CN105294561A

CN105294561A - 一种异喹啉及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN105294561A
Application number: CN201510844708.XA
Authority: CN
Inventors: 徐寒梅; 丁丹
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2015-11-27
Filing date: 2015-11-27
Publication date: 2016-02-03
Anticipated expiration: 2035-11-27
Also published as: CN105294561B

Abstract

本发明公开了一种异喹啉及其制备方法和应用，属于药物领域。本发明中的异喹啉为1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉，从蜈蚣中提取得到，可用于治疗疟疾、杀菌和实体肿瘤的治疗。所述的疟疾为寄生于人体的间日疟原虫，三日疟原虫，恶性疟原虫和卵形疟原虫；所述的菌为大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，甲/乙型溶血性链球菌，肺炎链球菌和嗜血流感杆菌；所述的肿瘤为起源于人的头颈部、脑、甲状腺、胰腺、肺脏、肝脏、食管、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、膀胱、睾丸的原发或继发的癌以及肉瘤。本发明毒副作用较小，可用于各种癌症的治疗和辅助治疗。

Description

一种异喹啉及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物领域，具体涉及从蜈蚣中提取一种新化合物1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉以及该活性物质在抗疟疾活性、抗菌活性和抗肿瘤活性药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是人类健康的首要杀手。传统肿瘤治疗虽然具有一定疗效，但由于化学药物非特异的细胞毒性，对患者具有较大的毒副作用，同时还容易产生耐药性，给肿瘤患者带来巨大痛苦。从1972年Folkman提出了肿瘤血管增生学说以来，通过抑制肿瘤血管增生来治疗肿瘤的报道大量涌现，并取得了巨大成功。肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的形态学基础。绝大多数恶性实体肿瘤如卵巢癌、肝癌、宫颈癌和乳腺癌等都是血管依赖性肿瘤。新生血管一方面为肿瘤生长提供营养和氧气，另一方面还是肿瘤转移的重要途径。因此，抑制肿瘤新生血管可以有效抑制肿瘤的发生、发展及转移。

蜈蚣为陆生节肢动物，全体共22个环节。头部暗红色或红褐色，略有光泽，有头板覆盖，头板近圆形，前端稍突出，两侧贴有颚肢一对，前端两侧有触角一对。躯干部第一背板与头板同色，其余20个背板为棕绿色或墨绿色，具光泽，自第四背板至第二十背板上常有两条纵沟线；腹部淡黄色或棕黄色，皱缩；自第二节起，每节两侧有步足一对；步足黄色或红褐色，偶有黄白色，呈弯钩形，最末一对步足尾状，故又称尾足，易脱落。质脆，断面有裂隙。气微腥，有特殊刺鼻的臭气，味辛、微咸。功能主治息风镇痉，功毒散结，通络止痛。用于小儿惊风，抽搐痉挛，中风口歪，半身不遂，破伤风，风湿顽痹，疮疡，瘰疬，毒蛇咬伤。

蜈蚣中成分复杂，含两种类似蜂毒的有毒成分，即组胺样物质及溶血性蛋白质；尚含脂肪油、胆甾醇、蚁酸等。又曾分离出δ-羟基赖氨酸；氨基酸有组氨酸、精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、牛磺酸、谷氨酸。经文献查阅，有研究者(曲爱兵，赵维诚，梁良等蜈蚣组织提取物抗肿瘤活性的初步研究[J].实用肿瘤学杂志，2003，17(1)：29-30)采用MTT法检测蜈蚣组织提取液，发现其对胃癌细胞和肝癌细胞较强的细胞毒性。还有科研工作者(王硕，覃文慧多棘蜈蚣与少棘蜈蚣抗肿瘤作用研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，13：156-158)采用相同的方法检测多棘巨蜈蚣和少棘巨蜈蚣的匀浆液对人肝癌细胞Bel-7402的作用，确证了两种蜈蚣均有较强的抗肿瘤作用。解放军第四五八医院(韩莉，周永芹，韩钰蜈蚣提取物诱导宫颈癌Hela细胞凋亡及其机制的研究[J].时珍国医国药，2007，18(9)：2109-2111)以类似方法观察蜈蚣对宫颈癌Hela细胞增殖的影响，证明蜈蚣的乙醚、乙醇提取物对Hela细胞具有显著的体外抗肿瘤活性。南京师范大学江苏省分子医学生物技术重点实验室(任文华，张双全等少棘蜈蚣水提取物的抗菌活性[J].中药材，2007，01：10-14)提取了蜈蚣水提物并确定其具有一定的抗菌活性。但是目前尚未有研究证明蜈蚣中具有抗肿瘤或抗菌活性的组分具体是哪种物质，由于蜈蚣提取物的组分复杂，而且可能还含有类似蜂毒的有毒成分，因此蜈蚣在制备抗肿瘤或抗菌药物领域中的应用一直受到限制。

抗肿瘤生物碱中大多为异喹啉类生物碱，该类生物碱应用广泛，其结构具有多样性。Rexahn公司(LeeYoungBok,AhnChang-Ho,ChoWon-Jea.Substituted3-(hetero)arylisquinolinaminederivativesfortherapeuticapplications.WO2008063548A2,2008.5.29)拥有的5,6或7取代3-氨基异喹啉衍生物可产生抗肿瘤作用，其能够显著抑制耐紫杉醇(泰素)HCT-15人结肠癌细胞荷瘤裸鼠模型肿瘤的生长。中国专利申请号为201210098631.2，申请公布日为2012年7月25日的专利申请文件公开了二氢异喹啉类化合物及其作为制备植物抗菌药物的应用，该发明中合成了一系列二氢异喹啉类化合物作为植物抗菌药物，对多种植物病原菌具有良好的抑制作用。中国专利申请号为201280041436.4，申请公布日为2014年7月16日的专利申请文件公开了一种取代的2-烷基-1-氧代-N-苯基-3-杂芳基-1,2,3,4-四氢异喹啉-4-酰胺，可用于预防和治疗疟疾。虽然目前关于异喹啉类化合物用于抗菌或抗肿瘤治疗的研究很多，关于其他结构的化合物用于抗菌或抗肿瘤治疗的研究也很多，但是蜈蚣中具体哪种组分物质具有抗肿瘤和抗菌功能一直是领域内未知的，所以研究确定蜈蚣中的活性组分物质的具体结构具有非常重要的医学价值。

发明内容

1.要解决的问题

针对现有技术中蜈蚣的活性组分不明确、应用受到限制等问题，本发明提供一种异喹啉及其提取方法和其在制备抗疟、抗菌和抗肿瘤药物中的应用，本发明中的异喹啉从蜈蚣中提取得到，经结构鉴定这种异喹啉为1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉，具有抗疟疾、抗菌和抗肿瘤的功能，首次确定了蜈蚣中活性组分的具体结构，天然无毒性，活性效果好。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种异喹啉，其分子式为C₁₀H₉NO₃，为1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉，其分子量为191.1，结构式为：

一种从蜈蚣中提取活性组分的方法，其步骤为：

a.用体积浓度为45-65％的醇溶液制备蜈蚣醇提物；

b.采用葡聚糖凝胶层析法分离纯化步骤a中的蜈蚣醇提物，收集多个组分样品，检测这些组分样品的抗肿瘤活性，抗肿瘤活性最好的组分记为组分样品A，组分样品A中含有上述的异喹啉；

优选地，步骤a中制备蜈蚣醇提物的步骤为：

(1)制备蜈蚣粉末，然后加入5-10倍蜈蚣粉末体积的PBS溶液进行超声破碎匀浆；

(2)对匀浆液进行冷冻离心，取上清液，冷冻干燥得到冻干的蜈蚣水提物；

(3)取步骤(2)中的得到的水提物加入蜈蚣粉末体积5-10倍的醇溶液进行匀浆，然后在4℃条件下浸取，醇溶液的体积浓度为45-65％；

(4)对浸取液再次冷冻离心，取上清液，冷冻干燥得到冻干的蜈蚣醇提物。

优选地，步骤b中采用葡聚糖凝胶层析法分离纯化蜈蚣醇提物的步骤为：

(1)将葡聚糖凝胶SephadexG25注入层析柱中，用流动相冲洗，流动相为10～50％乙醇；

(2)将蜈蚣醇提物配置成20～50mg/mL，在层析柱中上样4～8mL，流速为0.6～2mL/min，按照层析图谱收集各组分样品，对各组分样品进行活性检测，抗肿瘤活性最好的组分记为组分样品A。

一种制备上述的异喹啉的方法，其步骤为：

(a)用体积浓度为45-65％的醇溶液制备蜈蚣醇提物；

(b)采用葡聚糖凝胶层析法分离纯化步骤(a)中的蜈蚣醇提物，收集多个组分样品，检测这些组分样品的抗肿瘤活性，抗肿瘤活性最好的组分记为组分样品A；

(c)采用制备型RP-HPLC分离纯化步骤(b)中得到的组分样品A，进行梯度洗脱收集多个活性峰组分，检测这些活性峰组分的抗肿瘤活性，抗肿瘤活性第二好的组分记为组分B；

(d)采用半制备型RP-HPLC分离纯化步骤(c)中的组分B，进行梯度洗脱收集多个活性峰组分，检测这些活性峰组分的抗肿瘤活性，抗肿瘤活性最好的组分即为上述的异喹啉。

1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉在制备抗疟疾药物、抗菌药物及抗肿瘤药物中的应用。

优选地，所述的疟疾为起源于寄生于人体的间日疟原虫、三日疟原虫、恶性疟原虫和卵形疟原虫。

优选地，所述的菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、甲/乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌和嗜血流感杆菌。

优选地，所述的肿瘤为起源于人的头颈部、脑、甲状腺、胰腺、肺脏、肝脏、食管、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、膀胱、睾丸的原发或继发的癌以及肉瘤。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明经过大量的实验摸索，首次从蜈蚣中发现了新化合物1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉以及其在抗疟疾、抗菌和抗肿瘤药物中的应用，实验结果表明，1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉可用于治疗疟疾，还具有杀菌的功能，同时还能治疗实体肿瘤；所述的疟疾为寄生于人体的间日疟原虫，三日疟原虫，恶性疟原虫和卵形疟原虫；所述的菌为大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，甲/乙型溶血性链球菌，肺炎链球菌和嗜血流感杆菌；所述的肿瘤为起源于人的头颈部、脑、甲状腺、胰腺、肺脏、肝脏、食管、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、膀胱、睾丸的原发或继发的癌以及肉瘤；

(2)本发明通过不同的方法对蜈蚣粉末进行提取，采用MTT法对蜈蚣粉末的多种提取液进行活性检测，找到了抗肿瘤活性最佳的提取物，然后采用葡聚糖凝胶层析和制备型高效液相等多种手段对该提取物分离纯化，通过高效液相、质谱、氢谱、碳谱和红外等手段对分离的化合物进行分析，首次确定了蜈蚣醇提物活性组分中起到抗疟疾、抗菌和抗肿瘤活性的主要成分为1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉；

(3)本发明通过大量实验测试，得出乙醇浸取能从蜈蚣粉末中提取出最佳抗肿瘤活性组分，去除或减少与抗肿瘤无关的组分，提取后的组分具有更强的抗肿瘤活性，具有良好的开发前景；

(4)本发明涉及的1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉从蜈蚣中提取获得，蜈蚣产地分布广泛，易于养殖，可用于大规模提取分离纯化；

(5)本发明涉及的1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉结构简单，易于合成，可以规模生产，生产成本低廉；

(6)本发明首次从蜈蚣粉末中提取得到了1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉，与已知异喹啉类化合物在取代基或者取代位置上有所不同，且发明人经过大量实验证明这种物质具有很好的抗疟疾、抗菌和抗肿瘤活性，可用于制备抗疟疾、抗菌和抗肿瘤药物。

附图说明

附图1为本发明活性物质I的HPLC图谱，图中主峰出峰时间为15.468min，经过分析可以确定该活性物质I的纯度达到95％以上，可以用于后续结构鉴定；

附图2为本发明活性物质I的高分辨质谱图(HRESIMS)，由高分辨质谱可知：分子式C₁₀H₉NO₃(m/z192.0664[M+H]⁺，calcdfor192.0655),化合物分子量为191.0664；

附图3为本发明活性物质I的氢谱图(¹H-NMR)，从氢谱中可以看出活性物质I中氢原子化学环境的种类和不同化学环境氢原子的数目比；

附图4为本发明活性物质I的碳谱图，从碳谱中可以看出活性物质I中碳原子的数目和碳原子的种类；

附图5为本发明活性物质I的二维HMBC图谱，从HMBC图谱中可以看出活性物质I中远程偶合的碳氢关系；

附图6为本发明活性物质I的二维HSQC图谱，从HSQC图谱中可以看出活性物质I中直接相连的碳氢关系；

附图7为本发明活性物质I的红外图谱，从红外图谱中可以看出活性物质I中的特征峰；

具体结构解析如下：

红外图谱(附图7)给出数据IR(KBr)v_max：具有特征峰3055cm^-1，1662cm^-1，1567cm^-1，1405cm^-1，1340cm^-1，1199cm^-1，1140cm^-1，1056cm^-1，1015cm^-1，843cm^-1，753cm^-1和726cm^-1，可出确定该活性物质I具有苯环结构，取代基中有羟基和甲氧基。高分辨质谱HRESIMS(附图2)给出分子式C₁₀H₉NO₃(m/z192.0664[M+H]⁺，calcdfor192.0655)，说明活性物质I具有7个不饱和度。附图3的¹H-NMR(D₂O，600MHz)中δ_H7.15(1H，d，J＝7.6Hz，H-6)，7.48(1H，t，J＝8.0Hz，H-7)，7.59(1H，d，J＝8.0Hz，H-8)为苯环上ABX系统的3个质子信号，δ_H4.43(3H，s，-OCH₃)为甲氧基质子信号，δ_H8.53(1H，s，H-3)为单峰。附图4的¹³C-NMR(D₂O，75MHz)δ_C：156.6(C-1)，146.6(C-5)，140.0(C-4)信号表明该化合物中C-4和C-5与羟基相连，C-1和甲氧基相连。结合分子式说明活性物质I为喹啉或异喹啉类化合物，结构中有2个羟基和1个甲氧基，其中一个取代基位于苯环5位。在HSQC(附图6)中可以看出δ_C：135.0(C-3)，129.2(C-7)，113.5(C-6)，112.9(C-8)，直接与氢原子相连。在HMBC(附图5)中，δ_H4.43(3H，s，-OCH₃)与δ_C156.6(C-1)存在远程相关，说明甲氧基位于C-1位；δ_H8.53(1H，s，H-3)与δ_C156.6(C-1)，δ_C140.0(C-4)和δ_C126.7(C-10)存在远程相关，且H-3为单峰，说明活性物质I为异喹啉类化合物；δ_H7.59(1H，d，J＝8.0Hz，H-8)与δ_C156.6(C-1)，δ_C113.5(C-6)和δ_C129.2(C-7)存在远程相关，说明活性物质I的2个羟基分别位于吡啶环4位和苯环5位。综合附图1-7的数据分析结果，可以确定活性物质I为1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉，分子量为191.1，结构式为：

附图8为蜈蚣醇提物的葡聚糖凝胶层析图谱，共收集了3个组分(组分1～3)；

附图9为葡聚糖凝胶层析组分3的制备型高效液相分离图谱，共收集了6个组分(组分3-1～3-6)；

附图10为组分3-6的半制备型高效液相分离图谱，共得到3个样品(样品1～3)，其中样品2为1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉。

具体实施方式

实施例1

蜈蚣中1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉的制备和结构鉴定

a.水提法和醇提取法制备蜈蚣提取物：

(1)将蜈蚣干体粉碎得到蜈蚣粉末，加入蜈蚣粉末体积10倍(5-10倍体积均可，本实施例中优选10倍，后面同理)的PBS匀浆，然后进行超声破碎；

(2)对匀浆液进行冷冻离心，取上清液，冷冻干燥得到蜈蚣水提物沉淀；

(3)取步骤(2)中得到的沉淀，加入沉淀体积10倍的55％(体积分数，后面的同理)乙醇匀浆，然后在4℃条件下浸取，对浸取液再次冷冻离心，取上清液，冷冻干燥得到蜈蚣55％醇提物；

(4)取步骤(2)中得到的沉淀，加入沉淀体积10倍的70％乙醇匀浆，然后在4℃条件下浸取，对浸取液再次冷冻离心，取上清液，冷冻干燥得到蜈蚣70％醇提物；

(5)取步骤(2)中得到的沉淀，加入沉淀体积10倍的85％乙醇匀浆，然后在4℃条件下浸取，对浸取液再次冷冻离心，取上清液，冷冻干燥得到蜈蚣85％醇提物；

(6)MTT检测蜈蚣水提物和醇提物的体外抗肿瘤活性，结果见表1；

表1蜈蚣水提物和醇提物对5株肿瘤细胞增殖抑制作用

根据MTT活性检测的结果，发现蜈蚣55％醇提物的体外抗肿瘤活性最好，并且其抑制5株肿瘤细胞增殖的IC₅₀值差距较小。相对于蜈蚣55％醇提物，水提物、70％醇提物和85％醇提物的体外抗肿瘤活性较差。后续的实施方法中对蜈蚣55％醇提物进行分离纯化。

b.葡聚糖凝胶层析法制备蜈蚣55％醇提物中活性组分

(1)将层析柱(规格：内径10mm*高度500mm)安装在铁架台上，并将其与数显恒流泵以及核酸蛋白检测仪连接，层析流动相选用10％乙醇；

(2)葡聚糖凝胶SephadexG25在沸水浴中加热4h，取出冷却至室温，然后将SephadexG25连续地加入层析柱中，并用4个柱床体积的流动相进行平衡；

(3)将蜈蚣55％醇提物配置成50mg/mL，在层析柱中上样4mL，流速为2mL/min。打开核酸蛋白检测仪检测，并按照层析图谱收集各组分样品，共收集3个组分(组分1～3)，具体见附图8。对3个组分进行MTT法检测，结果见表2；

表2组分1～3对5株肿瘤细胞增殖抑制作用

根据MTT活性检测的结果，发现组分3的体外抗肿瘤活性最好，并且其抑制5株肿瘤细胞增殖的IC₅₀值差距较小。相对于组分3，组分1和组分2的体外抗肿瘤活性明显较差。后续的实施方法中对组分3进行分离纯化。

c.高效液相色谱法制备1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉

(1)用制备型RP-HPLC分离纯化葡聚糖凝胶层析组分3。用8％乙腈(含0.1％TFA)平衡1h后，进行梯度洗脱，洗脱终浓度为35％，洗脱时间为50min，流速为50mL/min，收集活性峰，冷冻干燥，共收集6个组分(组分3-1～3-6)，具体见附图9；对6个组分进行MTT法检测，结果见表3；

表3组分3-1～3-6对3株肿瘤细胞增殖抑制作用

根据MTT活性检测的结果，发现组分3-6的体外抗肿瘤活性较好，并且其抑制3株肿瘤细胞增殖的IC₅₀值差距较小，后续的实施方法中对组分3-6进行分离纯化。

(2)对步骤(1)中组分3-6进行二次纯化，用半制备型RP-HPLC分离纯化。用25％乙腈(含0.1％TFA)平衡1h后，进行梯度洗脱，洗脱终浓度为50％，洗脱时间为35min，流速为10mL/min，收集活性峰，冷冻干燥，从组分3-6中纯化得到3个样品(样品1～3)，如图10所示；对3个样品进行MTT法检测，结果见表4。

表4样品1～3对3株肿瘤细胞增殖抑制作用

根据MTT活性检测的结果，发现样品2的体外抗肿瘤活性最好，并且其抑制3株肿瘤细胞增殖的IC₅₀值差距较小，样品1的体外抗肿瘤活性较差，因此组分3-6中样品2(附图10)记为活性物质I，后续的实施方法和实施例中均对活性物质I进行纯度检测、结构鉴定和活性考察。

(3)通过分析型RP-HPLC分析活性物质I的含量和纯度。用25％乙腈(含0.5％TFA)平衡1h后，进行梯度洗脱，洗脱终浓度为50％，洗脱时间30min，流速为1mL/min，如附图1所示，活性物质I的出峰时间为15.468min；

(4)对活性物质I进行红外光谱、质谱、碳谱、氢谱、二维谱分析，确定其结构，如附图2-7所示，活性物质I为1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉(1-methoxy-4,5-diolisoquinoline)，分子式为C₁₀H₉NO₃，分子量为191.1，结构式为：

实施例2

本实施例中提取活性组分的步骤基本同实施例1，所不同的是：1)水提时，加入的PBS溶液体积是蜈蚣粉末体积的5倍，醇提时，醇溶液的体积分数为45％；2)采用葡聚糖凝胶层析法分离纯化蜈蚣醇提物时，将蜈蚣醇提物配置成20mg/mL，流动相为50％乙醇，上样体积为8mL，流速为0.6mL/min。

本实施例的结果同实施例1，最终得到的活性物质经结构鉴定为1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉(1-methoxy-4,5-diolisoquinoline)，分子式为C₁₀H₉NO₃，分子量为191.1，结构式为：

实施例3

本实施例中提取活性组分的步骤基本同实施例1，所不同的是：1)水提时，加入的PBS溶液体积是蜈蚣粉末体积的8倍，醇提时，醇溶液的体积分数为65％；2)采用葡聚糖凝胶层析法分离纯化蜈蚣醇提物时，将蜈蚣醇提物配置成35mg/mL，流动相为30％乙醇，上样体积为6mL，流速为1.5mL/min。

实施例4

SYBRGreenI法评价1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉体外抗疟疾活性

(1)疟原虫：间日疟原虫，三日疟原虫，恶性疟原虫和卵形疟原虫；

(2)阳性药：氯喹；

(3)试验方法：将荧光染料SYBRGreenI和事先配好的裂解液以0.20μL.mL^-1的浓度比例混合均匀，避光。当虫体生长状态达到环状体时期感染率>70％(避免滋养体时期和裂殖体时期)时收集虫体，用完全培养基调红细胞压积为2％，原虫感染率要求为0.3％～0.5％。于96孔板每孔加20μL含药培养基80μL虫血，设空白孔(2％压积的红细胞)与对照孔(2％压积，0.3％～0.5％感染率的虫血)。继续培养，72h后将药板冻于-20℃冰箱中，过夜。每种药物设8个浓度梯度，每个浓度设3个复孔，每次实验重复3次。次日将药板室温放置2h，待孔中含虫血完全溶化后，1:1的比例加入含SYBRGreenI的裂解液。避光在暗室中放置0.5h～1h后，混匀吸取100μL转移入96孔黑色微孔板。将药板放入全波长多功能酶标仪中，在485nm(Ex)和535nm(Em)条件下读取板中每孔的荧光值。利用Excel软件整理数据(不同药物浓度及其荧光值)软件处理，所得数据经标准化后，进行非线性回归的曲线拟合，得到各抗疟药的抑制率及IC50值，确定各药物的抗疟活性。

(4)采用统计软件SPSS对实验数据进行分析，计量资料数据以(均数±标准差)表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以p<0.05为差异有统计学意义。

表51-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对4种疟原虫的抗疟疾体外活性检测

结果：见表5，1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对间日疟原虫、三日疟原虫、恶性疟原虫和卵形疟原虫的繁殖具有较好的抑制作用，其IC₅₀值分别为18.37μg/mL、16.00μg/mL、25.95μg/mL和12.46μg/mL。1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对三日疟原虫和卵形疟原虫的抗疟活性较好，对间日疟原虫和恶性疟原虫的抗疟活性较差。与阳性药氯喹相比，1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对卵形疟原虫和三日疟原虫的抗疟活性较高。以上实验结果表明，1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对三日疟原虫和卵形疟原虫的生长具有较强的抑制作用，可用于制备抗疟疾药物。

实施例5

微孔板法评价1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉体外抗菌活性

(1)菌株：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，甲/乙型溶血性链球菌，肺炎链球菌和嗜血流感杆菌。

(2)阳性药：硫酸链霉素。

(3)试验方法：往洁净无菌的96孔培养板中加入浓度为2×10⁶cfu/mL的供试菌液90μL，然后加入不同浓度梯度的测试样品组母液10μL，阳性对照组为不同浓度的硫酸链霉素10μL。同时设空白对照和溶剂对照(30％乙醇或30％DMSO或30％丙酮)，每个组4个复孔。化合物在菌液中的浓度均为母液浓度的十分之一。将96孔板于在37℃，5％CO₂培养箱中培养24h，通过肉眼观察，溶液完全清亮孔的最低药物浓度即为MIC值。

表61-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对6种菌株的抗菌体外活性检测

结果：见表6，1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对金黄色葡萄球菌、甲/乙型溶血性链球菌和嗜血流感杆菌的繁殖具有较好的抑制作用，其MIC值分别为8μg/mL、32μg/mL和2μg/mL。1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对金黄色葡萄球菌、甲/乙型溶血性链球菌和嗜血流感杆菌的抗菌活性较好，对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎链球菌的抗菌活性一般。1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对金黄色葡萄球菌、甲/乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌和嗜血流感杆菌的抗菌活性高于阳性药硫酸链霉素，对铜绿假单胞菌的抗菌活性于阳性药硫酸链霉素相当。以上实验结果表明，1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对金黄色葡萄球菌、甲/乙型溶血性链球菌和嗜血流感杆菌的繁殖具有较强的抑制作用，其MIC值均小于64μg/mL，可用于制备抗菌药物。

实施例6

MTT法评价1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉体外抗肿瘤活性

(1)肿瘤细胞株：人宫颈癌Hela、人肝癌Bel-7402、人前列腺癌DU-145、人肾癌A498、人大细胞肺癌H460、人鼻咽癌CNE、人食管癌EC109、人甲状腺鳞癌SW-579、人胰腺癌SW-1990、人乳腺癌MDA-MB-231、人胆囊癌GBC-SD、人结肠癌HT-29、人卵巢癌SK-OV-3、人子宫内膜癌HHUA、人膀胱癌HT1376、人睾丸癌5637、人肉瘤HT-1080以及人胃癌MGC-803细胞；

(2)阳性对照药：紫杉醇10μg/mL；

(3)1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉：空白培养基配置成1mg/mL的溶液放置与-80℃保存。临用前，用空白培养基稀释成终浓度为1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL的溶液。

(4)实验方法：MTT法

(5)人宫颈癌Hela、人肝癌Bel-7402、人前列腺癌DU-145、人肾癌A498、人大细胞肺癌H460、人鼻咽癌CNE、人食管癌EC109、人甲状腺鳞癌SW-579、人胰腺癌SW-1990、人乳腺癌MDA-MB-231、人胆囊癌GBC-SD、人结肠癌HT-29、人卵巢癌SK-OV-3、人子宫内膜癌HHUA、人膀胱癌HT1376、人睾丸癌5637、人肉瘤HT-1080以及人胃癌MGC-803细胞用含10％FBS的DMEM培养基，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养至90％以上的汇合度时，用胰蛋白酶消化，800rpm×5min离心收集，用含10％FBS的DMEM重悬细胞，在显微镜下计数并调整细胞浓度为3×10⁴个/mL，细胞接种到96孔板中，每孔100μL。接种入96孔板的细胞在37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜，待细胞完全贴壁。1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉作为加药组，紫杉醇作为阳性对照组，不加任何药物的空白培养基作为阴性对照组加入96孔板中。将96孔板在37℃，5％CO₂培养箱中孵育48h。向96孔板中加入5mg/mL的MTT，每孔20μL，于培养箱中继续培养4h。弃去96孔板中的培养液，每孔加入100μLDMSO，轻轻混匀。用酶标仪于测量波长570nm，参比波长630nm处测定吸光值。按照公式计算增殖抑制率(Proliferationinhibitionrate,PI)：

(7)利用增殖抑制率和加药组的浓度，利用SPSS软件计算出半数抑制浓度IC50，如表1所示。试验得到的结果以mean±SD表示，并进行统计T检验，*P＜0.05为显著性差异，**P＜0.01为极显著性差异。

表71-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对18种肿瘤细胞株的抗肿瘤体外活性检测

结果：见表7，1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对人宫颈癌细胞Hela的增殖的IC₅₀值大于10μg/mL；对其他17株肿瘤细胞均具有较好的抑制作用，其IC₅₀值均小于10μg/mL，以上实验结果说明1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对17株肿瘤细胞的增殖具有较强的抑制作用，可用于制备抗肿瘤药物。

实施例7

1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对人胃癌MGC-803裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用

将1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉按照100mg/kg/1d(高)、70mg/kg/1d(中)、40mg/kg/1d(低)给药剂量，于裸鼠皮下注射，一日一次，0.2mL/次；以紫杉醇为阳性对照组10mg/kg，于裸鼠皮下注射，每周一次。

取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm³左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧皮下。小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至60-80mm³后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试药物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。实验组注射1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉，阴性组同时给等量生理盐水。

肿瘤体积计算公式：TV＝0.52×a×b²；

其中，a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relativetumorvolume,RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0，其中V0为分笼时测量所得的肿瘤体积，Vt为实验过程中每一次测量的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，公式如下：

T/C(％)＝T_RTV/C_RTV×100％

T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：阴性对照组RTV。

表81-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对MGC-803裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：见表8，紫杉醇10mg/kg，对MGC-803裸小鼠移植瘤的抑瘤率为54.90％，对实验动物的体重具有显著性的影响；1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉高、中、低三组对MGC-803裸小鼠移植瘤的抑瘤率为50.98％，39.98％，31.76％。

1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对MGC-803裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，3组加药组对MGC-803移植瘤的生长有显著性的抑制作用，各实验组小鼠体重均略有降低；各加药组和阳性药组均有小鼠死亡。

实施例8

1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用

肿瘤体积计算公式：TV＝0.52×a×b²；

T/C(％)＝T_RTV/C_RTV×100％

T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：阴性对照组RTV。

表91-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对MDA-MB-231裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：见表9，紫杉醇10mg/kg，对MDA-MB-231裸小鼠移植瘤的抑瘤率为77.95％，对实验动物的体重具有显著性的影响；1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉高、中、低三组对MDA-MB-231裸小鼠移植瘤的抑瘤率为73.11％，64.47％，58.25％。

1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对MDA-MB-231裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，3组加药组对MDA-MB-231移植瘤的生长有显著性的抑制作用。各实验组小鼠体重均略有降低，各加药组和阳性药组均有小鼠死亡。

实施例9

1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对人肝癌Bel-7402裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用

肿瘤体积计算公式：TV＝0.52×a×b²；

其中，a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relativetumorvolume,RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0，其中V0为分笼时测量所得的肿瘤体积，Vt为每一次测量的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，公式如下：

T/C(％)＝T_RTV/C_RTV×100％

T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：阴性对照组RTV。

表101-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对Bel-7402裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：见表10，紫杉醇10mg/kg，对Bel-7402裸小鼠移植瘤的抑瘤率为74.73％，对实验动物的体重具有显著性的影响；1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉高、中、低三组对Bel-7402裸小鼠移植瘤的抑瘤率为65.68％，55.66％，45.08％。

1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对Bel-7402裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，3组加药组对Bel-7402移植瘤的生长有显著性的抑制作用。各实验组小鼠体重均略有降低，1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉低剂量组小鼠无死亡现象，其他加药组和阳性药组均有小鼠死亡。

实施例10

1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对人肺癌H-460裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用

肿瘤体积计算公式：TV＝0.52×a×b²；

T/C(％)＝T_RTV/C_RTV×100％

T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：阴性对照组RTV。

表111-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对H-460裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：见表11，紫杉醇10mg/kg，对H-460裸小鼠移植瘤的抑瘤率为68.35％，对实验动物的体重具有显著性的影响；1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉高、中、低三组对H-460裸小鼠移植瘤的抑瘤率为66.47％，58.87％，54.30％。

1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对H-460裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，3组加药组对H-460移植瘤的生长有显著性的抑制作用。各实验组小鼠体重均略有降低，加药组和阳性药组均有小鼠死亡。

实施例11

1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对人甲状腺癌SW-579裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用

肿瘤体积计算公式：TV＝0.52×a×b²；

T/C(％)＝T_RTV/C_RTV×100％

T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：阴性对照组RTV。

表121-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对SW-579裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：见表12，紫杉醇10mg/kg，对SW-579裸小鼠移植瘤的抑瘤率为66.64％，对实验动物的体重具有显著性的影响；1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉高、中、低三组对SW-579裸小鼠移植瘤的抑瘤率为65.37％，56.62％，53.40％。

1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对SW-579裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉高、中、低三组对SW-579移植瘤的生长有显著性的抑制作用。各实验组小鼠体重均略有降低，1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉高、中、低组均有小鼠死亡，阳性药组无小鼠死亡。

实施例12

1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对人结肠癌HT-29裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用

肿瘤体积计算公式：TV＝0.52×a×b²；

T/C(％)＝T_RTV/C_RTV×100％

T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：阴性对照组RTV。

表131-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对HT-29裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：见表13，紫杉醇10mg/kg，对HT-29裸小鼠移植瘤的抑瘤率为68.74％，对实验动物的体重具有显著性的影响；1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉高、中、低三组对HT-29裸小鼠移植瘤的抑瘤率为69.21％，62.92％，52.47％。

1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对HT-29裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，3组加药组对HT-29移植瘤的生长有显著性的抑制作用。各实验组小鼠体重均略有降低，1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉低组小鼠无死亡现象，其他加药组和阳性药组小鼠均有死亡。

实施例13

1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对人宫颈癌Hela裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用

肿瘤体积计算公式：TV＝0.52×a×b²；

T/C(％)＝T_RTV/C_RTV×100％

T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：阴性对照组RTV。

表141-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对Hela裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：见表14，紫杉醇10mg/kg，对Hela裸小鼠移植瘤的抑瘤率为72.12％，对实验动物的体重具有显著性的影响；1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉高、中、低三组对HeLa裸小鼠移植瘤的抑瘤率为52.81％，47.91％，36.60％。

1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉对Hela裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉高、中、低三组对Hela移植瘤的生长有显著性的抑制作用。各实验组小鼠体重均略有降低，1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉高、中组有小鼠死亡，其他加药组和阳性药组无小鼠死亡。

通过实施例4～11，本领域技术人员可以发现1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是起源于人的的头颈部、脑、甲状腺、胰腺、肺脏、肝脏、食管、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、膀胱、睾丸的原发或继发的癌以及肉瘤。

Claims

1.一种异喹啉，其特征在于：其分子式为C₁₀H₉NO₃，为1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉，结构式为：

2.一种从蜈蚣中提取活性组分的方法，其步骤为：

a.用体积浓度为45-65％的醇溶液制备蜈蚣醇提物；

b.采用葡聚糖凝胶层析法分离纯化步骤a中的蜈蚣醇提物，收集多个组分样品，检测这些组分样品的抗肿瘤活性，抗肿瘤活性最好的组分记为组分样品A，组分样品A中含有权利要求1所述的异喹啉。

3.根据权利要求2所述的从蜈蚣中提取活性组分的方法，其特征在于：步骤a中制备蜈蚣醇提物的步骤为：

4.根据权利要求2所述的从蜈蚣中提取活性组分的方法，其特征在于：步骤b中采用葡聚糖凝胶层析法分离纯化蜈蚣醇提物的步骤为：

5.一种制备权利要求1所述的异喹啉的方法，其步骤为：

(a)用体积浓度为45-65％的醇溶液制备蜈蚣醇提物；

(d)采用半制备型RP-HPLC分离纯化步骤(c)中的组分B，进行梯度洗脱收集多个活性峰组分，检测这些活性峰组分的抗肿瘤活性，抗肿瘤活性最好的组分即为权利要求1中所述的异喹啉。

6.1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉在制备抗疟疾药物、抗菌药物及抗肿瘤药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉在制备抗疟疾药物、抗菌药物及抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的疟疾为起源于寄生于人体的间日疟原虫、三日疟原虫、恶性疟原虫和卵形疟原虫。

8.根据权利要求6所述的1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉在制备抗疟疾药物、抗菌药物及抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、甲/乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌和嗜血流感杆菌。

9.根据权利要求6所述的1-甲氧基-4,5-二羟基异喹啉在制备抗疟疾药物、抗菌药物及抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤为起源于人的头颈部、脑、甲状腺、胰腺、肺脏、肝脏、食管、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、膀胱、睾丸的原发或继发的癌以及肉瘤。