransgenicelitecommercialhybridriceexpressingBacillusthuringiensisdelta-endotoxin.TuJM,etal.NatureBiotechnology,2000,18(10):1101-1104)，2009年转Bt抗虫水稻华恢1号和汕优63获得生物安全证书(ThefirstapprovedtransgenicriceinChina.LuC.GMCrops,2010,1(3):113-115)，具有广阔的应用前景。但转基因作物可能会对动物等非靶标生物或生态环境产生一些非预期效应，所以推广转基因作物的前提是要确保其安全性。对转基因植物的评价主要从环境和食用安全性两方面考虑，食品安全性评价包括对营养成份、抗营养因子、毒性、过敏性、抗生素抗性等方面进行全面评估(转基因植物的食品安全性问题及评价策略.许文涛,等.生命科学,2011,23(2):179-185.)。这些安全评价都需要大量的高纯度目标蛋白，但水稻种表达的Cry1Ab/Ac含量极低，又不带有标签，很难纯化。

发明内容

本发明提供一种Bt蛋白表达系统，实现Cry1Ab/Ac融合蛋白在微生物中的高效表达，以获得大量高纯度的Cry1Ab/Ac融合蛋白，为华恢1号等转基因水稻的安全评价及Cry1Ab/Ac蛋白标准物的制备奠定基础。

Cry1Ab/Ac融合蛋白表达载体，其特征在于：载体pHT315插入有mcry1Ab/ac-C2序列，表达载体的启动子为cry1Ac启动子，所述mcry1Ab/ac-C2序列如SEQIDNO：6所示。

Bt蛋白表达系统，为插入有上述Cry1Ab/Ac融合蛋白表达载体的苏云金芽胞杆菌菌株。

所述苏云金芽胞杆菌菌株为无晶体蛋白的HD73^-菌株。

上述表达载体或表达系统在生产高纯度Cry1Ab/Ac融合蛋白中的应用。

所述应用为采用上述Bt蛋白表达系统表达Cry1Ab/Ac融合蛋白，再经提取和纯化而得到。

所述表达Cry1Ab/Ac融合蛋白为将菌株置于1/2LB固体培养基中，30℃培养。

所述纯化方法为将提取的Cry1Ab/Ac蛋白先经脱盐柱G-25脱盐，再将蛋白样品进行阴离子交换层析，最后再使用脱盐柱G-25进行脱盐。

所述脱盐条件为：柱平衡缓冲液为50mMNa₂CO₃缓冲液，pH10.5；流速为2mL/min，阴离子交换层析条件为：柱平衡缓冲液为50mMNa₂CO₃缓冲液，pH10.5；流速为2mL/min，以0-100％的1MNaCl进行梯度洗脱。

植物表达的Bt蛋白以可溶状形式存在，而在cry基因在大肠杆菌的表达系统中表达多形成包涵体，影响生物安全评价的结果，因此本发明采用Bt表达系统来表达cry1Ab/Ac杂合基因。根据转基因水稻TT51转化事件中的氨基酸序列(Cry1Ab/Ac氨基酸序列如SEQIDNO：1所示)合成mcry1Ab/ac基因(如序列SEQIDNO：2)，为保证mcry1Ab/ac在苏云金芽胞杆菌中形成稳定的晶体，合成C1(SEQIDNO：3)和C2(SEQIDNO：4)序列。启动子为cry1Ac启动子(己知序列)，将mcry1Ab/ac-C1(SEQIDNO：5)序列和mcry1Ab/ac-C2(SEQIDNO：6)序列分别BamHI和SalI酶切后连入载体pHT315(己知载体)中。分别将验证正确的克隆用电击转化法，转入HD73^-菌株，获得重组Bt菌株HD-1Ab/AcC1和HD-1Ab/AcC2。

光学显微镜下观察：菌株HD-1Ab/AcC2可以形成双锥体型晶体(图1)，而菌株HD-1Ab/AcC1则观察不到任何性状的晶体，说明mcry1Ab/ac-C1杂合基因在Bt的表达系统中不能形成稳定的晶体结构。

SDS-PAGE结果显示，获得得大小为130kDa的蛋白(图2A)。然后对130kDa进行胰蛋白酶消化，获得约为60kDa的杂合蛋白mCry1Ab/Ac(图2B)，这与转cry1Ab/Ac基因水稻中的外源蛋白大小相同。

消化后的核心片段先用G-25脱盐柱进行脱盐，然后再进行阴离子交换纯化(图3)，最后再进行脱盐，最终得到纯度较高的蛋白(图4)。经鉴定，mCry1Ab/Ac蛋白的纯度为97％(图5)。

菌株HD-1Ab/AcC2菌株接种于含有50ml1/2LB培养基的500ml三角瓶中培养，共20个三角瓶，获得1L菌液，按照本研究蛋白提取及纯化方法共获得150ml纯蛋白，对获得的纯蛋白用Thermo公司的BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，BSA蛋白标准曲线见图7，根据公式计算，纯蛋白的浓度为0.21μg/μl。1L菌液获得可溶状态纯蛋白31mg。

本发明的Bt蛋白表达系统，能获得大量高纯度的Cry1Ab/Ac融合蛋白，为华恢1号等转基因水稻的安全评价及Cry1Ab/Ac蛋白标准物的制备奠定基础。

附图说明

图1Bt菌株HD-1Abc光学显微镜观察结果，

其中S.芽胞；C.晶体，

图2杂合蛋白Cry1Ab/Ac-C2(A)与杂合蛋白mCry1Ab/Ac(B)SDS-PAGE检测，

图3阴离子交换纯化流程，

图4高纯度mCry1Ab/Ac蛋白的DSD-PAGE检测，

图5杂合蛋白mCry1Ab/Ac的纯度分析，

图6菌株Cry1Ab/Ac-C2(C)及水稻TT51(T)总蛋白的WesternBlot分析，

图7BSA蛋白标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例1

1.1实验材料菌株与质粒

本文所用菌株和质粒见(表1)，可以对公众发放。

表1菌株与质粒

1.2试剂

1.2.1培养基

液体LB：Tryptone10.0g，Yeastextract5.0g，NaCl10.0g，加水定容到1000mL，调pH7.0，15磅20min。固体LB：在液体培养基中加入1.3％的琼脂。1/2固体LB：Tryptone5.0g，Yeastextract2.5g，NaCl5.0g，加水定容至1000mL，加入1.3％琼脂粉，调pH至7.0，15磅20min。

1.2.2抗生素

氨苄青霉素，配制成100mg/mL的水溶液，用一次性滤器0.22μm过滤除菌，置于-20℃保存。氯霉素、红霉素用无水乙醇溶解，配制成34mg/mL溶液，置于-20℃保存。

1.2.3化学试剂及酶试剂

限制性内切酶及2×连接试剂盒、2×Taqmix、2×PrimerStarmix均购自TaKaRa公司。E.coli质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自美国Axygen公司。各种抗生素均购自美国Amresco公司；酪蛋白(α-casein)、大豆胰蛋白酶抑制剂(Soybeantrypsininhibitor,STI)、胃蛋白酶(pepsin)、胰蛋白酶(trypsin),均购自Solarbio公司；常规化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。其它均为市售国产或进口分析纯或电泳级纯化学试剂。

1.2.4标准分子量

DNA标准分子量：

DL2000：2000、1000、750、500、250、100(bp)

DL5000：5000、4000、3000、2000、1500、1000、500(bp)

DL10000：10000、7000、4000、2000、1000、500、250(bp)

1kbladder：10000、8000、6000、5000、4000、3000、2000、1000(bp)

标准蛋白分子量：

HighMarker：212、116、97、66、45(kDa)。

LowMarker：97、66、43、31、20(kDa)。

1.2.5其它相关试剂

1)IPTG：1mol/L的IPTG水溶液，-20℃保存。

2)蛋白缓SDS缓冲液：称取30.3gTris-base、144.0gGlicine、10.0gSDS，定容至1L后溶解。

3)TE缓冲液：10mmol/LTris·Cl(pH8.0)，EDTA1mmol/L(pH8.0)。

4)RNase溶液：10mgRNase溶于1mL水，沸水浴中加热15min，-20℃保存。

5)石炭酸复红染液：碱性复红(BasicFuchsine，品红)乙醇饱和液(约10％)10mL，石炭酸水溶液5％，100mL，两液相混，工作浓度稀释10倍染色。

1.3供试昆虫

水稻二化螟是由中国农业科学院植物保护研究所转基因生物安全组提供的标准化试虫。

1.4仪器设备

1)蛋白纯化仪AkataAvant25：美国GE公司

2)恒温培养箱DHP120，上海实验仪器总厂。

3)摇床D250，美国NBS公司产品。

4)德国台式Eppenddorf离心机5415C。

5)高速立式离心机RC-5，美国杜邦公司。

6)蛋白电泳仪：MiniproteinIII，美国Bio-Rad公司。

7)核酸电泳仪：北京六一厂。

8)凝胶成像系统：UniversalHoodII，美国Bio-Rad公司

9)PCR仪：美国AmpGene4800。

10)光学显微镜：日本OLYMPUSCX21。

11)超声破碎仪：宁波新芝SCIENTZII-D

1.5序列测定及生物信息学分析

测序由中国农业科学院重大科学工程开放实验室和华大基因公司完成；测序结果用NCBI网站上的BLAST软件、DNAMAN等软件分析。

1.6蛋白的质谱分析

通过SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色，分析候选蛋白条带。切取候选蛋白条带分装与1.5mLEP管中，送至北京华大蛋白质研发中心有限公司进行质谱分析。

1.7晶体形态观察

1)将Bt菌株用接种环接种于1/2LB固体培养基中，30℃培养大约48h；

2)将胞晶混合物刮取于载玻片上，涂抹均匀，晾干固定，滴入石炭酸复红染液染色3-5min，滴入清水冲洗，100×油镜进行光学显微镜镜检拍照。

1.8Cry1Ab/Ac蛋白提取及纯化

2.2.11.1Cry1Ab/Ac蛋白提取

1)挑取单菌落于5mLLB培养基中(含5μL红霉素)，30℃220rpm培养12h；

2)按1％的接菌量转接到1L三角瓶中(每瓶中有300mL1/2LB培养基，并加入红霉素)，30℃，220rpm，培养大约30h，镜检观察50％以上的菌体裂解时停止培养；

3)将发酵液4℃9000g离心10min，沉淀用预冷的1.0mol/LNaCl(50mL/升菌液)洗涤，4℃9000g离心10min后，用预冷的无菌水洗涤一次(50mL/升菌液)；

4)收集沉淀，悬于裂解液中(含3％β-巯基乙醇)，pH调到9.5-10，冰上摇4-12h；

5)4℃11300g离心20min，取上清，加入1/7体积的4.0mol/LNaAc-HAc(pH4.5)，调pH4.5-5.0；

6)4℃静止4h(或冰上沉淀1-4h)；

7)4℃11300g离心15min，沉淀用无菌水洗悬浮后，4℃11300g离心15min，重复一次，最后收集沉淀，并溶于50mMNa₂CO₃中。

8)SDS-PAGE检测Cry蛋白的提取结果，并用BSA标准品进行定量。

1.9Cry1Ab/Ac蛋白纯化

活化的Cry1Ab/Ac蛋白先经脱盐柱(G-25)进行脱盐，柱平衡缓冲液为50mMNa₂CO₃缓冲液，pH10.5；流速为2mL/min，检测UV280nm和cond等参数，收集蛋白峰，经SDS-PAGE分析确定含有目的蛋白后，再将样品进行阴离子交换层析。柱平衡缓冲液为50mMNa₂CO₃缓冲液，pH10.5；流速为2mL/min，以0-100％的1MNaCl进行梯度洗脱，检测UV280nm和cond等参数，收集流穿峰及洗脱峰样品，并对样品进行SDS-PAGE分析。最后再使用脱盐柱(G-25)进行脱盐，与上面的脱盐条件形同。

菌株HD-1Ab/AcC2菌株接种于含有50ml1/2LB培养基的500ml三角瓶中培养，共20个三角瓶，获得1L菌液，按照本研究蛋白提取及纯化方法共获得150ml纯蛋白，对获得的纯蛋白用Thermo公司的BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，BSA蛋白标准曲线见图7，根据公式计算，纯蛋白的浓度为0.21μg/μl。1L菌液获得可溶状态纯蛋白31mg。

结果：

表达载体构建

植物表达的Bt蛋白以可溶状形式存在，而在cry基因在大肠杆菌的表达系统中表达多形成包涵体，影响生物安全评价的结果，因此尝试在Bt表达系统来表达cry1Ab/Ac杂合基因。根据转基因水稻TT51转化事件中的氨基酸序列(Cry1Ab/Ac氨基酸序列见SEQIDNO：1)合成mcry1Ab/ac(SEQIDNO：2)基因，为保证mcry1Ab/ac在苏云金芽胞杆菌中形成稳定的晶体，合成C1(SEQIDNO：3)和C2(SEQIDNO：4)序列。启动子为cry1Ac(己知序列)启动子，将mcry1Ab/ac-C1(SEQIDNO：5)序列和mcry1Ab/ac-C2(SEQIDNO：6)序列分别BamHI和SalI酶切后连入载体pHT315(己知载体)中。分别将验证正确的克隆用电击转化法，转入HD73^-菌株，获得重组Bt菌株HD-1Ab/AcC1和HD-1Ab/AcC2。

菌株生物学特性

通过PCR鉴定已经构建好的Bt菌株HD-1Ab/AcC1和HD-1Ab/AcC2，分别将两株菌株在固体1/2LB培养基上培养48小时。光学显微镜下观察到菌株HD-1Ab/AcC1和HD-1Ab/AcC2菌体均未为长杆状，芽胞为长圆棒状，菌株HD-1Ab/AcC2可以形成双锥体型晶体(图1)，而菌株HD-1Ab/AcC1则观察不到任何性状的晶体，说明mcry1Ab/ac-C1杂合基因在Bt的表达系统中不能形成稳定的晶体结构。

ELISA鉴定

用购自Envirologix公司的Cry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒鉴定HD-1Ab/AcC1和HD-1Ab/AcC2菌株中是否有Cry1Ab/Ac蛋白的表达，方法见试剂盒说明书。根据OD₄₅₀值结果发现，菌株HD-1Ab/AcC1中无Cry1Ab/Ac蛋白的表达，而菌株HD-1Ab/AcC2中有Cry1Ab/Ac蛋白的表达，与电镜观察的结果是一致的，因此，我们选择菌株HD-1Ab/AcC2进行后续分析。

杂合mCry1Ab/Ac蛋白的获得

对菌株HD-1Ab/AcC2菌株进行发酵、裂解表达，然后进行芽孢清洗、超声破碎、裂解液裂解、等电点沉淀等步骤提取杂合蛋白Cry1Ab/Ac-C2，SDS-PAGE结果显示，获得得大小为130kDa的蛋白(图2A)。然后对130kDa进行胰蛋白酶消化，获得约为60kDa的杂合蛋白mCry1Ab/Ac(图2B)，这与转cry1Ab/Ac基因水稻中的外源蛋白大小相同。

杂合mCry1Ab/Ac蛋白的纯化

消化后的核心片段先用G-25脱盐柱进行脱盐，然后再进行阴离子交换纯化(图3)，最后再进行脱盐，最终得到纯度较高的蛋白(图4)。经鉴定，mCry1Ab/Ac蛋白的纯度为97％(图5)。

质谱结果分析

通过LC-MS鉴定，将得分最高，氨基酸序列匹配数最高的结果作为参考值(表2)，确定了杂合蛋白mCry1Ab/Ac氨基酸序列与转基因水稻TT51中的CryAb/Ac蛋白氨基酸序列相同。

表2一级质谱分析结果

Westernblot分析

对提自菌株Cry1Ab/Ac-C2的杂合蛋白mCry1Ab/Ac及水稻总蛋白进行WesternBlot分析。待测样经过SDS-PAGE分离后转印至PVDF膜上，将膜用TBS-T溶液漂洗后用20mL5％脱脂奶粉封闭2h，加入含一抗(0.5μL)的TBS-T漂洗液15mL，4℃孵育过夜或室温1h，加入含鼠抗兔IgG二抗(1μL)的TBS-T漂洗液15mL，室温1h，每步结束后漂洗膜3次，每次10min，最后膜用显色液显色后拍照。结果显示，Bt菌株获得的蛋白mCry1Ab/Ac与水稻TT51中表达的Cry1Ab/Ac蛋白都能被抗体识别，并且大小一致，说明具有相同的免疫原性。

Claims (8)

1.Cry1Ab/Ac融合蛋白表达载体，其特征在于：载体pHT315插入有mcry1Ab/ac-C2序列，表达载体启动子为cry1Ac启动子，所述mcry1Ab/ac-C2序列如SEQIDNO：6所示。

2.Bt蛋白表达系统，为插入有权利要求1所述的Cry1Ab/Ac融合蛋白表达载体的苏云金芽胞杆菌菌株。

3.根据权利要求1所述的Bt蛋白表达系统，所述苏云金芽胞杆菌菌株为无晶体蛋白的HD73^-菌株。

4.权利要求1所述的Cry1Ab/Ac融合蛋白表达载体或权利要求2或3所述Bt蛋白表达系统在生产高纯度Cry1Ab/Ac融合蛋白中的应用。

5.权利要求4所述的应用，为采用权利要求3所述的Bt蛋白表达系统表达Cry1Ab/Ac融合蛋白，再经提取和纯化而得到。

6.权利要求5所述的应用，所述表达Cry1Ab/Ac融合蛋白为将菌株置于1/2LB固体培养基中，30℃培养。

7.权利要求5所述的应用，所述纯化方法为将提取的Cry1Ab/Ac蛋白先经脱盐柱G-25脱盐，再将蛋白样品进行阴离子交换层析，最后再使用脱盐柱G-25进行脱盐。

8.权利要求7所述的应用，所述脱盐条件为：柱平衡缓冲液为50mMNa₂CO₃缓冲液，pH10.5；流速为2mL/min，阴离子交换层析条件为：柱平衡缓冲液为50mMNa₂CO₃缓冲液，pH10.5；流速为2mL/min，以0-100％的1MNaCl进行梯度洗脱。