CN105289559A - 一种键合型固定相手性色谱柱的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种键合型固定相手性色谱柱的制备方法，首先制备键合有不饱和双键的硅胶，并将其装填至手性色谱柱中，然后制备键合有不饱和双键的多糖衍生化物，将多糖衍生化物以溶液形式注入手性色谱柱中使其均匀吸附于硅胶表面，再向手性色谱柱中注入引发剂溶液，使硅胶的不饱和双键与多糖衍生化物的不饱和双键进行聚合反应形成键合型固定相。本发明的制备方法将常规制备方法中的吸附、键合步骤置于色谱柱中完成，简化了步骤和工艺，具有简单、快速、效率高的特点，制备的手性色谱柱固定相均一，可适用于多种强极性流动相，柱效高，分离效果好。
Description
技术领域
本发明涉及手性色谱柱领域，具体涉及一种键合型固定相手性色谱柱的制备方法。
背景技术
多糖类手性固定相在用于手性对映体分离与制备方面显示了巨大的优势，具有广泛的应用前景。目前，商品化的多糖衍生物手性固定相多是采用物理涂覆的方法将多糖衍生物固着在硅胶的表面，因此存在着手性固定相流失的问题，同时也不耐受大部分较强的极性溶剂，给实际使用带来诸多限制。针对这些问题，后续出现了键合型的多糖类手性固定相，以克服上述的问题。
目前的键合型固定相手性色谱柱的制备方法为先制备键合型固定相，再将固定相装填至手性柱中，制备步骤繁多、时间长、操作复杂，如中国专利CN100387333C公开的制备方法。固定相的制备过程中，首先将键合有不饱和双键的多糖衍生化物涂覆至硅胶表面，涂覆过程中涂层厚度难以控制，硅胶上涂覆的多糖衍生化物涂层厚度不均匀，键合后的硅胶粒径和比表面积变化较大、不均匀，这种现象在小粒径硅胶填料中更加突出，由此得到的手性色谱柱固定相不均一，另外，多糖衍生化物涂层较厚的硅胶填料在装填时还容易产生变形或者脱落，以上这些现象严重影响了手性色谱柱的柱效及分离能力。
发明内容
为克服现有键合型固定相手性色谱柱在固定相制备、装填中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种键合型固定相手性色谱柱的制备方法。
本发明提供的制备方法包括以下步骤：
S1：制备键合有不饱和双键的硅胶，并将所述硅胶装填至手性色谱柱中；
S2：制备键合有不饱和双键的多糖衍生化物；
S3：将所述多糖衍生化物以溶液形式注入步骤S1所得的手性色谱柱中使其吸附于所述硅胶的表面，再向所述手性色谱柱中注入引发剂溶液，使所述硅胶的不饱和双键与所述多糖衍生化物的不饱和双键进行聚合反应形成键合型固定相。
本发明所述的硅胶可以为现有的适用于手性色谱柱的任意类型硅胶，尤其为小粒径硅胶；优选地，本发明所述的硅胶可以为多孔球形硅胶，其孔径为10～200纳米，粒径为1.5～50微米。
本发明制备方法步骤S1中所述的键合有不饱和双键的硅胶可以为现有键合型固定相制备方法制备的带有不饱和双键的硅胶；优选地，可通过以下物质与硅胶反应制得：乙烯基三乙氧基硅烷、γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷或γ-甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷。制备方法可以为将反应物置于甲苯等惰性溶剂中加热反应一定时间，反应完毕后洗涤并干燥所得产物。
本发明制备方法步骤S1中硅胶的装填方法可以为现有任意装填方法，如淤浆法等。
本发明制备方法步骤S2中所述的键合有不饱和双键的多糖衍生化物可以为现有键合型固定相制备方法制备的带有不饱和双键的多糖衍生化物；优选地，可由多糖和衍生化试剂、含不饱和双键试剂反应制得。制备方法可以为将反应物置于吡啶等惰性溶剂中加热反应一定时间，反应完毕后洗涤并干燥所得产物。
其中，本发明制备方法所述的多糖包括但不限于纤维素、淀粉、壳聚糖、木聚糖或葡萄糖。
其中，本发明制备方法所述衍生化试剂包括但不限于苯基异氰酸酯、3,5-二甲基苯基异氰酸酯、3,5-二氯苯基异氰酸酯或对甲基-苯基异氰酸酯。
其中，本发明制备方法所述含不饱和双键试剂述包括但不限于丙烯酰氯、甲基丙烯酰氯、乙基丙烯酰氯、3-苯基丙烯酰氯或3-乙氧基丙烯酰氯。
本发明制备方法步骤S3中所述的溶液形式的多糖衍生化物可以为多糖衍生化物与有机溶剂形成的任意浓度的溶液，其中的有机溶剂可以为不与固定相成分发生反应的任意有机溶剂；优选地，步骤S3中所述的多糖衍生化物可以以二甲基乙酰胺或二甲基甲酰胺溶液的形式注入色谱柱中，溶液浓度可以为1～1000mg/mL。
本发明制备方法步骤S3中所述的引发剂可以为烯烃聚合反应中使用的任意引发剂，优选使用偶氮二异丁腈或戊二醛。所述引发剂可与有机溶剂形成的任意浓度的溶液，其中的有机溶剂可以为不与固定相成分发生反应的任意有机溶剂；优选地，引发剂溶液可以为二甲基乙酰胺或二甲基甲酰胺溶液，溶液浓度可以为1～1000mg/mL。
本发明制备方法中，多糖衍生化物溶液和引发剂溶液可以以高压泵注入的方法注入手性色谱柱中。
本发明制备方法步骤S3的聚合反应反应温度可以为50～100℃。
本发明制备方法中，为使聚合反应更加彻底，可重复多次注入多糖衍生化物溶液和引发剂溶液进行多次聚合反应，每次聚合反应的时间可以为40～100分钟。
本发明提供的制备方法具有以下优点：
1、应用范围广
本发明制备方法所制备的手性色谱柱中，通过化学键合的方式将多糖类衍生物固定在色谱基质上形成色谱柱固定相，柱效高，可用于液相色谱对手性对映体的分析与分离，还可适用于各种强极性溶剂的流动相，如四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷等。
2、制备简单，快速
本发明的制备方法只需要将不同的溶液注入色谱柱内，吸附和键合反应均在色谱柱内完成，免去了常规制备方法中填料的洗涤和干燥等过程，尤其是避免了键合型固定相的繁琐的装柱过程，提高了制备效率。
3、固定相品质均一，易于产品化
本发明的制备方法首次将多糖衍生化物与硅胶的吸附和键合反应置于色谱柱内部进行，通过引发剂的作用完成键合过程，多糖衍生化物在硅胶的表面吸附容易控制，吸附层厚度均匀，键合反应反应均一、完全，所得的固定相粒径与比表面积均匀稳定，保证了固定相的均一性，所得手性色谱柱柱效高、分离效果好。
附图说明
图1A、1B分别为应用例1在不同手性柱条件下得到的色谱图。
图2A、2B分别为应用例2在不同手性柱条件下得到的色谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将进一步描述本发明的示例性实施例的技术方案。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。其中所述化学品如未特别说明均为市售产品。
实施例1
1)硅胶的处理
取用20％盐酸按常规活化方式处理并干燥后的硅胶(平均粒径约为5微米、孔径约为30纳米)10克，加入50毫升甲苯，再加入10毫升γ-甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷，氮气保护条件下加热105度，反应12小时，反应产物依次用甲苯和乙醇洗涤并干燥。
2)键合硅胶装柱
取2.1克上述经过硅烷化的且带有不饱和双键的硅胶，用淤浆法装柱，制备成Φ4.6×150毫米液相色谱柱。
3)多糖衍生化物的制备
取3克纤维素，加入150毫升吡啶，加入1克3-乙氧基丙烯酰氯，氮气保护下80摄氏度反应5小时，再加入20毫升3,5-二甲基苯基异氰酸酯作为衍生化试剂，反应10个小时，冷却，用甲醇洗涤，干燥。
4)柱内键合反应
取0.6克上述带有不饱和基团的多糖衍生化物，溶解在20毫升二甲基乙酰胺中，用高压泵注入上述色谱柱，流出液循环注入30分钟。
取30毫克偶氮二异丁腈溶解在10毫升二甲基乙酰胺中，用高压泵注入上述色谱柱，流出液循环注入30分钟，取下色谱柱，置于恒温箱中70摄氏度下反应1个小时。取出色谱柱，冷却至室温，重复上述步骤，循环注入多糖衍生化物和引发剂溶液并恒温反应三次。然后冷却至室温，接入液相色谱，先用二甲基乙酰胺，再用四氢呋喃和甲醇冲洗至基线稳定即可。
实施例2
1)硅胶的处理
取用20％盐酸按常规活化方式处理并干燥后的硅胶(平均粒径约为5微米、孔径约为30纳米)10克，加入50毫升甲苯，再加入8毫升乙烯基三乙氧基硅烷，氮气保护条件下加热105度，反应12小时，反应产物依次用甲苯和乙醇洗涤并干燥。
2)键合硅胶装柱
取2.1克上述经过硅烷化的且带有不饱和双键的硅胶，用淤浆法装柱，制备成Φ4.6×150毫米液相色谱柱。
3)多糖衍生化物的制备
取3克直链淀粉，加入150毫升吡啶，加入1克3-乙氧基丙烯酰氯，氮气保护下80摄氏度反应5小时，再加入20毫升3,5-二甲基苯基异氰酸酯作为衍生化试剂，反应10个小时，冷却，用甲醇洗涤，干燥。
4)柱内键合反应
取0.6克上述带有不饱和基团的多糖衍生化物，溶解在20毫升二甲基乙酰胺中，用高压泵注入上述色谱柱，流出液循环注入30分钟。
取30毫克偶氮二异丁腈溶解在10毫升二甲基乙酰胺中，用高压泵注入上述色谱柱，流出液循环注入30分钟，取下色谱柱，置于恒温箱中70摄氏度下反应1个小时。取出色谱柱，冷却至室温，重复上述步骤，循环注入多糖衍生化物和引发剂溶液并恒温反应三次。然后冷却至室温，接入液相色谱，先用二甲基乙酰胺，再用四氢呋喃和甲醇冲洗至基线稳定即可。
应用例1
采用实施例1制备的色谱柱检测氟比洛芬酯样品。
色谱条件：
流动相配置：量取1mL异丙醇配置体积比99/1的正己烷/异丙醇溶液，保证充分混合。
样品溶液的配置：将氟比洛芬酯合成品使用流动相溶解，浓度为1mg/mL。
所得手性色谱图如图1A所示，色谱数据如表1A所示。
表1A
| 峰# | 保留时间 | 面积 | 高度 | 面积％ | 高度处的峰 | 理论踏板# | 分离度 | 拖尾因子 |
| 1 | 26.758 | 8072158 | 204111 | 26.39 | 0.592 | 11132 | 0.00 | 1.313 |
| 2 | 28.845 | 7666271 | 180733 | 25.07 | 0.636 | 11188 | 1.98 | 1.115 |
| 3 | 31.328 | 7802052 | 173266 | 25.51 | 0.691 | 11213 | 2.18 | 1.269 |
| 4 | 34.676 | 7042082 | 146467 | 23.03 | 0.738 | 12064 | 2.74 | 1.213 |
| 总计 | 30582563 | 704577 | 100.00 |
将上述测试过程中的手性色谱柱替换为普通手性柱(填料为硅胶表面涂覆有纤维素-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯))，其他条件不变，所得手性色谱图如图1B所示，色谱数据如表1B所示。
表1B
| 峰# | 保留时间 | 面积 | 高度 | 面积％ | 高度处的峰 | 理论踏板# | 分离度 | 拖尾因子 |
| 1 | 18.366 | 14577754 | 437296 | 23.90 | 0.528 | 6754 | 0.00 | 0.000 |
| 2 | 19.349 | 14591012 | 414986 | 23.92 | 0.559 | 6669 | 1.07 | 0.000 |
| 3 | 20.552 | 13689555 | 364656 | 22.44 | 0.593 | 6734 | 1.23 | 0.000 |
| 4 | 23.927 | 18135329 | 305519 | 29.73 | 0.919 | 4258 | 2.73 | 1.427 |
| 总计 | 60993649 | 1522457 | 100.00 |
由图1A、1B以及表1A、1B可知，本发明实施例1的色谱柱对于氟比洛芬酯的拆分效果更佳，具有更好的分离度及理论塔板数。
应用例2
采用实施例2制备的色谱柱检测匹多莫德样品。
色谱条件：
| 仪器型号： | 岛津LC-10A |
| 流动相： | 乙醇/甲醇/三氟乙酸＝90/10/0.1 |
| 检测波长： | 210nm |
| 柱温： | 室温控制16度 |
| 流速： | 0.4mL/min |
| 进样量： | 10μL |
流动相配置：量取20mL甲醇，用乙醇定容至200mL，加200μL三氟乙酸，手动震荡5min，超声10min，待用。
样品溶液的配置：将匹多莫德合成品溶解于甲醇，浓度为1mg/mL。
所得手性色谱图如图2A所示，色谱数据如表2A所示。
表2A
| 峰# | 保留时间 | 面积 | 高度 | 面积％ | 理论踏板# | 分离度 | 拖尾因子 |
| 1 | 16.174 | 2000713 | 47071 | 16.38 | 3326 | 0.00 | 1.068 |
| 2 | 20.455 | 3737034 | 75562 | 30.60 | 3920 | 3.53 | 1.049 |
| 3 | 23.945 | 3093536 | 36219 | 25.33 | 1798 | 1.96 | 1.021 |
| 4 | 30.090 | 3382239 | 27320 | 27.69 | 1373 | 2.23 | 1.116 |
| 总计 | 12213522 | 186171 | 100.00 |
将上述测试过程中的手性色谱柱替换为普通手性柱(填料为硅胶表面涂覆有直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯))，其他条件不变，所得手性色谱图如图2B所示，色谱数据如表2B所示。
表2B
| 峰# | 保留时间 | 面积 | 高度 | 面积％ | 高度处的峰 | 理论踏板# | 分离度 | 拖尾因子 |
| 1 | 12.611 | 2445177 | 54032 | 21.75 | 0.000 | 1270 | 0.00 | 0.000 |
| 2 | 13.690 | 4082553 | 98248 | 36.31 | 0.609 | 2759 | 0.88 | 0.000 |
| 3 | 20.828 | 1812652 | 33521 | 16.12 | 0.819 | 3485 | 5.82 | 0.928 |
| 4 | 25.313 | 2902067 | 41196 | 25.81 | 1.076 | 2974 | 2.74 | 0.932 |
| 总计 | 11242449 | 226997 | 100.00 |
由图2A、2B以及表2A、2B可知，本发明实施例2的色谱柱对于匹多莫德及其异构体的分离效果更佳，具有更好的分离度。
虽然为了说明本发明，已经公开了本发明的优选实施方案，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离权利要求书所限定的本发明构思和范围的情况下，可以对本发明做出各种修改、添加和替换。
Claims (10)
1.一种键合型固定相手性色谱柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：制备键合有不饱和双键的硅胶，并将所述硅胶装填至手性色谱柱中；
S2：制备键合有不饱和双键的多糖衍生化物；
S3：将所述多糖衍生化物以溶液形式注入步骤S1所得的手性色谱柱中使其吸附于所述硅胶的表面，再向所述手性色谱柱中注入引发剂溶液，使所述硅胶的不饱和双键与所述多糖衍生化物的不饱和双键进行聚合反应形成键合型固定相。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述硅胶为多孔球形硅胶，其孔径为10～200纳米，粒径为1.5～50微米。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述的键合有不饱和双键的硅胶由以下物质与硅胶反应制得：乙烯基三乙氧基硅烷、γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷或γ-甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述的键合有不饱和双键的多糖衍生化物由多糖和衍生化试剂、含不饱和双键试剂反应制得。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述多糖为纤维素、淀粉、壳聚糖、木聚糖或葡萄糖。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述衍生化试剂为苯基异氰酸酯、3,5-二甲基苯基异氰酸酯、3,5-二氯苯基异氰酸酯或对甲基-苯基异氰酸酯。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述含不饱和双键试剂述为丙烯酰氯、甲基丙烯酰氯、乙基丙烯酰氯、3-苯基丙烯酰氯或3-乙氧基丙烯酰氯。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述的多糖衍生化物以二甲基乙酰胺或二甲基甲酰胺溶液形式注入，溶液浓度为1～1000mg/mL。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中使用的引发剂溶液为偶氮二异丁腈或戊二醛的二甲基乙酰胺或二甲基甲酰胺溶液，溶液浓度为1～1000mg/mL。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3的聚合反应反应温度为50～100℃。
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