CN106520826A - 利用深红色荧光蛋白标记植物种子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用深红色荧光蛋白标记植物种子的方法，通过合成深红色荧光蛋白TurboFP635基因，将其构建于植物种子特异性启动子下游，遗传转化目标植物，筛选得到的转基因植株自交，其结实种子在荧光显微镜下观察，转基因种子具有明显荧光。该方法可以区分转基因种子和非转基因种子，在转基因标记和生产中有很好的应用前景。

Description

利用深红色荧光蛋白标记植物种子的方法

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，具体地说，涉及一种利用深红色荧光蛋白标记植物种子的方法。

背景技术

植物基因工程中的近期进展己打开了改造植物以具有改善的特征或性状的新大门，所述改善的特征或性状例如植物疾病抗性、昆虫抗性、除草剂抗性、产量改善、植物可食用部分的营养质量的改善。

筛选标记基因在植物基因工程中极为重要，它可以大大减少工作量，能够方便区分转化细胞核非转化细胞。目前使用较多的潮霉素磷酸转移酶(hpt)从大肠杆菌中分离出来，具有潮霉素B抗性。该基因的作用机理是htp可以将磷酸基团共价的加到潮霉素B的第4位羟基上，使其发生磷酸化而失去活性，从而使转化细胞产生潮霉素抗性，非转化细胞死亡。草丁膦N-乙酰转移酶(PAT)(bar)基因最初从吸水链霉菌中分离出来的。PAT能使草丁膦的自由氨基乙酰化，从而使草丁膦对植物无毒害作用。但是这些标记基因存在抗生素敏感性、除草剂大量使用以及人类健康和生态环境等潜在的安全威胁，限制了转记忆植物的商业化应用。目前也有无选择标记转基因方法，包括共转化法、转座子法、位点特异性重组系统的方法，目前仍有待进一步研究，在商业上应用很有限。

自从1992年绿色荧光蛋白基因从水母中克隆以来，现在很多海洋生物物种中克隆到了新的荧光蛋白，荧光蛋白的的荧光波谱范围从424nm的深蓝色Sirius蛋白，到708nm的近红外mIFP蛋白，覆盖了深蓝，蓝色，青色，绿色，黄色，橙色，红色，深红，和近红外的波段。并且还发现和进化出了光激活，光转化荧光蛋白。这些荧光蛋白广泛应用于生物分子标记，研究分子相互作用(能量共振转移FRET)，光激活，光转化荧光蛋白用于单分子荧光定位。荧光蛋白作为标记分子本身来源于海洋动物，自身可以发荧光进行光学检测，不需要外源化学物质处理，具有更高的生物安全性。

蛋白质是稻米种子胚乳中继淀粉后的第二大储藏物质，占糙米干重的8％-10％。按照蛋白质功能可以将他们分为两大类，即作为种子储藏物质的种子储藏蛋白以及维持种子细胞正常代谢的结构蛋白。水稻种子蛋白大多数是储藏蛋白，在子叶或胚乳中形成粒(糊粉层)。主要根据种子蛋白质的溶解性分为4种：碱溶性谷蛋白，醇溶性醇溶蛋白，盐溶性球蛋白和水溶性白蛋白。种子特异性启动子可以驱动外源蛋白或种子自身蛋白在种子中表达储存。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用深红色荧光蛋白标记植物种子的方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种植物种子标记用深红色荧光蛋白TurboFP635基因，其为：

i)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:2所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有70％以上同源性且具有翻译成同等深红色荧光功能蛋白的核苷酸序列。

荧光蛋白TurboFP635呈深红色，激发峰：588nm，发射峰：635nm。其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明的另一目的是提供转基因荧光筛选标记，以及转基因种子标记，为了达到以上目的，本发明提供了转基因荧光标记的有效连接序列的植物表达载体，包含有效连接调控的表达盒，

本发明的深红色荧光蛋白TurboFP635基因表达盒，所述表达盒中包括植物种子特异性启动子及其下游的深红色荧光蛋白FP635基因。

由上述TurboFP635基因表达盒以及外源/内源基因表达盒串联而成的结构，均属于本发明保护范围。

本发明所述植物种子特异性启动子包括水稻、玉米、高梁、大麦、燕麦、小麦、粟、甘蔗、大豆、芸苔属物种、棉花、红花、烟草、苜蓿和向日葵等植物的种子特异性启动子。优选水稻种子特异性启动子ZZ1，其为：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。

本发明的深红色荧光蛋白TurboFP635基因表达盒由水稻种子特异性启动子及其下游的深红色荧光蛋白FP635基因组成。其中，所述水稻种子特异性启动子和深红色荧光蛋白FP635基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。

本发明还提供含有所述表达盒的载体、宿主细胞、工程菌及转基因细胞系。

本发明还提供所述表达盒或含有所述表达盒的载体在制备转基因植物以及转基因植物种子标记中的应用。

本发明含有上述深红色荧光蛋白的重组表达载体可通过农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等常规生物学方法转化植物细胞或组织，获得独立的转基因细胞或组织，培养得到转基因株系。

本发明还提供所述深红色荧光蛋白TurboFP635在转基因植物筛选以及植物种子标记中的应用。

本发明进一步提供一种利用深红色荧光蛋白标记植物种子的方法，将含有所述表达盒的载体转化目标植物，筛选得到的转基因植株自交，结实产生带荧光标记的种子。其中，所述植物包括但不限于水稻、玉米、高梁、大麦、燕麦、小麦、粟、甘蔗、大豆、芸苔属物种、棉花、红花、烟草、苜蓿和向日葵。优选水稻。

前述方法包括以下步骤：

S1、重组表达载体1300FP635-ZZ1的构建

S11、中间载体1300FP635的构建：人工合成深红色荧光蛋白TurboFP635基因序列时，在起始密码子前添加与载体1300GUSplus重复序列ctagaggatccacggtacc，并添加NcoI酶切位点；在终止密码子后添加与载体1300GUSplus重复序列atcaacaactctcctggcgcaccatcgtcggctacagcctcgggaattgctaccgagctcgaatttccccgatcgttc，并添加SacI酶切位点；利用Gibson Assembly法，将构建好的TurboFP635基因序列插入到1300GUSplus载体NcoI和SacI酶切位点之间，得到中间载体1300FP635(图1)；

S12、水稻种子特异性启动子的克隆：提取水稻基因组DNA，设计引物序列如SEQ IDNO:4和5所示，通过PCR反应扩增得到水稻种子特异性启动子；

S13、利用Gibson Assembly法，将S12的扩增产物插入到1300FP635载体NcoI酶切位点，即得重组表达载体1300FP635-ZZ1(图2)；

S2、遗传转化及转基因植株的获得

S21、农杆菌的制备：取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/ml Kan+25μg/ml Rif+50μg/ml链霉素的平板划线，28℃培养；挑取单菌落接种于50ml YEB液体培养基中，28℃220rpm振荡培养12-16hr；取2ml菌液转接于含有抗生素的100ml YEP液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.5；冰上预冷10分钟，5000rpm离心10min；然后用无菌去离子水洗2次，10％甘油洗1次，溶于3ml10％甘油中；取100μl感受态细胞加入1μl重组表达载体1300FP635-ZZ1，2.5KV电击转化；在含有卡那霉素和利福平的YEP培养板上28℃培养，挑选阳性克隆；

S22、验证正确的克隆，通过农杆菌介导的遗传转化法侵染水稻‘中花11’，经共培养、筛选、分化、生根步骤之后，得到T0代转基因幼苗，提取DNA，经PCR验证的转基因阳性植株；

S3、转基因植株自交结实，收获转基因种子，在荧光显微镜下观察种子呈深红色。

步骤S22中PCR验证使用的引物序列如SEQ ID NO:6和7所示。

本发明提供一种利用深红色荧光蛋白标记植物种子的方法。通过合成深红色荧光蛋白TurboFP635基因，将其构建于植物种子特异性启动子下游，遗传转化载体通过农杆菌介导转入水稻胚性愈伤，挑选阳性愈伤组织，分化成苗，其结实种子在荧光显微镜下观察，转基因种子具有明显荧光。该方法可以区分转基因种子和非转基因种子，作物筛选标记，也可以用来标记愈伤组织，作为转化筛选方法。

(一)荧光蛋白激发波长588nm发射波长635nm，为深红色，具有更强的组织穿透能力，并且更容易与植物自身荧光区分开。

(二)该深红色荧光蛋白在植物种子中表达，通过荧光检测很容易区分转基因种子和非转基因种子，在转基因标记和生产中有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明深红色荧光蛋白的重组表达载体1300FP635构建流程图。

图2为本发明ZZ1种子启动子的重组表达载体1300FP635-ZZ1构建流程图。

图3和图4分别为本发明实施例5中1300FP635-ZZ1转基因水稻种子荧光检测结果。

图5为本发明实施例6中PCR检测荧光和非荧光T1代植株基因型结果(靶基因为深红色荧光蛋白基因，扩增条带为432bp)。

图6为本发明实施例6中PCR检测荧光和非荧光T1代植株基因型结果(靶基因为潮霉素基因，扩增条带为561bp)。

图5和图6中，M为DNA分子量标准，1：模板为水；2：非转基因植株DNA；3：重组表达载体1300FP635-ZZ1；4-8：转基因T1代荧光种子植株；9-13：转基因T1代非荧光种子植株。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本发明中使用的载体1300GUSplus由海南波莲水稻基因科技有限公司提供，该载体已公开于水稻根系发育调控基因OsAIMl的克隆与功能研究，徐磊，浙江大学，2012年。

实施例1构建深红色荧光蛋白TurboFP635的重组表达载体1300FP635

1、深红色荧光蛋白TurboFP635的合成

人工合成深红色荧光蛋白基因序列时，在起始密码子ATG前带有与载体1300GUSplus重复序列ctagaggatccacggtacc，且带NcoI酶切位点。在终止密码子TGA后带有与载体1300GUSplus重复序列atcaacaactctcctggcgcaccatcgtcggctacagcctcgggaattgctaccgagctcgaatttccccgatcgttc，且带SacI酶切位点。为一步法构建到载体设计。

2、设计PCR TurboFP635引物

引物设计使用Gibson Assembly方法，扩增产物插入到1300GUSplus载体NcoI和SacI酶切位点。扩增TurboFP635基因引物如序列SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。

PCR反应体系(100μ1)：

DNA模板:3μ1(50ng)

KOD聚合酶(购自东洋纺公司):2μ1

10×buffer:10μl

正向引物:3μ1(10μM)

反向引物:3μl(10μM)

dNTP:10μl(10mM)

MgSO₄:4μl

1/10DMSO:20μl

H₂O:45μl

PCR程序:预变性95℃4min；变性94℃30s，退火55-65℃30s，延伸68℃1min，35个循环；延伸68℃10min。

3、构建TurboFP635的重组表达载体1300FP635

构建流程见图1，将扩增产物插入到1300GUSplus载体NcoI和SacI酶切位点。引物SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9扩增PCR产物，用1％琼脂糖凝胶电泳回收704bp左右扩增产物。NcoI及SacI酶切载体1300GUSplus，回收线性酶切载体。

2×连接试剂盒连接深红色荧光蛋白TurboFP635到载体1300GUSplus，10μl体系如下：

2.5μ1TurboFP635PCR产物(50ng)

2.5μ1酶切载体(100ng)

5μ1Ligation Mix

连接程序：50℃60min。

转化：取上述连接产物5μ1电击转化大肠杆菌感受态细胞。挑选阳性克隆测序，命名为1300FP635。

实施例2水稻种子特异性启动子ZZ1的克隆

1、水稻基因组DNA的提取

根据植物DNA分离试剂盒(成都福际生物技术有限公司)方法说明提取水稻基因组DNA。基因组来源于水稻日本晴品种新鲜叶子。提取的基因组DNA分装保存-20℃备用。

2、设计扩增ZZ1的PCR引物

引物设计使用Gibson Assembly方法，扩增产物插入到1300FP635载体NcoI酶切位点。扩增ZZ1基因引物如序列SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5所示。其中上下游引物5’端均有15个左右核苷酸序列与载体相应连接位置重复，以便Gibson Assembly连接。

PCR反应体系(100μ1)：

DNA模板:3μ1(50ng)

KOD聚合酶(购自东洋纺公司):2μ1

10×buffer:10μl

正向引物:3μ1(10μM)

反向引物:3μl(10μM)

dNTP:10μl(10mM)

MgSO₄:4μl

1/10DMSO:20μl

H₂O:45μl

PCR程序:预变性95℃4min；变性94℃30s，退火55-65℃30s，延伸68℃2min 30s，35个循环；延伸68℃10min。

水稻种子特异性启动子ZZ1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

实施例3构建种子特异性启动子ZZ1的重组表达载体1300FP635-ZZ1

构建流程见图2，将实施例2扩增产物插入到1300FP635载体NcoI酶切位点。

引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:5扩增PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳回收2008bp左右产物。NcoI酶切载体1300FP635，回收线性酶切载体。

2×连接试剂盒连接种子特异性启动子ZZ1到载体1300FP635。

10ul体系如下：

2.5μ1ZZ1PCR产物(50ng)

2.5μ1酶切载体(100ng)

5μ1Ligation Mix

连接程序：50℃60分钟。

转化：取上述连接产物2μ1电击转化大肠杆菌感受态细胞。挑选阳性克隆测序。命名为1300FP635-ZZ1。1300FP635载体含有深红色荧光蛋白FP635基因，其序列如SEQ ID NO:2所示，在荧光显微镜下呈现红色，用于检测特异性表达与PCR检测荧光和非荧光T1代植株基因型。1300FP635-ZZ1载体含有潮霉素基因，其序列如SEQ ID NO:10，用于PCR检测荧光和非荧光T1代植株基因型。

实施例4转基因1300FP635-ZZ1的水稻的获得

取-70℃保存的农杆菌EHA105于含Kan(50μg/ml)+Rif(25μg/ml)+链霉素(50μg/ml)平板划线，28℃培养。挑取单菌落接种于50ml YEB液体培养基中，28℃220rpm振荡培养12-16hr。取2ml菌液转接于100ml(含有抗生素)YEP液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.5。冰上预冷10分钟，5000rpm离心10min(冷冻离心机预冷到4℃)。无菌去离子水洗2次(每次10ml)，10％甘油洗1次溶于3ml10％甘油中。取100μl感受态细胞加1μl实施例3中制备的1300FP635-ZZ1质粒，2.5KV电击转化。在含有卡那霉素和利福平的YEP培养板上28℃培养，挑选阳性克隆，用1300FP635载体特异性引物SEQ ID NO:6-7PCR验证。

验证正确的克隆，通过农杆菌介导的遗传转化法侵染水稻‘中花11’(参见Hiei YOhta S,Komari T,Kumashiro T(1994)Efficienttransformation of rice(Oryza sativaL.)mediated by Agrobacteriumand sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.The Plant Journal6:271-282)。经共培养、筛选、分化、生根等步骤获取T0代转基因幼苗，提取DNA，经PCR验证(引物SEQ ID NO:6-7)的转基因阳性植株，自交结实获得T1代。取T1植株进行后续分析。

实施例5转基因植株种子的检测分析

通过转基因植株结实，收获转基因种子，利用荧光显微镜观察种子发荧光情况。‘中花11’为对照。带有荧光的种子在荧光显微镜下可呈现深红色，与‘中花11’有明显的区别，结果如图3所示。拨开颖壳，肉眼可看出种子呈红色，结果如图4所示。

实施例6检测水稻转基因荧光和非荧光T1代植株基因型

由重组植物表达载体1300FP635-ZZ1的转基因植株，收获T1代种子。荧光种子与非荧光种子各10粒，清水浸泡发芽，获取叶片DNA(各5株)，分别在荧光显微镜下观察荧光和非荧光植株(图4)，并利用PCR法检测基因型，PCR引物SEQ ID NO:6-7用于检测转基因深红色荧光蛋白FP635，检测结果见图5，PCR引物SEQ ID NO:11-12用于检测转基因植株中的潮霉素基因，检测结果见图6。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 利用深红色荧光蛋白标记植物种子的方法

<130> KHP161117835.7Q

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2008

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 1

gtgatcccag cgcttcactt agaatggttt ttcatagcat taaatgatat gccacgtagg 60

aaaaaacatg atgtgccatt ttattaactt aggaaagaga agaaaattgg gtcttctcaa 120

aatgatcatc atctaacaaa atgtctcttt gtttatttgt gcaaagagta aatgtgcatc 180

gtgcaatgtc atgcatgctg ccaaccaaga ttaatttcta tttagttgaa cctgtgcaac 240

atttaaagtg tgaagtaatt tttgttggac ttgaagcgac aaagcacctt ggtcgattag 300

gccatcccca acccatggtg tccatgggtg gtgtctagag cagtgagaga tcaataaatg 360

catatatgga cactacctcc ccattgcatc gtttatatac cagttttcat aggcaaaaaa 420

aaattagtag ctctttgcat gtaacattaa cagaggaggg tcagctgtgg caagcaagca 480

agcagacgcg ggaggggagg cgcgcagcag gcatggtgac ggggtagggc gcagcggatc 540

gagatgcgag gatttttttt tgggggggtg gggtgggggg agagaaacga gtcatccaac 600

ccaacgcgga tttagctagt ttccagtgcc ttggaacagc cgccgaaacg gtgtcgcgca 660

tgcgacctgg tttctatgtt tttgcttctt tctcttcttt tattccgttg ccacatcaac 720

tttttgtcta gttggcagcc taattaattc tatggaaacc aggtgacatg gagggttggg 780

gacatggtgg aaaaaaccgg aacgggccga cagttcaacc ggaaaaaacc agaacccgtt 840

cagttcaaaa gaaagaccgg acatgcatat gacccgcttt gaaccggcag aaccggtcgg 900

tttttctatg aaccggtcat taaaccgtcc ccggttagac cgaacaagcc acaataatct 960

tgaaatgggc cttgatgtgg cccaattggt ctgcctagag cgttttggtt ggcaaaaatc 1020

aatctcctat tctcggcacg tgtgatatac aatggtaagt gagatataca attctcggca 1080

cggctacatt acaaggtgtc gcattgtgtc aatgtttggt taatttgcta gattcacata 1140

atacatgcca ggaagttcag aacaatgtgt tgcctttcac cggaaaactt tgttggagca 1200

aatgccttct tcttttttgc ttctgcttct tgagtccatg tggaggaagc agtagatagc 1260

tgatgatatc aggattcctt ctgtgtctgt gtaggtgtag caacaccact ataattttta 1320

tttagcaaca caatatcaat ttggtctata aaagtatgaa ttaaatcaat ccccaaccac 1380

aattagagta agttggtgag ttattgtaaa gctctgcaaa gttaatttaa aagttattgc 1440

attaacttat ttcgtatcac aaacaagttt tcacaagagt attaatggaa caatgaaaac 1500

cattgaacat actataattt tttttcttac tgaaattata taattcaaag agcataaacc 1560

cacacagtcg taaagttcca cgtgtagtgc attatcaaaa taatagctta caaaacataa 1620

caaacttagt ttcaaaagtt gcaatcctta tcacattgac acataaagtg agcgatgagt 1680

catgtcatta tttttttgct caccatcatg tatatatgat gggcataaaa gttactttga 1740

tgatgatatc aaagaacatt tttaggtgca cctaacagaa tatccaaata atatgactca 1800

cttagatcct aatatagcat caagcaaaac taacactcta aagcaaccga tagggaaaca 1860

tctataaata gacaagcata atgaaaaccc tcctcatcct tcacacaatt caaacattat 1920

agttgaagca tagtagtaga atcctacaaa aatgaagatc attttcgtat ttgctctcct 1980

tgctattgtt gcatgcaacg cttctgca 2008

<210> 2

<211> 708

<212> DNA

<213> 深红色荧光蛋白

<400> 2

atggtgggtg aggatagcgt gctgatcacc gagaacatgc acatgaaact gtacatggag 60

ggcaccgtga acgaccacca cttcaagtgc acatccgagg gcgaaggcaa gccctacgag 120

ggcacccaga ccatgaagat caaggtggtc gagggcggcc ctctcccctt cgccttcgac 180

atcctggcta ccagcttcat gtacggcagc aaaaccttta tcaaccacac ccagggcatc 240

cccgacttct ttaagcagtc cttccctgag ggcttcacat gggagaggat caccacatac 300

gaagacgggg gcgtgctgac cgctacccag gacaccagcc tccagaacgg ctgcctcatc 360

tacaacgtca agatcaacgg ggtgaacttc ccatccaacg gccctgtgat gcagaagaaa 420

acactcggct gggaggccag caccgagatg ctgtaccccg ctgacagcgg cctgagaggc 480

catagccaga tggccctgaa gctcgtgggc gggggctacc tgcactgctc cctcaagacc 540

acatacagat ccaagaaacc cgctaagaac ctcaagatgc ccggcttcta cttcgtggac 600

aggagactgg aaagaatcaa ggaggccgac aaagagacct acgtcgagca gcacgagatg 660

gctgtggcca ggtactgcga cctgcctagc aaactggggc acagctga 708

<210> 3

<211> 235

<212> PRT

<213> 深红色荧光蛋白

<400> 3

Met Val Gly Glu Asp Ser Val Leu Ile Thr Glu Asn Met His Met Lys

1 5 10 15

Leu Tyr Met Glu Gly Thr Val Asn Asp His His Phe Lys Cys Thr Ser

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Met Lys Ile Lys

35 40 45

Val Val Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Thr

50 55 60

Ser Phe Met Tyr Gly Ser Lys Thr Phe Ile Asn His Thr Gln Gly Ile

65 70 75 80

Pro Asp Phe Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg

85 90 95

Ile Thr Thr Tyr Glu Asp Gly Gly Val Leu Thr Ala Thr Gln Asp Thr

100 105 110

Ser Leu Gln Asn Gly Cys Leu Ile Tyr Asn Val Lys Ile Asn Gly Val

115 120 125

Asn Phe Pro Ser Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Gly Trp

130 135 140

Glu Ala Ser Thr Glu Met Leu Tyr Pro Ala Asp Ser Gly Leu Arg Gly

145 150 155 160

His Ser Gln Met Ala Leu Lys Leu Val Gly Gly Gly Tyr Leu His Cys

165 170 175

Ser Leu Lys Thr Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Pro Ala Lys Asn Leu Lys

180 185 190

Met Pro Gly Phe Tyr Phe Val Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ile Lys Glu

195 200 205

Ala Asp Lys Glu Thr Tyr Val Glu Gln His Glu Met Ala Val Ala Arg

210 215 220

Tyr Cys Asp Leu Pro Ser Lys Leu Gly His Ser

225 230 235

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctagaggatc cacggtacgt gatcccagcg cttcacttag 40

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctatcctca cccactgcag aagcgttgca tgcaac 36

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctctcccctt cgccttcgac at 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agtagaagcc gggcatcttg ag 22

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctagaggatc cacggtacca tgg 23

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaacgatcgg ggaaattcga gctc 24

<210> 10

<211> 810

<212> DNA

<213> 潮霉素基因

<400> 10

gaccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gacacgctga aatcaccagt 60

ctctctctac aaatctatct ctctcgagct ttcgcagatc cgggggggca atgagatatg 120

aaaaagcctg aactcaccgc gacgtctgtc gagaagtttc tgatcgaaaa gttcgacagc 180

gtctccgacc tgatgcagct ctcggagggc gaagaatctc gtgctttcag cttcgatgta 240

ggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat agctgcgccg atggtttcta caaagatcgt 300

tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg ctcccgattc cggaagtgct tgacattggg 360

gagtttagcg agagcctgac ctattgcatc tcccgccgtg cacagggtgt cacgttgcaa 420

gacctgcctg aaaccgaact gcccgctgtt ctacaaccgg tcgcggaggc tatggatgcg 480

atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc gggttcggcc cattcggacc gcaaggaatc 540

ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata tgcgcgattg ctgatcccca tgtgtatcac 600

tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt gcgtccgtcg cgcaggctct cgatgagctg 660

atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc cggcacctcg tgcacgcgga tttcggctcc 720

aacaatgtcc tgacggacaa tggccgcata acagcggtca ttgactggag cgaggcgatg 780

ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac 810

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cttagccaga cgagcgggtt c 21

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcttctgcgg gcgatttgt 19

Claims (10)

1.深红色荧光蛋白TurboFP635基因表达盒，其特征在于，所述表达盒中包括植物种子特异性启动子及其下游的深红色荧光蛋白FP635基因。

2.根据权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述植物种子特异性启动子包括水稻、玉米、高梁、大麦、燕麦、小麦、粟、甘蔗、大豆、芸苔属物种、棉花、红花、烟草、苜蓿和向日葵的种子特异性启动子。

3.根据权利要求1或2所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒由水稻种子特异性启动子及其下游的深红色荧光蛋白FP635基因组成；其中，所述水稻种子特异性启动子和深红色荧光蛋白FP635基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。

4.含有权利要求1-3任一项所述表达盒的载体。

5.含有权利要求1-3任一项所述表达盒或权利要求4所述载体的宿主细胞及工程菌。

6.权利要求1-3任一项所述表达盒或权利要求4所述载体在制备转基因植物以及转基因植物种子标记中的应用。

7.深红色荧光蛋白TurboFP635在转基因植物筛选以及植物种子标记中的应用。

8.利用深红色荧光蛋白标记植物种子的方法，其特征在于，将权利要求4所述的载体转化目标植物，筛选得到的转基因植株自交，结实产生带荧光标记的种子；其中，所述植物包括水稻、玉米、高梁、大麦、燕麦、小麦、粟、甘蔗、大豆、芸苔属物种、棉花、红花、烟草、苜蓿和向日葵；优选水稻。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、重组表达载体1300FP635-ZZ1的构建

S11、中间载体1300FP635的构建：人工合成深红色荧光蛋白TurboFP635基因序列时，在起始密码子前添加与载体1300GUSplus重复序列ctagaggatccacggtacc，并添加NcoI酶切位点；在终止密码子后添加与载体1300GUSplus重复序列atcaacaactctcctggcgcaccatcgtcggctacagcctcgggaattgctaccgagctcgaatttccccgatcgttc，并添加SacI酶切位点；利用Gibson Assembly法，将构建好的TurboFP635基因序列插入到1300GUSplus载体NcoI和SacI酶切位点之间，得到中间载体1300FP635；

S12、水稻种子特异性启动子的克隆：提取水稻基因组DNA，设计引物序列如SEQ ID NO:4和5所示，通过PCR反应扩增得到水稻种子特异性启动子；

S13、利用Gibson Assembly法，将S12的扩增产物插入到1300FP635载体NcoI酶切位点，即得重组表达载体1300FP635-ZZ1；

S2、遗传转化及转基因植株的获得

S21、农杆菌的制备：取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/ml Kan+25μg/ml Rif+50μg/ml链霉素的平板划线，28℃培养；挑取单菌落接种于50ml YEB液体培养基中，28℃220rpm振荡培养12-16hr；取2ml菌液转接于含有抗生素的100ml YEP液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.5；冰上预冷10分钟，5000rpm离心10min；然后用无菌去离子水洗2次，10％甘油洗1次，溶于3ml10％甘油中；取100μl感受态细胞加入1μl重组表达载体1300FP635-ZZ1，2.5KV电击转化；在含有卡那霉素和利福平的YEP培养板上28℃培养，挑选阳性克隆；

S22、验证正确的克隆，通过农杆菌介导的遗传转化法侵染水稻‘中花11’，经共培养、筛选、分化、生根步骤之后，得到T0代转基因幼苗，提取DNA，经PCR验证的转基因阳性植株；

S3、转基因植株自交结实，收获转基因种子，在荧光显微镜下观察种子呈深红色。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤S22中PCR验证使用的引物序列如SEQID NO:6和7所示。