CN105294863A - 双功能抗体及其用途 - Google Patents
双功能抗体及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105294863A CN105294863A CN201510782939.2A CN201510782939A CN105294863A CN 105294863 A CN105294863 A CN 105294863A CN 201510782939 A CN201510782939 A CN 201510782939A CN 105294863 A CN105294863 A CN 105294863A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bifunctional antibody
- moderate
- antibody
- tnf
- severe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 title claims abstract description 92
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims abstract description 32
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims abstract description 29
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 208000003456 Juvenile Arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 206010059176 Juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 201000002215 juvenile rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 abstract description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 abstract description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 abstract 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 102000015689 E-Selectin Human genes 0.000 description 5
- 108010024212 E-Selectin Proteins 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 description 4
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 3
- MJZJYWCQPMNPRM-UHFFFAOYSA-N 6,6-dimethyl-1-[3-(2,4,5-trichlorophenoxy)propoxy]-1,6-dihydro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound CC1(C)N=C(N)N=C(N)N1OCCCOC1=CC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl MJZJYWCQPMNPRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 229960002964 adalimumab Drugs 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000013326 plasmid cotransfection Methods 0.000 description 3
- 230000001185 psoriatic effect Effects 0.000 description 3
- 229960003824 ustekinumab Drugs 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 229940071598 stelara Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002682 anti-psoriatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 229940048921 humira Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000010503 organ complication Effects 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了一种三种双功能抗体,本发明的三种双功能抗体能够与人TNF-α特异性结合;同时3种双功能抗体能够与人P40特异性结合。所述三种双功能抗体均能够十分有效地阻断人IL-12与IL-12受体的结合,并且均能够十分有效地阻断人TNF-α与TNF-α受体的结合。本发明三种双功能抗体能够同时结合人TNF-α和人P40蛋白,能有效地抑制TNF-α和IL-12与相应受体的结合,从而分别抑制炎症细胞因子和IFNgamma分子的分泌,能够用于治疗类风湿性关节炎、慢性斑块型银屑病、中度至重度克罗恩病、中度至重度溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、中度至重度多关节型幼年特发性关节炎、克罗恩病儿科患者。
Description
技术领域
本发明涉及抗体,具体涉及能够同时阻断人TNF-α与TNF-α受体的结合和阻断人IL-12与IL-12受体的结合的双功能抗体。
背景技术
Humira(Adalimumab)是在中国仓鼠卵巢细胞中表达的重组全人源化肿瘤坏死因子α单克隆抗体。除了中度至重度类风湿性关节炎,FDA已批准的适应症还包括中度至重度慢性斑块型银屑病,中度至重度克罗恩病、中度至重度溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、中度至重度多关节型幼年特发性关节炎、克罗恩病儿科患者的治疗用途。2013年,在全球十大畅销品牌药物中,阿达木单抗销售额为106.6亿美元、增长率为15.0%,排名第一。
单抗药物Stelara(ustekinumab)作用于IL-12和IL-23的共同亚基P40,通过阻断IL-12和IL-23的下游信号通路从而起到抗银屑病的作用。Stelara于2009年被美国FDA批准,用于治疗成年人中重度银屑病。一项针对中度至重度银屑病患者III期临床研究显示,p40单抗更具治疗优势,且所需注射次数远少于依那西普。据皮肤性病欧洲科学院第17次会议报道:分别接受p40单抗(低剂量45mg和高剂量90mg两组)和依那西普进行为期12周的治疗,p40单抗组在治疗开始和第4周共给药2次,依那西普组每周给药2次。结果显示,银屑病严重程度缓解率达到75%者,p40单抗45mg和90mg剂量组分别为68%和74%,而依那西普组为57%。
单克隆抗体的作用靶点是针对单一某个靶点,而大量的复杂性疾病,如肿瘤、类风湿关节炎、肿瘤、自身免疫病、代谢性疾病的器官并发症、老年退行性病变等有多种发病机制,且各种发病机制可相互影响,有时呈网络状,共同导致了疾病的发生。针对某一疾病单一靶点的单克隆抗体药效有限。双功能抗体对此疾病发病过程中最重要的发病机理(信号通路)同时干预,有望获得药效的相加或协同,取得更好地临床疗效。针对TNF-α和P40同时干预和阻断,有望在银屑病治疗方面相对于单一靶点干涉取得更好地疗效。因此目前需要开发同时拮抗TNF-α和抗P40的双功能抗体。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了三种双功能抗体,所述三种抗体既能阻断人TNF-α与TNF-α受体的结合,还能阻断人IL-12与IL-12受体的结合,本发明还提供所述三种双功能抗体的用途。
为实现上述目的,所采取的技术方案:一种双功能抗体,所述双功能抗体包括2条相同的轻链和2条相同的重链,所述轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示,所述重链的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。将这里所述的双功能抗体命名为双功能抗体BIAU003。
一种双功能抗体,所述双功能抗体包括2条相同的轻链和2条相同的重链,所述轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示,所述重链的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。将这里所述的双功能抗体命名为双功能抗体BIAU022。
一种双功能抗体,所述双功能抗体包括2条相同的轻链和2条相同的重链,所述轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示,所述重链的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。将这里所述的双功能抗体命名为双功能抗体BIAU023。
本发明提供了上述所述的三种双功能抗体在制备用于阻断人TNF-α与TNF-α受体的结合和/或阻断人IL-12与IL-12受体的结合的制剂中的用途。
本发明还提供了上述所述的三种双功能抗体在制备治疗类风湿性关节炎、慢性斑块型银屑病、中度至重度克罗恩病、中度至重度溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、中度至重度多关节型幼年特发性关节炎或克罗恩病儿科患者的药物中的用途。
本发明的有益效果在于:本发明提供了一种三种双功能抗体,本发明的3种双功能抗体能够与人TNF-α特异性结合;同时3种双功能抗体能够与人P40特异性结合。所述三种双功能抗体均能够十分有效地阻断人IL-12与IL-12受体的结合,并且均能够十分有效地阻断人TNF-α与TNF-α受体的结合。本发明的3种双功能抗体能够同时结合人TNF-α和人P40蛋白,能有效地抑制TNF-α和IL-12与相应受体的结合,从而分别抑制炎症细胞因子和IFNgamma分子的分泌,能够用于治疗类风湿性关节炎、慢性斑块型银屑病、中度至重度克罗恩病、中度至重度溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、中度至重度多关节型幼年特发性关节炎、克罗恩病儿科患者。
附图说明
图1为本发明所述双功能抗体BIAU003的结构示意图;
图2为本发明所述双功能抗体BIAU022的结构示意图;
图3为本发明所述双功能抗体BIAU023的结构示意图;
图4为本发明实施例4中ELISA方法检测本发明双功能抗体BIAU003、BIAU022和BIAU023对p40的结合能力(A),和对TNF-α结合能力(B)的结果;
图5为本发明实施例5中本发明双功能抗体BIAU003、BIAU022和BIAU023抑制TNF-α诱导的细胞表面粘附分子ELAM-1表达的结果;
图6为本发明实施例6中本发明双功能抗体BIAU003、BIAU022和BIAU023抑制IL-12诱导的IFNgamma分泌的结果;
图7为本发明双功能抗体BIAU003、BIAU022和BIAU023对银屑病小鼠皮肤增厚的抑制结果。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本发明所述双功能抗体BIAU003的轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示,所述双功能抗体BIAU003的重链的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示;本发明所述双功能抗体BIAU022的轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示,所述双功能抗体BIAU003的重链的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示;本发明所述双功能抗体BIAU003的轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示,所述双功能抗体BIAU003的重链的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。
本发明所述双功能抗体BIAU003的结构示意图如图1所示,其中重链由以下部分构成:第一抗体的重链可变区-第一抗体重链恒定区-氨基酸linker-第二抗体重链可变区-氨基酸linker-第二抗体轻链可变区;即第一抗体的完整重链与第二抗体重链可变区-第二抗体轻链可变区通过氨基酸连接起来。轻链由以下部分构成:第一抗体的完整轻链。
本发明所述双功能抗体BIAU022的结构示意图如图2所示,其中重链由以下部分构成:第二抗体的重链可变区-氨基酸linker-第一抗体重链可变区-第一抗体重链恒定区;即第二抗体的重链可变区与第一抗体完整重链通过氨基酸连接起来。轻链由以下部分构成:第二抗体的轻链可变区-氨基酸linker-第一抗体轻链可变区-第一抗体轻链恒定区;即第二抗体的轻链可变区与第一抗体完整轻链通过氨基酸连接起来。
本发明所述双功能抗体BIAU023的结构示意图如图3所示,其中重链由以下部分构成:第一抗体的完整重链-氨基酸linker-第二抗体重链可变区-第二抗体轻链恒定区-氨基酸linker-第二抗体轻链可变区-第二抗体重链恒定区1;轻链由以下部分构成:第一抗体完整轻链。
上述所述第一抗体为ustekinumab,第二抗体为adalimuma。
实施例1:本发明双功能抗体BIAU003、BIAU022和BIAU023的蛋白制备
根据双功能抗体BIAU003、BIAU022和BIAU023的重链和轻链氨基酸序列,分别人工合成双功能抗体BIAU003、BIAU022和BIAU023的重链和轻链的cDNA。所有cDNA均经过密码子优化,可用于哺乳动物细胞表达。将合成的cDNA分别克隆到pcDNA3.1质粒中,并通过测序确定质粒构建正确。测序完的质粒转化TOP10菌株,挑取单菌落,接种到0.5升LB液体培养基,至OD600为0.8时,离心收集菌体,用质粒大提试剂盒(购自Qiagen公司)提取质粒。将测序鉴定正确的含有双功能抗体BIAU003的轻链的质粒和测序鉴定正确的含有双功能抗体BIAU003的重链的质粒共转染到同一个293F细胞中,将测序鉴定正确的含有双功能抗体BIAU022的轻链的质粒和测序鉴定正确的含有双功能抗体BIAU022的重链的质粒共转染到另一个293F细胞中,将测序鉴定正确的含有双功能抗体BIAU023的轻链的质粒和测序鉴定正确的含有双功能抗体BIAU023的重链的质粒共转染到另一个293F细胞中。转染细胞培养条件为37℃,5%CO2,130rpm/min培养7天后,离心收集上清。将上清6000rpm离心10min,并用0.45μm滤膜过滤,收集滤液;滤液加入500mMNaCl;调整PH至7.4。样品经0.2μm滤膜再次过滤后,上样至已用PBS平衡好的HiTrapMabSelect柱(购自GE公司);待样品上完后用PBS冲洗,流速5ml/min,紫外监测为水平。接着用洗脱Buffer(0.5MGlycine,pH3.0)洗脱,流速1ml/min,收集流出峰用Tris中和至pH为7.4。用超滤浓缩管浓缩洗脱峰,用脱盐柱换缓冲溶液至PBS中,由此得到BIAU003、BIAU022、BIAU023共3种双功能抗体。
实施例2:SPR测定本发明双功能抗体BIAU003、BIAU022和BIAU023的结合抗原能力
通过SPR分析(购自GE公司)对p40和TNF-α亲和力及结合动力学。利用标准胺偶联化学和由GE公司提供的芯片,经伯胺将p40或TNF-α共价连接至芯片(羧甲基右旋糖酐包被的芯片)。利用生物素标记试剂盒(Pierce公司)将重组融合蛋白与生物素共价偶联,然后流过亲和素标记的SA芯片(购自GE公司),使反应值RU达到450。通过将抗体以0.01、0.03、0.09、0.27μM的浓度和50μl/min的流速在PBS缓冲液中流动而测量结合和解离常数。追踪抗原-抗体结合动力学3分钟并追踪解离动力学10分钟。使用BIAEvaluation软件将结合和解离曲线拟合至1:1朗格缪尔(Langmuir)结合模型,测定结果表明:BIAU003、BIAU022、BIAU023均能够结合p40和TNF-α。测定的Kd、Kon和Koff值结果见表一和表二。
表一SPR测定本发明双功能抗体结合抗原p40能力结果
抗体名称 | Kon(105M-1S-1) | Koff(10-5S-1) | Kd(nm) |
BIAU003 | 1.87 | 2.02 | 0.11 |
BIAU022 | 1.74 | 2.19 | 0.13 |
BIAU023 | 0.87 | 2.96 | 0.34 |
表二SPR测定本发明双功能抗体结合抗原TNF-α能力结果
抗体名称 | Kon(105M-1S-1) | Koff(10-5S-1) | Kd(nm) |
BIAU003 | 1.42 | 2.13 | 0.15 |
BIAU022 | 2.78 | 3.29 | 0.12 |
BIAU023 | 0.65 | 1.01 | 0.16 |
实施例3:竞争ELISA方法测定本发明双功能抗体BIAU003、BIAU022和BIAU023与TNF-α受体竞争结合抗原TNF-α
用TNF-α-mFc包被酶标板,1%BSA封闭,分别将不同浓度的抗体BIAU003、BIAU022、BIAU023与TNF-α受体-hFc混合,37℃孵育后加入酶标二抗37℃孵育30分钟。在酶标仪上检测450nm的吸光值。双功能抗体与抗原TNF-α结合结果显示,本发明双功能抗体BIAU003、BIAU022、BIAU023均能有效地与TNF-α受体竞争结合TNF-α蛋白,并且其结合效率呈剂量依赖关系。通过对结合的双功能抗体的竞争ELISA结果分析,曲线模拟双功能抗体BIAU003、BIAU022、BIAU023的拮抗TNF-α受体与抗原TNF-α结合效率IC50分别为:0.5nm、2.3nm、1.8nm。
实施例4:本发明双功能抗体BIAU003、BIAU022和BIAU023结合抗原能力检测
本发明4价双功能抗体BIAU003、BIAU022和BIAU023能靶向同时结合p40和TNF-α蛋白。实验采用ELISA方法检测双功能抗体对这个两个抗原的结合能力。首先分别包被2μg/ml的抗原,4度包被过夜,用PBST洗涤3次去除未结合的抗原后,直接加入不同浓度的双功能抗体,室温孵育2小时。孵育完毕后,PBST洗涤3次,以清洗去没有结合抗原的抗体。然后加入抗Histag标签的二抗(HRP标记)孵育1小时。PBST清洗3次后,用DAB法显色,然后用多功能酶标仪进行读数。如图4数据显示,本发明双功能抗体BIAU003、BIAU022和BIAU023与阳性抗体都具有对各自抗原很强的结合能力(图4A为结合p40,图4B为结合TNF-α)。
实施例5:本发明双功能抗体BIAU003、BIAU022和BIAU023抑制ELAM-1蛋白表达
细胞表面粘附分子ELAM-1表达受TNF-α调控,粘附分子的调控是TNF-α生物学效应的重要体现。本实验研究阻断TNF-α通路后,细胞表达ELAM-1蛋白的情况。接种2×105/孔HUVEC细胞于6孔板中,细胞贴壁后,分别加入10ng/ml和不同浓度的本发明双功能抗体BIAU003、BIAU022和BIAU023,然后置于细胞培养箱中继续培养24h。24h后,胰酶消化细胞并用PBS洗涤后置于冰上,然后加入FITC标记的抗ELAM-1抗体,孵育30min。然后用流式细胞仪进行细胞表面荧光强度分析,对流式细胞仪的荧光强度数据用Prism软件进行换算并作图。如图5结果显示本发明双功能抗体BIAU003、BIAU022和BIAU023都可以完全阻断TNF-α诱导的ELAM-1蛋白表达,阻断的程度与双功能抗体浓度有剂量依赖关系(图5)
实施例6:本发明双功能抗体BIAU003、BIAU022和BIAU023抑制IFNgamma的分泌
本发明双功能抗体BIAU003、BIAU022和BIAU023能靶向结合细胞因子IL-12的p40亚基,从而抑制IL-20的生物学功能。本实验检测本发明双功能抗体BIAU003、BIAU022和BIAU023能否抑制IL-12调控的IFNgamma表达。纯化的T细胞在含细胞因子IL-2的培养基中培养3天进行活化和增殖,第4天时,按1×105/孔的密度接种T细胞于96孔板中,按设置的浓度加入本发明双功能抗体BIAU003、BIAU022和BIAU023。然后置于37度二氧化碳培养箱培养24小时。24小时后收集细胞培养基,离心取上清。取10ul上清进行IFNgamma定量分析,按照定量试剂盒的说明方法进行实验,实验结果用多功能酶标仪进行读数。如图6结果表明T细胞在IL-2和IL-12作用下显著分泌IFNgamma,随着本发明双功能抗体浓度的增加,其对IFNgamma的分泌抑制越明显,而单独的IL-2刺激并不能诱导T细胞分泌IFNgamma(图6)
实施例7:本发明双功能抗体BIAU003、BIAU022和BIAU023对银屑病小鼠的药效
采用DBA-1小鼠,背部皮下注射重组人IL-12(30μg)联合重组人TNF-α(10μg)诱导小鼠产生银屑病病变。首次皮下注射人IL-12和TNF-α前1天给予BiAU003,BiAU022,BiAU02320mg/kg,连续注射3天,第4天取背部皮肤固定,HE染色后观察银屑病小鼠表皮厚度。
小鼠表皮厚度如图7所示。由图可见,BiAU003,BiAU022,BiAU023均能有效地降低小鼠表皮厚度,药效优于单独Ustekinumab和Adalimumab组。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种双功能抗体,其特征在于,所述双功能抗体包括2条相同的轻链和2条相同的重链,所述轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示,所述重链的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
2.一种双功能抗体,其特征在于,所述双功能抗体包括2条相同的轻链和2条相同的重链,所述轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示,所述重链的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。
3.一种双功能抗体,其特征在于,所述双功能抗体包括2条相同的轻链和2条相同的重链,所述轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示,所述重链的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。
4.如权利要求1所述的双功能抗体在制备用于阻断人TNF-α与TNF-α受体的结合和/或阻断人IL-12与IL-12受体的结合的制剂中的用途。
5.如权利要求2所述的双功能抗体在制备用于阻断人TNF-α与TNF-α受体的结合和/或阻断人IL-12与IL-12受体的结合的制剂中的用途。
6.如权利要求3所述的双功能抗体在制备用于阻断人TNF-α与TNF-α受体的结合和/或阻断人IL-12与IL-12受体的结合的制剂中的用途。
7.如权利要求1所述的双功能抗体在制备治疗类风湿性关节炎、慢性斑块型银屑病、中度至重度克罗恩病、中度至重度溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、中度至重度多关节型幼年特发性关节炎或克罗恩病儿科患者的药物中的用途。
8.如权利要求2所述的双功能抗体在制备治疗类风湿性关节炎、慢性斑块型银屑病、中度至重度克罗恩病、中度至重度溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、中度至重度多关节型幼年特发性关节炎或克罗恩病儿科患者的药物中的用途。
9.如权利要求3所述的双功能抗体在制备治疗类风湿性关节炎、慢性斑块型银屑病、中度至重度克罗恩病、中度至重度溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、中度至重度多关节型幼年特发性关节炎或克罗恩病儿科患者的药物中的用途。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811282587.4A CN109293777A (zh) | 2015-11-13 | 2015-11-13 | 双功能抗体及其用途 |
CN201811283836.1A CN109400709B (zh) | 2015-11-13 | 2015-11-13 | 双功能抗体及其用途 |
CN201510782939.2A CN105294863B (zh) | 2015-11-13 | 2015-11-13 | 双功能抗体及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510782939.2A CN105294863B (zh) | 2015-11-13 | 2015-11-13 | 双功能抗体及其用途 |
Related Child Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811283836.1A Division CN109400709B (zh) | 2015-11-13 | 2015-11-13 | 双功能抗体及其用途 |
CN201811282587.4A Division CN109293777A (zh) | 2015-11-13 | 2015-11-13 | 双功能抗体及其用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105294863A true CN105294863A (zh) | 2016-02-03 |
CN105294863B CN105294863B (zh) | 2019-01-22 |
Family
ID=55192761
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811283836.1A Expired - Fee Related CN109400709B (zh) | 2015-11-13 | 2015-11-13 | 双功能抗体及其用途 |
CN201510782939.2A Expired - Fee Related CN105294863B (zh) | 2015-11-13 | 2015-11-13 | 双功能抗体及其用途 |
CN201811282587.4A Pending CN109293777A (zh) | 2015-11-13 | 2015-11-13 | 双功能抗体及其用途 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811283836.1A Expired - Fee Related CN109400709B (zh) | 2015-11-13 | 2015-11-13 | 双功能抗体及其用途 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811282587.4A Pending CN109293777A (zh) | 2015-11-13 | 2015-11-13 | 双功能抗体及其用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (3) | CN109400709B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP4008727A4 (en) * | 2019-07-30 | 2024-01-17 | Akeso Biopharma, Inc. | HUMANIZED ANTIBODY DIRECTED AGAINST THE P40 PROTEIN DOMAIN AND ITS USE |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102458471A (zh) * | 2009-05-28 | 2012-05-16 | 葛兰素集团有限公司 | 用于治疗或预防眼病的TNFα拮抗剂和VEGF拮抗剂的组合 |
CN103562221A (zh) * | 2011-03-28 | 2014-02-05 | 赛诺菲 | 具有交换结合区取向的双重可变区抗体样结合蛋白 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TW201705980A (zh) * | 2004-04-09 | 2017-02-16 | 艾伯維生物技術有限責任公司 | 用於治療TNFα相關失調症之多重可變劑量療法 |
US9399061B2 (en) * | 2006-04-10 | 2016-07-26 | Abbvie Biotechnology Ltd | Methods for determining efficacy of TNF-α inhibitors for treatment of rheumatoid arthritis |
-
2015
- 2015-11-13 CN CN201811283836.1A patent/CN109400709B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2015-11-13 CN CN201510782939.2A patent/CN105294863B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2015-11-13 CN CN201811282587.4A patent/CN109293777A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102458471A (zh) * | 2009-05-28 | 2012-05-16 | 葛兰素集团有限公司 | 用于治疗或预防眼病的TNFα拮抗剂和VEGF拮抗剂的组合 |
CN103562221A (zh) * | 2011-03-28 | 2014-02-05 | 赛诺菲 | 具有交换结合区取向的双重可变区抗体样结合蛋白 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
DANIEL A.VALLERA等: "Bioengineering a Unique Deimmunized Bispecific Targeted Toxin That Simultaneously Recognizes Human CD22 and CD19 Receptors in a Mouse Model of B-Cell Metastases", 《AACR》 * |
ROLAND KONTERMANN: "Dual targeting strategies with bispecific antibodies", 《MABS》 * |
SACHIYO OKAMOTO等: "Anti-il-12/23 p40 Antibody Attenuates Experimental Chronic Graft-versus-Host Disease via Suppression of IFN-γ/IL-17-Producing Cells", 《THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN109400709A (zh) | 2019-03-01 |
CN109293777A (zh) | 2019-02-01 |
CN105294863B (zh) | 2019-01-22 |
CN109400709B (zh) | 2021-03-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107686520A (zh) | 抗pd‑l1纳米抗体及其应用 | |
CN102164962A (zh) | 抗gd2抗体和方法及其相关应用 | |
CN101970497A (zh) | 抗-EpCAM抗体及其用途 | |
CN105461809B (zh) | Pcsk9抗体、其药物组合物及其用途 | |
CN106701688A (zh) | 杂交瘤细胞株7g11及其抗体 | |
CN105112398A (zh) | 一种杂交瘤细胞的制备及其分泌的单抗与应用 | |
CN102776153A (zh) | 鼠抗人ngal单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用 | |
CN105037554A (zh) | 抗人pcsk9抗体的制备及其用途 | |
CN101062949B (zh) | 重组抗人IgE单克隆抗体及其制备方法和用途 | |
CN102124100B (zh) | 特异结合vegf的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系与用途 | |
CN104388392B (zh) | 一种恩诺沙星单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
CN104379603B (zh) | Tlr3结合剂 | |
CN103865878A (zh) | 拮抗抑制血管内皮细胞生长因子与其受体结合的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系与用途 | |
CN114456268B (zh) | 抗胞外-5’-核苷酸酶的抗体序列 | |
CN105294863A (zh) | 双功能抗体及其用途 | |
CN103333247B (zh) | 新型抗vegfr2的单克隆抗体及其制备与应用 | |
CN108588033A (zh) | 杂交瘤细胞株、cd31单克隆抗体、制备方法及应用 | |
CN103360494B (zh) | 抗cd20的全人源单克隆抗体及其应用 | |
CN106188298A (zh) | 一种Vsig4纳米抗体及其抗原表位鉴定方法和应用 | |
CN106399294A (zh) | 一种抗人降钙素原蛋白n末端抗原表位的单克隆抗体7h8的制备 | |
CN109735503A (zh) | 一株双氯芬酸单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 | |
CN106244559A (zh) | 一种分泌抗人il‑37单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗人il‑37单克隆抗体及其应用 | |
CN113896793A (zh) | 一种抗人il-17rc的单克隆抗体及其应用 | |
CN102154218B (zh) | 杂交瘤细胞株4 e 9及其所产生的单克隆抗体 | |
CN106366189A (zh) | 一种抗人肺癌干细胞的单克隆抗体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20190122 |