CN105283552A - 具有非功能性tspo基因的转基因非人类生物体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及转基因动物模型。具体地，本发明涉及用于与TSPO-相关的正常生理学、疾病和病症相关的应用的转基因动物模型。本发明描述了包含具有至少一个非功能性、内源性TSPO基因拷贝的细胞的转基因非人类动物的特征。还公开了用于研究或调节TSPO-相关功能的化合物。

Description

具有非功能性TSPO基因的转基因非人类生物体
交叉引用
本申请要求于2013年3月13日提交的澳大利亚临时专利申请2013900858、于2013年9月25日提交的澳大利亚临时专利申请2013903696和于2013年12月24日提交的澳大利亚临时专利申请2013905101的优先权，所有这些通过交叉引用完全结合在本文中。
技术领域
本发明涉及转基因动物模型。具体地，本发明涉及用于与TSPO-相关的正常生理学、疾病和病症相关的应用的转基因动物模型。
发明背景
易位蛋白(Translocatorprotein，TSPO)之前已知为外周苯二氮杂受体(peripheralbenzodiazepinereceptor，PBR)，其是一种主要定位在线粒体外膜上的18kDa膜蛋白，并且在整个体内广泛分布。其表达水平在不同的组织和器官中是不同的。特别地，健康的成年人脑实质中具有非常低水平的TSPO，而肾、肺和心脏表达高水平的TSPO，在腺体和产生类固醇的组织中甚至存在更高水平的TSPO。TSPO在从细菌到昆虫到哺乳动物的物种之间是相对十分保守的。
TSPO的主要功能似乎与类固醇产生相关，但是TSPO还参与蛋白转运、离子转运、卟啉(porphrin)转运和血红素生物合成、细胞增殖和分化、线粒体功能调节、细胞呼吸、糖异生和参与氧化过程以及凋亡。无偏见的大规模全生物体筛选将TSPO鉴定为特别重要的蛋白，证实了TSPO的功能在物种间充分保持，并且在一个物种中进行的观察可以转移到另一个物种。这是独立的证据，即其中TSPO改变的任意生物体在健康和疾病中多种十分重要的生物学功能的研究中具有高度的实用性。
同样地，按照目前的观念，TSPO最重要的功能是通过辅助转运胆固醇(孕烯醇酮的前体)穿过水性线粒体膜间空间而调节类固醇激素的产生，这是一种由将PBR重新命名为TSPO所强调的观点。大量关于TSPO对类固醇介导的稳态的调节影响(包括报道的TSPO基因敲除的胚胎致死性作用)的参考文献已经确定了TSPO基因产物对于生命是重要的的观点。如上文所示，TSPO作为内分泌调节剂的关键作用是对所观察到的TSPO结合化合物在从阿尔茨海默病的抗炎性治疗(Barron，A.M.等.LigandfortranslocatorproteinreversespathologyinamousemodelofAlzheimer′sdisease(易位蛋白的配体在小鼠阿尔茨海默病模型中逆转病理学).JNeurosci33，8891-8897，doi：10.1523/JNEUROSCI.1350-13.2013(2013))到对中枢GABAA受体蛋白复合物没有直接影响的抗焦虑治疗(anxiolysis)(Rupprecht，R.等.Translocatorprotein(18kDa)(TSPO)asatherapeutictargetforneurologicalandpsychiatricdisorders(易位蛋白(18kDa)(TSPO)作为用于神经学和精神病学病症的治疗靶标).NatRevDrugDiscov9，971-988，doi：nrd3295[pii]10.1038/nrd3295(2010)；Rupprecht，R.等.Translocatorprotein(18kD)astargetforanxiolyticswithoutbenzodiazepine-likesideeffects(易位蛋白(18kD)作为没有苯二氮杂样副作用的抗焦虑剂靶标).Science325，490-493，doi：10.1126/science.1175055(2009))范围内的罕见宽泛治疗谱中起作用的普遍解释。因此，TSPO已经参与大量病理学或疾病病况。
上文更进一步地，这些包括具有神经炎症的疾病，神经变性病，脑损伤，缺血-再灌损伤，癫痫和癌症，其中TSPO被高度上调。TSPO作为成像的靶标的用途在脑中特别有用，在脑中，TSPO具有相对低的表达。在更基本的水平上，TSPO已经成为成像和诊断工具的靶标，并且已经被提议作为多种神经学和精神病学病症的治疗靶标。
已经表明一些种类的配体表现出针对外周苯二氮杂受体的高亲和性结合，最广泛研究的是苯二氮杂Ro5-4864(7-氯-5-(4-氯苯基)-1，3-二氢-1-甲基-2H-1，4-苯二氮杂2-酮)和异喹啉PK-11195(1-(2-氯苯基)-N-甲基-N-(1-甲基丙基)-3-异喹啉羧酰胺)。用11C、18F和123I标记，这些配体已经用于绘制人心脏和脑中的外周苯二氮杂受体的图谱。已经在多种肿瘤细胞中报道了增加的[3H]PK-11195摄入，所述肿瘤细胞包括乳腺、卵巢、前列腺、肾上腺、脑和结肠肿瘤细胞。用适当水平的放射性碘进行放射性标记可以首先用来诊断这些肿瘤(使用诸如123I或131I的放射性标记)，然后用来以治疗剂量治疗它们(例如，使用123I，125I或131I)。
表现出针对外周苯二氮杂受体如TSPO的高亲和力的化合物已经被描述还表现出针对中枢苯二氮杂受体的强结合(例如，参见AnziniM.等.，J.Med.Chem.394275-4284(1996)和TrapaniG.等.J.Med.Chem.403109-3118(1997))。因此，某些TSPO结合化合物通常选择性不足以用于TSPO-相关的疾病和病况的诊断或治疗。
最近，已经描述了某些2-(碘苯基)-咪唑并[1.2-a]吡啶，其与外周苯二氮杂受体强结合，但是不与中枢苯二氮杂受体强结合(参见美国专利6,379,649，其完整的公开内容通过引用结合在本文中)。这些2-(碘苯基)-咪唑并[1.2-a]吡啶，当具有电负性取代基时，特别是当所述取代基是在吡啶核中的卤素时，表现出与外周苯二氮杂受体的强结合和与中枢苯二氮杂受体弱得多的结合，这使得这些化合物可用于以异常的外周苯二氮杂受体异常密度为特征的病症的诊断和治疗，包括放射性治疗。
然而，并且尽管TSPO研究的广泛应用，目前没有无-TSPO背景的细胞、组织或动物用于将声称的TSPO-结合化合物原位鉴定和验证为真正的TSPO-结合化合物。相反，迄今为止进行的TSPO研究的可靠性受到这样的可能性的损害：在可用的体外竞争性配体结合系统中观察到的TSPO结合作用仅是非特异性和非选择性结合的结果，与体内TSPO功能没有相关性。
如上文所示，之前产生十分需要TSPO敲除动物模型的努力已经失败了，原因在于其导致不可存活的胚胎，这归因于TSPO基因敲除的“胚胎致死性”表型。
明显地，需要动物模型来提供用于TSPO研究的真正的阴性对照。此类模型系统的可用性将改变目前进行TSPO研究的方式，并且将允许涉及TSPO-相关的疾病和病况的研究发现的回顾性的重新评估。此外，其中TSPO基因的至少一个等位基因是无功能的或不存在的动物将显著扩大研究其他TSPO-依赖性生物学途径的调节的目前有限的可能性。因此，产生可用于研究TSPO-相关的疾病和病况的动物将是TSPO领域内的重要的里程碑。
本发明的目的是克服或改善现有技术的至少一个不足，或者提供有用的备选方案。
发明概述
在细菌和古细菌(archaea)中广泛地发现TSPO的直向同系物。TSPO蛋白家族的大部分成员包含针对异喹啉羧酰胺PK11195的特异性结合位点，其已经用来药理学定义TSPO，并且将其与其他苯二氮杂结合受体(如GABAA受体蛋白复合物)区分开来。进化上较年轻的C端胆固醇识别氨基酸共有(CRAC)结构域主要在动物门中发现。
认为TSPO参与线粒体能量产生和卟啉中间体的转运。然而，认为其最重要的功能是通过参与将胆固醇(孕烯醇酮的前体)转运穿过水性线粒体膜间空间而调节类固醇激素的产生。
与普遍公布的观点和理论考虑(高度保守的TSPO基因的变化或缺失不可能产生可存活的、可繁殖的动物)相反，本发明人已经成功地产生了一种新型的转基因动物，其中不存在功能性的TSPO基因不是致死性的。
特别地，本发明人已经令人惊讶地表明按照本发明的整个TSPO基因敲除小鼠(在整个说明书中还称为小鼠品系C57BL/6-TSPOtm1GuWu(GuwiyangWurra))是可存活的，具有正常的胆固醇转运、孕烯醇酮合成、繁殖性、原卟啉IX代谢，并且在健康条件下，没有明显的临床损害。
然而，在纯合型TSPO敲除小鼠中不存在TSPO已经揭示了TSPO在调节系统和/或细胞能量持有(household)、调节线粒体氧化途径、线粒体ATP产生和响应高脂肪饮食的能量存储中的作用。特别地，本发明人已经令人惊讶地发现，与野生型动物相比，在本发明所述的TSPO敲除动物中，以持久的高脂肪饮食形式增加的能量摄入导致显著减少的(并且少于预测的)体重增加。因此，已经提供了TSPO和TSPO-介导的信号传导在抵抗由高脂肪饮食导致的肥胖中的保护作用。
此外，TSPO敲除小鼠示例了所述令人惊讶的发现：整体缺失TSPO功能对神经元损伤后的小胶质细胞的激活没有影响或仅有最小的影响。这些结果表明，由于没有充分区分神经-胶质相互作用与通常表现出高水平的TSPO表达的炎性组织中的反应，所以，目前对TSPO功能与“神经炎症”的理解也值得重新研究。
因此，本发明所述的整体TSPO基因敲除动物提供了一种评价具有针对TSPO的亲和力的现有的和新的化学化合物的诊断和治疗选择性的重要工具。减少对推测的依赖性，其允许宽泛的基础实验来研究争论性讨论的类固醇生物发生途径、类固醇-依赖性系统作用，包括行为(Rupprecht，R.等.Translocatorprotein(18kD)astargetforanxiolyticswithoutbenzodiazepine-likesideeffects(易位蛋白(18kD)作为没有苯二氮杂样副作用的抗焦虑剂的靶标).Science325，490-493；Miller，W.L.&Auchus，R.J.Themolecularbiology，biochemistry，andphysiologyofhumansteroidogenesisanditsdisorders(人类固醇发生和其病症的分子生物学、生物化学和生理学).EndocrRev32，81-151；Stocco，D.M.TheRoleofPBR/TSPOinSteroidBiosynthesisChallenged(PBR/TSPO在攻击的类固醇生物合成中的作用).Endocrinology155，6-9)，以及线粒体能量产生和针对饮食-诱导的肥胖的保护机制(Gut，P.等.Whole-organismscreeningforgluconeogenesisidentifiesactivatorsoffastingmetabolism(糖异生的全生物体筛选鉴定了禁食代谢的激活剂).NatChemBiol9，97-104；Divakaruni，A.S.&Brand，M.D.Theregulationandphysiologyofmitochondrialprotonleak(线粒体质子泄漏的调节和生理学).Physiology26，192-205)。
因此，在第一方面，本发明涉及包含具有至少一个非功能性内源性TSPO基因拷贝的细胞的转基因非人类动物。
在一个实施方案中，所述细胞不包含功能性TSPO基因。
在另一个实施方案中，所述非功能性内源性TSPO基因包含至少一个选自由缺失、插入、移码突变、重排或取代组成的组的突变。在另一些实施方案中，所述突变可以是组成型的或条件型的(conditional)。
在另一个实施方案中，所述突变包括所述TSPO基因内的外显子1、2、3或4的全部或部分的缺失。在另一个实施方案中，所述突变包括所述TSPO基因内的外显子2或3的全部或部分的缺失。典型地，所述突变是所述TSPO基因内的外显子2和3的缺失。
在本发明的一个实施方案中，所述非人类动物来自选自果蝇属(Drosophila)、蛭纲(Hirudinea)、鼠科(Murine)或鲤科(Cyprinidae)。
在另一个实施方案中，所述非人类动物是小鼠。
在第二方面，本发明涉及本发明所述的任一种非人类动物的后代。所述后代可以由本发明所述的任一种非人类动物与同种的任一其他动物交配产生。
在具体的实施方案中，所述后代由本发明的小鼠与下述杂交产生：pKZ1小鼠，Brca2纯合型小鼠，Tg(CAT)(+/+)小鼠，A-T突变的杂合型/纯合型小鼠，Csbm/m小鼠，胰岛素类生长因子1(insulin-likegrowthfactor1)杂合型和纯合型小鼠，P53杂合型和纯合型小鼠，辐射敏感性和耐受性转基因小鼠，精神分裂症(Schizophrenia)DISC1敲除小鼠，精神分裂症神经调节蛋白1敲除小鼠，基因工程模型肿瘤小鼠，神经炎症模型小鼠，阿尔茨海默病模型小鼠，帕金森病模型小鼠或胰岛素耐受性和易感饮食诱导的肥胖的具有2型脱碘酶基因靶向缺失(D2KO)的小鼠。
在第三方面，本发明涉及用于鉴定用于治疗受试者中TSPO-相关的疾病或病症的化合物的方法，所述方法包括给本文所述的本发明的任意非人类动物施用候选化合物，并且评估所述候选化合物对所述非人类动物的表型的影响。
在第四方面，本发明涉及用于鉴定用于治疗受试者中TSPO-相关的疾病或病症的化合物的方法，所述方法包括给本文所述的本发明的任意非人类动物施用候选化合物，并且评估所述候选化合物对可能存在于所述非人类动物中的TSPO-相关的基因产物或任意TSPO基因产物的表达水平的影响。
在第五方面，本发明涉及用于筛选用于治疗受试者中TSPO-相关的疾病或病症的候选化合物的结合特异性或选择性的方法，所述方法包括给本文所述的本发明的任意非人类动物和同种的野生型非人类动物施用候选化合物，并且将所述候选化合物对可能存在于所述野生型非人类动物中的TSPO-相关的基因产物或任意TSPO基因产物的结合特异性或选择性与所述候选化合物对可能存在于所述试验非人类动物中的TSPO-相关的基因产物或任意TSPO基因产物的结合特异性或选择性进行比较。
在一个实施方案中，本发明涉及本文所述的本发明的非人类动物，其用于鉴定用于治疗受试者中TSPO-相关的疾病或病症的化合物。
在一个实施方案中，所述非人类动物用于筛选用于治疗受试者中TSPO-相关的疾病或病症的候选化合物的结合特异性或选择性。
在另一个实施方案中，所述非人类动物用于诊断受试者中TSPO-相关的疾病或病症。
在第六方面，本发明涉及来源于第一方面的动物或其后代的细胞、组织或无限增殖化细胞系。
在第七方面，本发明涉及第六方面的细胞、组织或无限增殖化细胞系作为检测生物样品中的TSPO基因产物的阴性对照的应用。
在第八方面，本发明涉及第六方面的细胞、组织或无限增殖化细胞系作为检测来自患有或怀疑患有TSPO-相关的疾病或病症的受试者的生物样品中的TSPO基因产物的阴性对照的应用。
在第九方面，本发明涉及第六方面的细胞、组织或无限增殖化细胞系用于诊断受试者中TSPO-相关的疾病或病症的应用。
在第十方面，本发明涉及用于鉴定用于治疗TSPO-相关的疾病或病症的化合物的方法，所述方法包括将第六方面的细胞、组织或无限增殖化细胞系暴露于候选化合物，并且评估所述候选化合物对所述细胞、组织或无限增殖化细胞系的表型的影响。
在第十一方面，本发明涉及用于鉴定用于治疗受试者中TSPO-相关的疾病或病症的化合物的方法，所述方法包括将第六方面的任意细胞、组织或无限增殖化细胞系暴露于候选化合物，并且评估所述候选化合物对可能存在于所述细胞、组织或无限增殖化细胞系中的TSPO-相关的基因产物或任意TSPO基因产物的表达水平的影响。
在本发明的第十二方面，提供用于筛选用于治疗受试者中TSPO-相关的疾病或病症的候选化合物的结合特异性或选择性的方法，所述方法包括将野生型细胞、野生型组织或无限增殖化细胞系与本文所述的任意试验细胞或无限增殖化细胞系暴露于候选化合物，并且将所述候选化合物针对可能存在于所述野生型细胞、野生型组织或无限增殖化细胞系中的TSPO-相关的基因产物或任意TSPO基因产物的结合特异性或选择性与所述候选化合物针对可能存在于所述测试细胞、组织或无限增殖化细胞系中的TSPO-相关的基因产物或任意TSPO基因产物的结合特异性或选择性进行比较。
在本发明具体的实施方案中，所述TSPO-相关的疾病或病症选自由下述组成的组：癌症，神经炎症，阿尔茨海默病，帕金森病，癫痫，脑损伤，缺血-再灌损伤，行为或神经学或精神病学病症，包括急性和慢性压力，焦虑性障碍，情绪障碍(modedisorders)，和精神分裂症，周围神经病，多发性硬化症，神经性疼痛，肥胖，糖尿病和恶病质(cachexia)。
在第十三方面，本发明涉及通过第三、第四、第十或第十一方面的任一种方法鉴定的化合物。
在第十四方面，本发明涉及通式(I)的化合物抑制TSPO功能的应用，
其中
X或不存在，或是碘或是其同位素；
Y选自F，Cl，Br，I，OH，SH，NH2，CN和COOH；
Z选自N(R3)C(O)R4和C(O)NR3R4；
R1和R2独立地选自(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C3-C6)环烷基，(C6-C12)芳基，(C6-C12)芳基氧基，(C6-C12)芳基(C1-C6)烷基，杂芳基，杂芳基(C1-C6)烷基，杂环，(C2-C6)烷酰基和(C2-C7)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的1-3个取代基取代的：卤素或其同位素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C2-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH；
R3和R4分别独立地是氢或选自下述的基团：(C1-C4)烷基，(C2-C4)烯基，(C2-C4)炔基，(C3-C6)环烷基，(C6-C12)芳基，(C6-C12)芳基(C1-C4)烷基，杂芳基，杂芳基(C1-C4)烷基，杂环，(C1-C4)烷氧基羰基和(C2-C5)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的1-3个取代基取代的：卤素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C1-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH，
或者R3与R4一起是(C2-C7)亚烷基，其可以任选地由1-3个选自由下述组成的组的取代基取代：卤素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C1-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH；
m和n独立地是0，1或2；并且
p是1；
其中在每种情形
(i)烯基具有乙烯单-或二-不饱和烷基或乙烯单-或二-不饱和环烷基的意思；
(ii)环烷基具有环式烷基或烷基取代的环式烷基的意思；
(iii)杂芳基具有芳香族杂环式环系统的单一、多核、缀合的和稠合的残基的意思。
在第十五方面，本发明涉及通式(I)的化合物用于改变系统和/或细胞能量持有的应用，
其中
X，Y，Z，R1，R2，R3，R4，m，n和p如关于第十四方面的化合物所定义；并且
其中在每种情形
(i)烯基具有乙烯单-或二-不饱和烷基或乙烯单-或二-不饱和环烷基的意思；
(ii)环烷基具有环式烷基或烷基取代的环式烷基的意思；
(iii)杂芳基具有芳香族杂环式环系统的单一、多核、缀合的和稠合的残基的意思。
在第十六方面，本发明涉及通式(I)的化合物用于改变线粒体氧化途径的应用，
其中
X，Y，Z，R1，R2，R3，R4，m，n和p如关于第十四方面的化合物所定义；并且
其中在每种情形
(i)烯基具有乙烯单-或二-不饱和烷基或乙烯单-或二-不饱和环烷基的意思；
(ii)环烷基具有环式烷基或烷基取代的环式烷基的意思；
(iii)杂芳基具有芳香族杂环式环系统的单一、多核、缀合的和稠合的残基的意思。
在第十七方面，本发明涉及通式(I)的化合物用于调节线粒体ATP产生的应用，
其中
X，Y，Z，R1，R2，R3，R4，m，n和p如关于第十四方面的化合物所定义；并且
其中在每种情形
(i)烯基具有乙烯单-或二-不饱和烷基或乙烯单-或二-不饱和环烷基的意思；
(ii)环烷基具有环式烷基或烷基取代的环式烷基的意思；
(iii)杂芳基具有芳香族杂环式环系统的单一、多核、缀合的和稠合的残基的意思。
在第十八方面，本发明涉及通式(I)的化合物用于调节TSPO-介导的信号传导的应用，
其中
X，Y，Z，R1，R2，R3，R4，m，n和p如关于第十四方面的化合物所定义；并且
其中在每种情形
(i)烯基具有乙烯单-或二-不饱和烷基或乙烯单-或二-不饱和环烷基的意思；
(ii)环烷基具有环式烷基或烷基取代的环式烷基的意思；
(iii)杂芳基具有芳香族杂环式环系统的单一、多核、缀合的和稠合的残基的意思。
在第十九方面，本发明涉及通式(I)的化合物用于调节TSPO-介导的能量存储的应用，
其中
X，Y，Z，R1，R2，R3，R4，m，n和p如关于第十四方面的化合物所定义；并且
其中在每种情形
(i)烯基具有乙烯单-或二-不饱和烷基或乙烯单-或二-不饱和环烷基的意思；
(ii)环烷基具有环式烷基或烷基取代的环式烷基的意思；
(iii)杂芳基具有芳香族杂环式环系统的单一、多核、缀合的和稠合的残基的意思。
在本发明的一个实施方案中，第十四至十九方面中任一方面的应用提供对抗肥胖的保护作用。典型地，第十四至十九方面中任一方面的应用提供对抗高脂肪饮食诱导的重量增加的保护作用。
在第二十方面中，本发明涉及通式(I)的化合物用于研究与神经元损伤相关的炎症反应的应用，
其中
X，Y，Z，R1，R2，R3，R4，m，n和p如关于第十四方面的化合物所定义；并且
其中在每种情形
(i)烯基具有乙烯单-或二-不饱和烷基或乙烯单-或二-不饱和环烷基的意思；
(ii)环烷基具有环式烷基或烷基取代的环式烷基的意思；
(iii)杂芳基具有芳香族杂环式环系统的单一、多核、缀合的和稠合的残基的意思。
在本发明的一些实施方案中，n是0。
在备选的实施方案中，Y选自F，Cl，Br，I，CN和OH；Z选自N(R3)C(O)R4和C(O)NR3R4；R1和R2独立地选自(C1-C3)烷基，(C1-C3)烷氧基，(C2-C3)烯基，(C5-C6)环烷基，苯基，萘基，苯氧基，萘氧基，苄基，吡啶基，呋喃基，噻吩基，哌啶基，吗啉基，四氢呋喃基，二噁烷基，(C2-C4)烷酰基和(C2-C4)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的取代基取代：卤素，OH，(C2-C4)烷氧基，NH2，(C1-C3)烷基氨基，二((C1-C3)烷基)氨基，羧基，(C1-C3)烷氧基羰基，(C2-C4)烷酰基，氧代和酰氨基；R3和R4分别独立地是氢或选自下述的基团：(C1-C3)烷基，(C2-C3)烯基，(C5-C6)环烷基，苯基，萘基，苄基和(C2-C4)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的取代基取代：卤素，OH，(C1-C3)烷氧基，NH2，(C-C3)烷基氨基，二((C1-C3)烷基)氨基，羧基，(C1-C3)烷氧基羰基，(C2-C4)烷酰基，氧代和酰氨基，或R3与R4一起是(C2-C3)亚烷基，其可以任选地由选自由下述组成的组的取代基取代：卤素，OH，(C1-C3)烷氧基，NH2，(C1-C3)烷基氨基，二((C1-C3)烷基)氨基，羧基，(C1-C3)烷氧基羰基，(C2-C4)烷酰基，氧代和酰氨基；并且m和n独立地是0或1。
在一些实施方案中，式(I)的化合物是式(IA)的2-(4′-碘代苯基)-咪唑[1，2-a]吡啶-3-乙酰胺衍生物
其中：X是碘或其同位素；Y是卤素；并且
R3和R4独立地选自氢，(C1-C4)烷基和(C2-C4)烯基，或者R3与R4一起是(C2-C3)亚烷基。
典型地，X是125I；Y是Cl；并且R3与R4是CH2CH3，即，所述化合物是[125I]CLINDE。
在本发明备选的实施方案中，式(I)的化合物是式(IB)的衍生物
其中：Y是卤素；R1独立地选自(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C3-C6)环烷基，(C6-C12)芳基，(C6-C12)芳基氧基，(C6-C12)芳基(C1-C6)烷基，杂芳基，杂芳基(C1-C6)烷基，杂环，(C2-C6)烷酰基和(C2-C7)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由1-3个选自由下述组成的组的取代基取代：卤素或其同位素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C2-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH；并且R3和R4独立地选自氢，(C1-C4)烷基和(C2-C4)烯基，或R3与R4一起是(C2-C3)亚烷基。
典型地，Y是Cl；R1是OCH2CH2 18F；并且R3与R4是CH2CH3，即，所述化合物是[18F]PBR111。
定义
在整个说明书中，提及“一个”(“a”或“one”)成分不排除复数，除非上下文另外确定。
在整个说明书中提及“一个实施方案”、“一些实施方案”或“某个实施方案”意指联系所述实施方案所述的特定的特性、结构或特征包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个说明书的不同地方出现短语“在一个实施方案中”、“在一些实施方案中”或“在某个实施方案中”并不必然全部是指同一个实施方案，而是可能是指同一个实施方案。此外，特定的特性、结构或特征可以以任意适当的方式组合在一个或多个实施方案中，这是本领域普通技术人员从本公开内容中清楚可见的。
用于本文时，除非另外指明，用于描述常见物体的序词形容词“第一”、“第二”、“第三”等仅表示指代相似物体的不同实例，并且不意欲暗示所述的物体在时间上、空间上、排列上或以任何其他方式必须是以给定的顺序。
在本说明书的上下文中，下述术语如下述定义：
在本说明书的上下文中，术语“治疗”等是指正常的TSPO-调节的生理学中的变化以及与TSPO-相关的疾病或病症相关的症状的缓和，以及TSPO-相关的疾病或病症的消退和改善。所述治疗可以治愈所述疾病或病症，或者延缓发病。因此，在本发明的情形中，词语“治疗”或其派生词在联系治疗性应用使用时包括治疗的所有方面，诸如与被治疗的疾病或病症相关的疼痛的缓和，被治疗的疾病或病症的严重性减轻，被治疗的疾病或病症的一种或多种症状的改善，在被治疗的受试者的整体康乐方面的改善。词语“治疗”或其派生词的使用应该理解为意指被“治疗的”患者可能经历前述益处中的任意一种或多种。
用在本文中时，“核酸”包括寡核苷酸，多核苷酸，核苷酸以及它们的片段或部分，和基因组或合成来源的DNA或RNA，其可以是单链的或双链的，并且表示有义链或反义链。当“核酸”用来指特定的核酸序列时，“核酸”旨在包括编码特定转录物的多核苷酸或在功能上等价于RNA分子所述及的转录物的RNA分子。
“核苷酸”包括，但不限于，包括与糖连接的碱基的单体，如嘧啶、嘌呤或其合成的类似物，或与氨基酸连接的碱基，如在肽核酸(PNA)中。核苷酸是多核苷酸中的一个单体。核苷酸序列包括多核苷酸中碱基的序列。
“TSPO-相关的基因产物”用在本文中是功能上与TSPO基因产物相关联的任意基因产物。所述TSPO-相关的基因产物可以是任意包括TSPO基因产物的信号转导途径上游或下游的任意基因产物。所述TSPO-相关的基因产物可以是蛋白或mRNA转录物，并且不必然必须在信号转导途径中紧接在TSPO基因产物的上游或下游。
“基因”是指编码蛋白的DNA序列，并且其可以或可以不包含内含子、外显子、调节序列，如启动子或增强子序列和5’不翻译区。
“转录物”在本文中提及是来源于编码基因或核酸的转录的RNA分子。
与基因相关的术语“敲除”是指改变所述基因的野生型序列，以使没有功能性基因产物产生。术语“基因产物”包括基因的转录物以及由所述转录物翻译的蛋白。例如，野生型基因序列的核苷酸的突变、插入或缺失可以导致基因表达的完全沉默，或导致所改变的基因的表达，从而仅产生非功能性转录物。非功能性转录物不能翻译成功能性蛋白。如果仅有基因的一个等位基因被改变，则被敲除的基因称为“杂合敲除”。如果两个等位基因都已经被改变，则所述敲除称为“纯合敲除”。按照本领域的常规，杂合基因敲除用“het”或“+/-”表示，而纯合敲除用“hom”或“-/-”表示。如果基因的两个等位基因都保持不变(即，具有野生型序列)，其表示为“wt”或“+/+”。
术语“蛋白”、“多肽”和“肽”意指由通过肽键连接在一起的氨基酸组成的聚合物。除非上下文指明或另外要求，术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。因此，为了本发明的目的，“多肽”可以组成全长蛋白或全长蛋白的一部分。本发明的“蛋白”、“肽”或“多肽”还包括天然存在的和合成的变体和其片段。
用于本文时，术语“烷基”在其意义内包括直链的或支链的烷基基团。所述基团的实例是甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，仲-丁基，叔-丁基，戊基，异戊基，仲-戊基，1，2-二甲基丙基，1，1-二甲基-丙基，己基，4-甲基戊基，1-甲基戊基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，1，1-二甲基丁基，2，2-二甲基丁基，3，3二甲基丁基，1，2-二甲基丁基，1，3-二甲基丁基，1，2，2-三甲基丙基和1，1，2-三甲基丙基。
用于本文时，术语“环烷基”是指环烷基基团，或烷基取代的环烷基基团。此类基团的实例包括环丙基，甲基环丙基，环丁基，甲基环丁基，环戊基，甲基环戊基，环己基等。
用于本文时，术语“烷氧基”是指式烷基-O-的基团，其中所述烷基基团如上文定义。
用于本文时，术语“烯基”在其意义内包括乙烯单-或二-不饱和的如前文定义的烷基或环烷基基团。此类烯基基团的实例是乙烯基，烯丙基，1-甲基乙烯基，丁烯基，异丁烯基，3-甲基-2-丁烯基，1-戊烯基，环戊烯基，1-甲基-环戊烯基，1-己烯基，3-己烯基，环己烯基，1，3-丁二烯基，1，4-戊二烯基，1，3-环戊二烯基，1，3-己二烯基，1，4-己二烯基，1，3-环己二烯基和1，4-环己二烯基。
用于本文时，术语“炔基”在其意义内包括乙炔不饱和的前文定义的烷基基团。此类炔基基团的实例是乙炔基，丙炔基，正丁炔基，正戊炔基，3-甲基-1-丁炔基，正己炔基和甲基-戊炔基。
用于本文时，术语“亚烷基”是指任选地不饱和的二价烷基基团。此类基团的实例是-CH2CH2-，-CH＝CH-，-CH2CH2CH2-，-CH2CH＝CH-，-(CH2)4-，-CH2CH2CH＝CH-，-CH2CH＝CHCH2-和-(CH2)r-，其中r为5-7。该术语还任选地指不饱和的二价烷基基团，其中所述基团的一个或多个键形成环系统的一部分。
用于本文时，术语“芳基”是指芳香烃的单一、多核、缀合的和稠合的残基。此类基团的实例是苯基，联苯基，萘基，四氢萘基，茚基和薁基。所述芳香族残基的任意可用的位置可以用于连接式(I)分子的其余部分。
用于本文时，术语“芳基氧基”是指式芳基-O-的基团，其中所述芳基基团如上文定义。
用于本文时，术语“杂芳基”是指芳香族杂环式环系统的单一、多核、缀合的和稠合的残基。此类基团的实例是吡啶基，4-苯基吡啶基，3-苯基吡啶基，噻吩基，呋喃基，吡咯基，吲哚基，哒嗪基，吡唑基，吡嗪基，噻唑基，嘧啶基，喹啉基，异喹啉基，苯并呋喃基，苯并噻吩基，嘌呤基，喹唑啉基，吩嗪基，吖啶基，苯丙噁唑基，苯并噻唑基等。所述杂芳香族残基的任意可用位置用于连接式(I)分子的其余部分。
用于本文时，术语“杂环”是指任意3-至12-元的单环、双环或多环式环，对于3-和4-元环，包含一个杂原子；对于5-元环，包含一个或两个杂原子；对于6-和7-元环，包含一至三个杂原子；对于8-和9-元环，包含一至四个杂原子；对于10-和11-元环，包含一至五个杂原子；对于12-元环，包含一至六个杂原子；所述杂原子独立地选自氧、氮和硫。术语“杂环”包括其中杂环与苯环稠合的任意基团。杂环的实例是吡咯基，嘧啶基，喹啉基，异喹啉基，吲哚基，哌啶基，吡啶基，呋喃基，硫代苯基，四氢呋喃基，咪唑基，噁唑基，噻唑基，芘基，噁唑烷基，异噁唑基，异噻唑基，异噁唑烷基，咪唑烷基，吗啉基，吡咯烷基，吡唑基，吡唑啉基，糠基，噻吩基，苯并噻吩基，苯并噁唑基，苯并异噁唑基，苯并噻唑基，苯并异噻唑基，苯并噻二唑基，四唑基，三唑基，噻二唑基，苯并咪唑基，吡咯啉基，奎宁环基，氮杂降冰片基(azanorbornyl)，异奎宁环基等。含氮的杂环可以在氮处被氧原子取代。含硫的杂环可以在硫处被一个或两个氧原子取代。形成不稳定的杂环的杂原子的构型不包括在“杂环”定义的范围内。
用于本文时，术语“烷酰基”是指式烷基-C(O)O-的基团，其中所述烷基基团如上文定义。
用于本文时，术语“酰基”是指式QC(O)-的任意基团，其中Q是氨基，烷基氨基，二烷基氨基，烷基，烷氧基，烯基，炔基，环烷基，芳基，芳基烷基，杂芳基，在芳基烷基和杂环基，它们中的每一个可以是未取代的或被1-3个选自由下述组成的组的取代基取代：卤素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，di((C1-C4)-alkyl)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C2-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH。
在本说明书的上下文中，术语“包括(‘comprising’)”意指包括，但不必须是完全地包括。此外，词语“包括”的变化形式，诸如“包含(‘comprise’和‘comprises’)”具有相对应的变化的意思。因此，术语“包括”及其变化形式在包含的意思而不是排除的意思使用，以使另外的整数或特征可以任选地存在于记载为包含整数A或包含整数A和B等的组合物、方法等中。
术语“至少一个”当用在可选成分组的情形中时包括该组内独立选择的任意和所有成员，并且包括该组成员的任意组合。
附图简述
图1是显示TSPO敲除小鼠的产生的示意图。TSPO野生型等位基因由4个外显子组成。靶向载体由侧连外显子2和3的loxP位点和插入在外显子3与4之间的FRT-侧连的新霉素盒产生。还包括翻转酶识别靶点(FRT)以允许在较晚阶段产生条件性敲除小鼠。新霉素盒包含驱动新霉素抗性基因(neo)表达的磷酸甘油酯激酶启动子(PGK)和多聚腺苷酸化信号(pA)。野生型等位基因与靶向载体之间的同源重组在胚胎干细胞(ES)中产生靶向的等位基因。为了产生条件性敲除动物，可以通过Flp-介导的切割去除该新霉素盒，从而产生floxed等位基因。为了破坏TSPO，使用cre-介导的切割去除外显子2和3。显示了用于PCR基因分型的正向(FP)和反向引物(RP1和RP2)的位置。还显示了用于Southern印迹分析的探针的位置(“探针”)。
图2显示用于基因分型的TSPO引物设计和凝胶图像。TSPO野生型和TSPO敲除等位基因显示在图2(a)中，以及引物退火位点的大致位置及它们以后续PCR产物的长度。图2(b)显示了预测的来自TSPO敲除小鼠的PCR产物的凝胶电泳图像。
图3显示当对推定的TSPO敲除小鼠进行基因分型时获得的结果。图(A)显示当使用Southern印迹分析对动物基因分析时获得的结果。对于野生型等位基因预测8.8kb的片段，而对于敲除等位基因预测4.2kb的片段。图(B)显示当通过PCR对动物基因分型时获得的结果。野生型(+/+)等位基因产生489bp的产物，而敲除(-/-)等位基因产生246bp的产物。
图4显示使用TSPO-特异性放射性配体3H-PK11195探测TSPO敲除小鼠的肾组织的放射性配体膜结合结果。
图5显示使用探针[3H]PK11195的来自脑、眼睛、心脏、肾上腺、肾的切片的胶片放射自显影照片。用于胶片放射自显影的器官取自野生型(TSPO+/+)、杂合型(TSPO+/-)和纯合型(TSPO-/-)小鼠。左侧图像是总结合(特异性的和非特异性的)，而右侧图像是非特异性结合。图像越暗，PK11195结合越高，并且这与TSPO密度成比例。右上角的条形图对应左侧图像。
图6显示由一侧面神经轴突切断术诱导的面神经核神经炎症的胶片放射自显影照片。在杂合型小鼠(中间图)中TSPO表达的水平介于对野生型和纯合型小鼠观察到的水平之间。下部的条形图显示在野生型(TSPO+/+)、杂合型(TSPO+/-)和纯合型(TSPO-/-)小鼠中在整个小脑和右侧(面神经轴突切断术的同侧)面神经核中的TSPO水平。图像下表格中显示的数值是相对于纯合型小鼠的。
图7显示在野生型小鼠(TSPO+/+)中记录的高密度放射性示踪剂([18F]-PBR111)的PET图像，而在右侧的TSPO敲除(纯合型，TSPO-/-)小鼠中没有观察到任何一种示踪剂。肾上腺显示在圈出的区域中。
图8在下图中显示野生型小鼠(TSPO+/+)和TSPO敲除(纯合型，TSPO-/-)小鼠中放射性示踪剂([18F]-PBR111)的PET和CT图像。肾上腺显示在圈出的区域中。从黑到白的颜色表示从低到高的放射性示踪剂密度。
图9显示在0min注射放射性示踪剂后和在40min用PBR111置换后在肾上腺、心脏、肾脏和肝脏中的摄入时程。
图10显示来自使用TSPO敲除小鼠的开放场地试验的结果。通过在中心待的时间和进入中心的频率(A和B)测量焦虑样行为。通过评估活动花费的时间(timespentactive)(C)、有目标移动的距离(D)和无目标移动的距离(E)测量探测性行为。
图11显示来自使用TSPO敲除小鼠的出现试验(emergencetest)的结果。通过在hidebox中待的时间和进入hidebox的频率(A和B)测量焦虑样行为。另外，还通过评估活动花费的时间(C)、有目标移动的距离(D)和无目标移动的距离(E)测量探测性行为。
图12显示来自使用TSPO敲除小鼠的光/暗喜好性试验的结果。通过在光室中待的时间和进入光室的频率(A和B)测量焦虑样行为。另外，还通过评估活动花费的时间(C)、有目标移动的距离(D)和无目标移动的距离(E)测量探测性行为。
图13显示来自使用TSPO敲除小鼠的高架十字迷宫试验的结果。通过在openarms中待的时间和进入openarms的频率(A和B)和参与危险评估的时间与危险评估的频率(C和D)测量焦虑样行为。另外，还通过评估活动花费的时间(E)和有目标移动的距离(F)测量探测性行为。
图14显示TSPO敲除小鼠的旋转棒(rotarod)表现，其中n＝70。测量动物从旋转棒掉下之前的时间。
图15，与上图1类似，是示例开发了产生本发明所述的TSPO敲除小鼠的靶向策略的示意图。TSPO野生型等位基因由4个外显子组成。靶向载体由侧连外显子2和3的loxP位点产生，以允许外显子2和3的cre-介导的切割。野生型等位基因与该靶向构建体之间的同源重组产生TSPO靶向的等位基因。为了破坏TSPO，即，产生TSPO敲除等位基因，使用cre-介导的切割去除外显子2和3。显示了用于PCR基因分型的正向引物(P1)和两个备选的反向引物(P2和P3)的位置。还显示了用于Southern印迹分析的探针的位置(“探针”)。
图16，与上图3类似，显示推定的TSPO敲除小鼠的基因分型的结果。图(A)显示当使用Southern印迹分析对动物基因分析时获得的结果。对于野生型等位基因预测8.8kb的片段，而对于敲除等位基因预测4.2kb的片段。图(B)显示当通过PCR对动物基因分型时获得的结果。野生型(+/+)等位基因产生489bp的产物，而敲除(-/-)等位基因产生246bp的产物。
图17示例评估13种组织(肾上腺、肺、骨髓、肾、脾、肝、膀胱、心脏、胰腺、眼睛、肌肉、骨骼和脑)间相对TSPOmRNA表达时获得的结果。TSPOmRNA表达水平相对于在相应的组织中测量的通用看家基因Gapdh和Actb的mRNA水平进行标准化。
图18显示通过蛋白质印迹分析测量TSPO蛋白。检测从TSPO+/+、TSPO+/-和TSPO-/-小鼠的肾、脾和睾丸获得的裂解物，并且证实在TSPO-/-小鼠中完全不存在TSPO蛋白产物(上图)。GAPDH蛋白表达作为内部阳性对照(下图)。
图19显示使用对由TSPO+/+小鼠(左列)和TSPO-/-小鼠(右列)的肾和睾丸获得的组织切片的免疫组织化学抗体染色得到的图像。显示了在TSPO野生型小鼠的组织切片中存在TSPO和在TSPO敲除小鼠中不存在TSPO。刻度尺：500μm。
图20显示使用对由TSPO+/+小鼠(左列)、TSPO+/-小鼠(中列)和TSPO-/-小鼠(右列)获得的巨噬细胞的免疫细胞化学抗体染色获得的图像。上图显示分析TSPO蛋白的巨噬细胞的荧光图像。中图显示巨噬细胞的荧光线粒体染色(线粒体电子转运链复合物IV)。在下图中，即那个上图和中图的对应图像重合，显示TSPO蛋白主要定位在线粒体中。在上图中可见的从野生型到纯合型敲除TSPO蛋白逐渐减少以及TSPO蛋白与线粒体染色的重合确定线粒体是TSPO蛋白的主要位点，这表明在TSPO-/-小鼠中该蛋白完全不存在。在TSPO-/-小鼠中没有检测到细胞内密度或线粒体分布中的明显差别。刻度尺：20μm。
图21示例在TSPO-/-小鼠中没有组成型或可诱导的TSPO结合发生。图21a和b分别显示两种TSPO-结合配体PK11195和CLINDE/PBR111的化学结构。图21c是示例面神经轴突切断术的示意图。图21d显示使用[3H]PK11195和[125I]CLINDE的胶片放射自显影照片和在连续的脑切片上小胶质细胞激活标记抗-CD11b的免疫组织化学染色证实之前报道的TSPO+/+动物的与小胶质细胞的激活同时的损伤面神经核中TSPO配体结合的局部化诱导。相反，图21e显示尽管在损伤的面神经核中存在激活的小胶质细胞，但是在TSPO-/-小鼠中没有诱导[3H]PK11195和[125I]CLINDE的结合，由此提供[3H]PK11195和[125I]CLINDE对其各自在TSPO上的结合位点的高选择性在病理学改变的组织中得以保留的证据。图21f显示在TSPO-/-小鼠损伤的面神经核中激活的小胶质细胞的免疫荧光抗-CD11b染色。该图像揭示，TSPO敲除小鼠没有表现出与野生型动物中充分研究的小胶质细胞激活的正常表现的明显区别，即，它们也表现出激活的、神经元周小胶质细胞的特征性局部化。星形表示神经元体细胞。图21g以更高的放大率显示图21f中观察到的激活的、神经元周小胶质细胞的特征性局部化。刻度尺为100μm。星形表示神经元体细胞。图21h示例TSPO+/+、TSPO+/-和TSPO-/-小鼠在外观上是相同的(上图)。而下图显示使用放射性配体[18F]PBR111(18F-标记的[125I]CLINDE类似物)的PET/CT获得的体内图像，其显著示例了TSPO-/-小鼠不表现出配体结合(由此也证明了所用的配体的选择性)。偶发性信号来源于分泌途径，诸如来源于肠和膀胱。然而，TSPO+/+和TSPO+/-小鼠都表现出相似的配体结合分布，即，在具有高TSPO表达的器官中，主要是肾和肾上腺(圆圈)。该图像以逐级缩放显示，并且可直接比较(最高值是白色的)。图21i，[18F]PBR111的动力学，和注射后(箭头表示)用冷PBR111(1mM)置换该放射性配体以建立非特异性结合，证明了TSPO-/-小鼠在任何器官中都不具有[18F]PBR111的特异性结合，而TSPO+/+和TSPO+/-小鼠中的配体动力学表明特异性结合。(ID＝注射的剂量；误差条表示标准偏差)。
图22示例本发明所述的全部TSPO敲除的功能性影响。图22a至c显示在血液孕烯酮醇浓度(a)、生成类固醇的急性调节(StAR)蛋白P450Scc(CYP11A1)和TSPO2的mRNA表达(针对看家基因Actb和Gapdh标准化)(n＝3只/基因型)(b)和原卟啉IX(PPIX)活性单位(A.U.)/ml血液(c)(左：加入5-氨基酮戊酸(ALA)后的典型的谱，右：在PPIX水平上没有显著差异)(n＝3-5只/基因型)中没有发现TSPO+/+与TSPO-/-小鼠之间的显著差别。图22d示例TSPO+/+和TSPO-/-动物在对照或高脂肪饮食下没有表现出食物和水摄入的差异(n＝4只/基因型)。图22e显示与对照饮食相比，TSPO-/-动物以不明显的相对体重增加响应高脂肪饮食，而野生型动物在相对体重增加方面具有预期的显著增加(p＜0.05)(n＝4只/基因型)。图22f示例在整个10周期间标准化的体重发展的比较，表明显著不同的体重发展。(n＝4只/基因型)。图22g示例尽管与对照饮食相比，在高脂肪饮食下，TSPO+/+小鼠表现出预期的针对葡萄糖不耐受的趋势，TSPO-/-小鼠在每种饮食方案下针对葡萄糖注射表现出接近相同的反应(n＝4只/基因型)。
图23示例在本发明所述的TSPO-/-小鼠中改变的线粒体能量代谢。图23a是线粒体电子转运链(ETC)的示意图。图23b和23c是示例来自TSPO-/-小鼠的小胶质细胞中的基底氧消耗(OCR；b)和细胞外酸化率(ECAR；c)显著低于野生型小胶质细胞中的基底氧消耗和细胞外酸化率。图23d和23e显示来自TSPO-/-和TSPO+/+小鼠的小胶质细胞的OCR(d)和ECAR(e)测量，这示例，与在TSPO+/+小鼠的小胶质细胞中诱导的ATP产生相比，用寡霉素(3μM)抑制ATP合酶导致TSPO-/-小鼠的小胶质细胞中显著减少的ATP产生。图23f和23g显示使用解偶联剂FCCP(0.1μM)测量来自TSPO-/-和TSPO+/+小鼠的小胶质细胞的OCR(f)和ECAR(g)。所示的数据证实与野生型相比在TSPO-/-小胶质细胞中观察到的OCR和ECAR最大(储备的)呼吸作用的显著减少。
图23h和23i显示来自TSPO-/-和TSPO+/+小鼠的小胶质细胞的OCR(h)和ECAR(i)的测量。尽管用鱼藤酮和抗霉素A抑制的线粒体总呼吸容量在TSPO+/+和TSPO-/-中表现出相似的OCR，但是在TSPO-/-小胶质细胞中，ECAR显著减少。图23j示例电子转运链的抑制剂或解偶联剂的作用的组合数据(见图23d，f和h)表明TSPO-/-小胶质细胞中的质子泄露(protonleak)显著大于在TSPO+/+小胶质细胞中的质子泄露(*，p＜0.05，对于TSPO+/+，n＝14个孔，并且对于TSPO-/-小胶质细胞，n＝10个孔)。
图24示例通过在TSPO+/+，TSPO+/-和TSPO-/-小鼠的组织中[18F]PBR111正电子发射断层描记术定量获得的数据。肾上腺组织(a)，肾(b)，心脏(c)，肝脏(d)，肺(e)和脑(f)。直到在40mins用冷PBR111(1mM)置换的[18F]PBR111时间-活性曲线用箭头表示。
图25示例通过发射自显影和放射性配体结合揭示的TSPO蛋白表达。来自TSPO+/，TSPO+/-和TSPO-/-小鼠的16μm切片的受体放射性自显影，对脾切片使用[3H]PK11195(a)和(b)[125I]CLINDE，对肾切片使用[3H]PK11195(c)和[125I]CLINDE(d)，对睾丸切片使用[3H]PK11195(e)和[125I]CLINDE(f)。提供总结合以及与10μM未标记的CLINDE(CB(CL))、PK11195(CB(PK))和PBR-111(CB(PBR))的竞争性结合。3nM[125I]CLINDE和1nM[3H]PK11195的特异性结合在来自TSPO+/+和TSPO+/-小鼠的组织切片中明显可见，并且被所有3种未标记的配体置换，而在TSPO-/-组织中的结合处于背景水平且不被置换。在睾丸组织(g)和肾组织(h)中显示使用[3H]PK11195的特异性结合。在这两种组织中，与TSPO+/+小鼠相比，TSPO+/-小鼠具有大约一半的信号，并且TSPO-/-小鼠具有接近零的信号。虚线表示实验获得的数据点的非线性回归，并且数据表示为相对于TSPO+/+特异性结合的百分数。
优选实施方案的详细描述
本发明人已经令人惊讶地，并且与已公布的报道和普遍观点相反，能够产生可存活的缺少功能性TSPO基因的转基因非人类动物。本发明可以用作阴性对照用于诊断和成像目的，并且用于研究可用于治疗TSPO-相关的病症的生物活性剂。
因此，本发明提供一种转基因非人类动物，其包含具有至少一个非功能性、内源性TSPO基因拷贝的细胞。
转基因动物
所述动物可以是任意能够繁殖产生具有包含至少一个非功能性内源性TSPO基因拷贝的产物的可存活的后代的动物。例如，所述动物可以是哺乳动物，包括，但不限于，小鼠，大鼠，绵羊，狗，牛，马，非人类灵长动物，猪，猫，兔，山羊，白鼬，豚鼠，沙鼠或仓鼠。所述动物还可以是鸟，包括，但不限于，鸡，鸭或鹌鹑。所述动物可以是昆虫，包括，但不限于，蝇类，诸如属于果蝇属(Drosophila)家族的那些，诸如黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)。所述动物还可以是鱼，包括，但不限于，属于鲤科(Cyprinidae)家族的那些。例如，鱼可以是斑马鱼或青鳉(medakafish)。所述动物还可以是属于蛭纲(Hirundinea)家族的水蛭。
在本发明的一个实施方案中，所述动物是鼠科(Murine)家族的成员。在进一步的实施方案中，所述动物是小鼠。
例如，转基因动物可以是任意具有被稳定且故意修饰的基因组的动物，其能够将该修饰遗传给后代。通常，转基因动物具有包含一些外源DNA的基因组，其中外源DNA是如果不是对所述基因组进行故意修饰在所述转基因动物的基因组中不存在的任意DNA序列。例如，所述外源DNA序列可以对应于一种或多种基因的全部或部分，外显子的全部或部分，启动子区域，和增强子序列，共有序列，终止密码子，起始密码子，选择标记，荧光标签，或同源重组位点。
应该理解，对基因组的修饰通过转基因动物的生殖系遗传，以使转基因动物中的每个细胞包含该修饰的遗传物质。还应该理解，一旦结合到转基因动物的基因组中以使其通过所述转基因动物的生殖系遗传的外源DNA序列也可以是内源DNA序列。
例如，非功能性内源性TSPO基因是这样的一种基因，其在细胞中不产生TSPO基因产物，或在细胞中产生非功能性TSPO基因产物。TSPO基因产物是TSPO基因表达的产物，并且，例如，可以是TSPO基因转录的产物或TSPOmRNA转录物翻译的产物。非功能性TSPO基因产物是一种这样的产物，其在某种方式上不同于正常(对照)的TSPO基因产物，并且，例如，可以是非功能性mRNA转录物(在转录后修饰之前或之后)，或是非功能性多肽(在翻译后修饰之前或之后)。
使用自由访问的序列数据库，技术人员能够确定正常(对照)的TSPO基因产物由什么组成。例如，NIH遗传序列数据库，Genbank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)提供关于正常的TSPOmRNA转录物(在转录后修饰之前和之后)预测的分子量、外显子/内含子剪接边界和正常的TSPO多肽预测的分子量的信息。
非功能性TSPOmRNA转录物是不能翻译产生正常的TSPO多肽的mRNA。例如，非功能性TSPOmRNA转录物可以是这样的转录物，其包含非功能性3’不翻译区，该非功能性3’不翻译区防止所述mRNA的翻译，或者由于TSPOmRNA转录物异常的外显子/内含子边界可能进行错误的剪接。在另一个实例中，非功能性TSPOmRNA转录物可以不产生TSPO多肽。在另一个实例中，非功能性TSPOmRNA转录物可以包含一个或多个外显子的缺失，由此不产生TSPO多肽或产生剪截的TSPO多肽。
非功能性TSPO多肽是在细胞中不能进行正常TSPO多肽的全部或一些功能的多肽或是对照TSPO多肽。例如，非功能性TSPO多肽可以是在表达后不能正确折叠的多肽。非功能性TSPO多肽的非限制性实例包括具有下述的多肽：(1)在TSPO多肽中的一种或多种取代，以使一个或多个氨基酸残基不同于正常TSPO多肽；(2)TSPO多肽的一个或多个氨基酸残基的一个或多个缺失；(3)向TSPO多肽序列一次或多次添加一个或多个氨基酸残基；和(4)一个或多个氨基酸的C端或N端截短。
应该理解，仅具有一个非功能性内源性TSPO基因拷贝的细胞可以具有一个功能性内源性TSPO基因拷贝，其可以产生功能性TSPO基因产物。
在本发明的另一个实施方案中，所述转基因动物可以包含具有两个非功能性内源性TSPO基因拷贝的细胞。这些细胞将不能产生功能性TSPO蛋白产物。本领域技术人员应该理解，当与野生型细胞和具有两个非功能性TSPO基因拷贝的细胞相比时，具有一个非功能性TSPO基因拷贝的细胞将表达不同水平的功能性TSPO蛋白产物。
在本发明的另一个实施方案中，所述非功能性内源性TSPO基因包含至少一个突变，该突变防止TSPO基因产生正常的TSPO基因产物或任意的TSPO基因产物。例如，所述突变可以是一个或多个核苷酸的缺失或插入，移码突变，重排或一个或多个核苷酸的取代。例如，缺失可以是缺失一个或多个外显子，或者突变可以是用无义序列取代TSPO启动子区域的一部分或全部。例如，突变可以发生在外显子、内含子或内含子/外显子剪接位点中。突变可以发生在该基因上游的5’转录起始区或发生在对应于mRNA转录物的3’不翻译区的区域中。例如，在重组事件的情形中，缺失可以与插入同时发生，并且插入可以包括多于、少于或与缺失相同数目的核苷酸。
非功能性内源性TSPO基因可以包含多于一个突变，并且这些突变可以是相同类型的或不同类型的。所述突变可以发生在该基因的不同区域。例如，TSPO基因可以包含在外显子中的移码突变以及一个或多个核苷酸的缺失。在另一个实例中，TSPO基因可以包括一个或多个核苷酸的依次或多次插入，所述核苷酸包含重组共有序列。在另一个实例中，TSPO基因可以包含一个或多个核苷酸(所述核苷酸包含重组共有序列)的至少两次插入，以及在所述插入的一侧缺失一个或多个核苷酸。
在一个实施方案中，非功能性内源性TSPO基因包含含有TSPO基因的外显子1、2、3或4的全部或部分的缺失的突变。在另一个实施方案中，非功能性内源性TSPO基因包含含有TSPO基因的外显子2或外显子3的全部或部分的突变。例如，所述突变可以包含外显子2的全部或部分的缺失，外显子3的全部或部分的缺失，或外显子2和3的全部或部分的缺失。典型地，所述突变是外显子2和3的缺失。在另一个实例中，所述突变可以包含仅外显子1的全部或部分的缺失，外显子2的全部或部分的缺失，或外显子1和2的全部或部分的缺失。外显子1、2、3或4的全部或部分的缺失是可以防止TSPO基因产生TSPO基因产物或产生正常的TSPO基因产物的任意缺失。
技术人员将知晓可以用来产生本发明的转基因动物的方法。通常，所述方法依赖于通过将人工DNA结合到多能细胞(诸如，例如，胚胎干细胞(ES))或在不同发育阶段的胚胎细胞中的基因破坏。用于引入人工DNA的方法可以依赖于胚胎细胞的发育阶段。已经转染了人工DNA的ES细胞可以用来定殖胚胎并且产生祖先转基因动物(founder，transgenicanimals)。
祖先动物可以繁殖、近交、远交或杂交以产生特定动物群体。筛选并评价转基因动物，以选择具有目的基因型的那些动物。例如，可以使用Southern印迹分析或PCR技术分析动物组织以验证至少一个非功能性TSPO基因拷贝在所述动物的基因组中的存在而进行初始的筛选。还可以使用下述技术评估TSPO基因在转基因动物不同组织中的mRNA表达水平，所述技术包括，但不限于，从动物获得的组织样品的Northern印迹分析，原位杂交分析，和反转录酶-PCR(rt-PCR)。组织中TSPO蛋白表达的水平可以使用对TSPO特异性的抗体通过常规的免疫学技术或使用TSPO-结合化合物或配体的受体结合测定进行确定。
可以用于向胚胎干细胞中引入包含具有一个或多个突变的TSPO基因的人工DNA的方法的非限制性实例包括同源重组和基因捕获技术。使用loxP-Cre重组酶系统和人工DNA构建体的同源重组通常用于产生转基因动物，并且特别地产生属于鼠科家族的转基因动物。在本发明的具体的实施方案中，所述转基因动物是使用常规的Cre/lox繁殖方法产生的。例如，包含具有至少一个含有作为外显子2或外显子3的缺失的突变的非功能性内源性TSPO基因拷贝的细胞的转基因动物可以使用同源重组产生。例如，具有对具有外显子2和3缺失的TSPO基因纯合的基因组的转基因小鼠的产生可以包括使具有包含外源Cre重组酶基因的基因组的转基因小鼠与具有对包含两个侧连TSPO基因的外显子2和3的loxP位点的TSPO基因纯合的基因组的转基因小鼠杂交的步骤。
在本发明的一个实施方案中，所述非功能性内源性TSPO基因包含组成型突变。组成型突变意指TSPO基因中防止TSPO基因在转基因小鼠的每个细胞中产生TSPO基因产物或正常的TSPO基因产物的突变。在本发明的另一个实施方案中，TSPO基因包含条件型的突变。例如，条件型的突变是防止TSPO基因仅在选择的转基因动物细胞中或仅在转基因动物发育过程中的所选的时间产生TSPO基因产物或正常的TSPO基因产物的一种突变。
技术人员应该理解，可以操作用于产生转基因动物的常规方法，诸如例如，loxP-Cre重组酶系统，以使仅特定的细胞和/或组织、或在特定时间的细胞和和/或组织包含非功能性的基因。可以改造用于产生转基因动物的适当的DNA构建体，以可操作性地连接仅在特定的细胞类型或在特定的时间有活性的调节元件，如启动子或增强子。术语“可操作性地连接”意指DNA序列和一种或多种调节序列(即，启动子)以这样的方式连接，即，当适当的分子(即，转录因子)与所述调节序列结合时，允许基因表达。使用与调节元件可操作性连接的DNA构建体允许目的基因的靶向表达。本领域技术人员可以容易地确定允许人工DNA构建体例如在需要的细胞和/或组织中或在需要的时间表达的适当的启动子或增强子。细胞/组织-特异性或时间-特异性(即，暂时的)表达不需要在除需要的细胞和/或组织之外的细胞和/或组织中完全缺失表达，或者在除优选的时间之外的时间完全缺失表达。相反，“细胞-特异性的”或“组织-特异性的”或“时间-特异性的”表达是指特定的DNA序列在优选的细胞类型或组织中或在优选的时间的大部分表达。
例如，产生本发明的转基因小鼠可以包括将包含由肾细胞-特异性启动子控制的外源性Cre重组酶基因的转基因小鼠与具有含有两个loxP位点插入(其侧连TSPO基因的外显子2)的TSPO基因的转基因小鼠杂交。在该情形中，所得到的转基因小鼠的每个细胞可以包含相同的遗传物质。每个小鼠的遗传物质将包括含有Cre重组酶基因的外源DNA，以及含有两个loxP位点插入的TSPO基因。Cre重组酶可以仅在肾细胞中表达，所述肾细胞表达适当的转录因子，以由肾细胞-特异性启动子起始Cre重组酶的表达。因此，所述肾细胞可以仅是包含至少一个具有防止TSPO基因产生TSPO基因产物或产生正常的TSPO基因产物的突变的非功能性内源性基因拷贝，其中所述突变是TSPO基因外显子2的缺失。
在另一个非限制性的实例中，本发明的转基因动物的产生可以包括将包含由暂时启动子(例如，仅当动物达到成年时激活的启动子)控制的外源Cre重组酶基因的转基因小鼠先与具有包含两个loxP位点插入(其侧连TSPO基因的转录起始区)的修饰的内源性TSPO基因的转基因小鼠杂交的步骤。在该情形中，得到的转基因小鼠的每个细胞可以包含相同的遗传物质。每只小鼠的遗传物质包括包含Cre重组酶基因的外源DNA，以及包含两个loxP位点插入的TSPO基因。Cre重组酶可以仅在小鼠达到成年时在细胞中表达，并且在所述细胞中存在起始Cre重组酶表达的适当的转录因子。因此，仅当小鼠达到成年时，成年小鼠中的细胞可以包含至少一个具有防止TSPO基因产生TSPO基因产物或产生正常的TSPO基因产物的突变的非功能性内源性基因拷贝，其中所述突变是TSPO基因转录起始区的缺失。
应该理解，对任意所需要的突变纯合的小鼠可以通过使对所需要的突变杂合的小鼠经由标准方法杂交而产生。
在一个实施方案中，本发明涉及本文所述的任意包含具有至少一个非功能性外源性TSPO基因拷贝的转基因非人类动物的后代。
所述后代可以来自任意的繁殖产生。例如，所述后代可以来自第三代非人类转基因动物的非人类转基因动物。例如，所得到的后代可以包含一个或两个所述非功能性内源性TSPO基因拷贝。例如，所得到的后代可以对由繁殖对指定的任意基因型是杂合的或纯合的。
所述后代可以由本发明的非人类动物与同种的任意其他动物的交配产生。例如，所述后代可以由本发明的非人类动物与同种的具有不同遗传修饰的转基因动物交配产生。在另一个实例中，所述后代可以由本发明的非人类动物与同种的任意野生型动物交配产生。
在另一个实施方案中，本发明涉及由本文所述的任意包含具有至少一个非功能性内源性TSPO基因拷贝的细胞的转基因小鼠繁殖产生，所述转基因小鼠包括，但不限于，pKZ1小鼠，Brca2纯合型小鼠，Tg(CAT)(+/+)小鼠，A-T突变的杂合型/纯合型小鼠，Csbm/m小鼠，胰岛素类生长因子1杂合型和纯合型小鼠，P53杂合型和纯合型小鼠，辐射敏感性和耐受性转基因小鼠，精神分裂症DISC1敲除小鼠，精神分裂症神经调节蛋白1敲除小鼠，基因工程模型肿瘤小鼠，神经炎症模型小鼠，阿尔茨海默病模型小鼠，帕金森病模型小鼠或胰岛素耐受性和易感饮食诱导的肥胖的具有2型脱碘酶基因靶向缺失(D2KO)的小鼠。
与转基因非人类动物相关的方法和应用
本发明的转基因非人类动物特别用于涉及TSPO功能和TSPO-相关的病症的体内研究和TSPO-相关的基因产物或直接或间接与TSPO相互作用的化合物的研究。然而，所述动物还可以用于TSPO功能和TSPO-相关的病症的体外研究。TSPO-相关的基因产物是在功能上与TSPO基因产物相关联的任意基因产物。TSPO-相关的基因产物可以是在包括TSPO基因产物的任意信号转导途径上游或下游的任意基因产物。TSPO-相关的基因产物可以是蛋白或mRNA转录物，并且并不必然在信号转导途径中必须紧接着TSPO基因产物的上游或下游。例如，TSPO-相关的基因产物可以是与TSPO基因的转录起始区结合并且起始转录的转录因子。在另一个实例中，TSPO-相关的基因产物可以是细胞中响应TSPO-介导的类固醇产生而表达的蛋白。
在一个实施方案中，本发明涉及来源于本文所述的任意包含具有至少一个非功能性内源性TSPO基因拷贝的细胞的转基因非人类动物的细胞、组织和无限增殖化细胞系。本发明还涉及来源于本文所述的任意包含具有至少一个非功能性内源性TSPO基因拷贝的细胞的转基因非人类动物的后代的细胞、组织和无限增殖化细胞系。
所述细胞或无限增殖化细胞系可以是由任意动物提取、获得和/或来源于任意动物的任意的细胞，所述细胞包括，但不限于，生殖细胞，干细胞，神经细胞，感觉细胞，内皮细胞，心脏细胞，平滑肌细胞，成骨细胞，黑素细胞，肝细胞，肾细胞，肾上腺细胞，造血细胞和脂肪细胞。
技术人员知晓怎样由从动物得到的细胞和组织产生无限增殖化的细胞。
所述组织可以是从任意动物得到的任意组织，包括，但不限于，脑组织，肾组织，肺组织，心脏组织，肾上腺组织和性腺组织。例如，所述组织可以是健康的组织，或者可以包括恶性病。
所述组织和细胞可以由取自本文所述的本发明的任意动物的任意生物样品获得或由其提取。生物样品的非限制性的实例包括组织切片，诸如活组织检查和尸体解剖样品，取自组织学目的的切片，诸如冷冻的切片，血液，血浆，血清，痰液，大便，泪水，粘液，毛发，和皮肤。生物样品还包括淋巴液，腹水液(asceticfluid)。生物样品还包括记录的样品，诸如具有治疗或输出历史的那些样品。
生物样品可以立即获得并使用或者可以在使用之前保存在适当的条件下。对于特定的实施方案，适当的条件是允许在基本上防止或延缓TSPO基因产物或TSPO相关的基因产物的降解的条件下存储需要的时间期间的那些条件。一种或多种另外的成分可以包含在生物样品中。可以包含的另外的成分的实例是抑制生物样品的蛋白质成分降解的蛋白酶抑制剂，抑制生物样品的核酸成分降解的RNA酶抑制剂或DNA酶抑制剂，和使样品的细菌污染最小化的防腐剂或其他抗菌成分。另外的成分可以在采集过程中加入或者在采集后、在存储之前或之后加入，并且可以在所述生物样品用于检测或分析TSPO基因产物或TSPO相关的基因产物的应用过程中保留，或者可以在使用所述生物样品检测或分析TSPO基因产物或TSPO相关的基因产物之前去除或灭活。
本发明的动物、后代、细胞、组织和无限增殖化细胞系可用于研究和分析TSPO-相关的疾病或病症，包括改变的TSPO与其他化合物或蛋白的相互作用。TSPO-相关的病症可以是受试者中以正常TSPO表达或正常TSPO功能的扰动为特征的任意病症。与正常TSPO功能或表达相关的特征可以在对照中发现。例如，当异常的TSPO功能或表达与疾病病况相关时，指示正常TSPO功能或表达的适当的对照可以包括不患有TSPO-相关的病症的个体或据信不患有TSPO-相关的病症的群体标准的个体。适合用于确定正常的TSPO功能的对照可以包括基于已知的或确定的群体标准或值的实验室标准或值，并且可以以允许容易比较所测量的、试验确定的值的图表或表格的形式提供。
TSPO-相关的疾病和病症的非限制性实例包括癌症、神经炎症，阿尔茨海默病，帕金森病，癫痫，脑损伤，缺血-再灌损伤，行为或神经学或精神病学病症，包括急性和慢性压力，焦虑性障碍，情绪障碍，和精神分裂症，周围神经病，多发性硬化症，神经性疼痛，肥胖，糖尿病和恶病质。
受试者可以具有遗传的、获得性的、诱导的或暂时的TSPO-相关的疾病或病症。由此，受试者可以在其生命的任意具体的阶段被诊断为患有TSPO-相关的疾病或病症，而与所述受试者之前是否被诊断不患有TSPO-相关的疾病或病症无关。
本发明的动物、后代、细胞、组织和无限增殖化细胞系特别用于对来自动物的生物组织中TSPO基因产物的成像，以及检测来自动物的生物样品中的TSPO基因产物和检测TSPO-相关的基因产物。
在本发明的方法中，“检测”(“detecting”或“detection”)意指确定样品中基因产物的存在、不存在、活性或量，并且可以包括定量样品中基因产物的量或定量生物样品中基因产物的活性。定量，以及由此的检测，包括相对的定量，诸如当通过与对照样品比较评估给定的测试样品中TSPO基因产物的存在时，并且发现所述测试样品包含多于、少于对照样品或与对照样品大约相同量的TSPO基因产物。在该情形中，来自本发明的对非功能性内源性TSPO基因纯合的动物的生物样品可以用作阴性对照样品。此外，来自对非功能性内源性TSPO基因杂合的动物的生物样品可以用作对照样品，其表明低于野生型动物的TSPO基因产物表达水平，或定量和定性揭示由于失去一个功能性TSPO等位基因引起的差异性的药物代谢动力学或药效学差异。
检测还包括将样品中的TSPO基因产物与所述样品中可检测的另一种分析物比较。例如，给定测试样品中TSPO基因产物的量可以相对于内部参比标记进行定量。检测还包括绝对定量，以便可以确定样品中TSPO基因产物的量，并且以适当的单位表示，例如，以单位/样品体积，诸如克，微克，纳克，皮克，飞克等/毫升、微升、纳升等。技术人员应该理解，在检测测试样品中的TSPO基因产物时，还可以同时确定TSPO基因产物的物理特征，诸如分子量，关于核酸探针、抗体或天然和/或合成的化合物的结合能力。
应该理解，制备用于本发明的方法的生物样品可以通过任意适当的方式进行，其可以取决于要成像或检测的TSPO基因产物和所用的检测或成像技术。所述TSPO基因产物可以是任意适当的基因产物，包括，但不限于，核酸，例如，mRNA或cDNA转录物等，和TSPO多肽，及其片段。
当需要检测或成像或功能检测TSPO多肽或其片段时，样品可以通过任意适合用于分析样品中的一种或多种多肽的方式制备，例如，包括，粗匀浆样品，从所述样品提取总蛋白，从所述样品提取磷酸化的蛋白，由所述样品制备多肽片段，由所述样品制备冷冻部分(cryosections)和/或由所述样品制备固定的细胞或组织切片。TSPO多肽或其片段可以通过建立的蛋白测定和成像方法进行成像或检测，包括，但不限于，(i)涉及抗体或探针与TSPO多肽或其片段结合的免疫测定方法；和(ii)蛋白质组和质谱法。
免疫测定技术和流程通常记述在Price和Newman，″PrinciplesandPracticeofImmunoassay(免疫测定原理和实践)，″第2版，(Grove′sDictionaries，1997)；和Gosling，″Immunoassays：APracticalApproach(免疫测定：实践方法)，″(OxfordUniversityPress，2000)中。技术人员知晓的非限制性的免疫测定法包括Western印迹，酶联免疫吸附测定(ELISA)，IgM抗体捕获ELISA(MACELISA)，免疫组织化学(IHC)，和免疫细胞化学(ICC)。如果需要，所述免疫测定可以是自动化的。免疫测定还可以与激光诱导的荧光，例如，流式细胞术联合使用。
本领域已知的蛋白质组和质谱法记述在“MethodsinMolecularBiology(分子生物学方法)”(Volume428ClinicalProteomics；MethodsandProtocols；Vlahou，Antonia2008)中。可用的蛋白质组测定包括本领域已知的任意蛋白质组测定，诸如，但不限于，双向凝胶电泳，质谱法(MS)，串联质谱法和多轮质谱法，和受体膜结合方法，包括使用标记的或不含标记的方法，诸如等离子共振技术(plasmon-resonancetechniques)。
用于本发明的方法中的抗体和探针可以来源于任何来源。所述抗体可以来源于任意的动物来源，并且，例如，可以是特异性结合TSPO多肽或其片段的单克隆的、多克隆的、嵌合的、多特异性的、人源化的和人单克隆和多克隆抗体。所述抗体或探针可以是商购的或可以是特异性产生的用于本发明的方法。例如，用于检测TSPO基因产物的探针可以是TSPO-特异性探针PK11195。所述探针也可以是TSPO-特异性放射性标记的探针[3H]PK11195。用于产生适当的抗体或探针的方法使本领域技术人员容易清楚的。例如，可以使用Harlow和Lane(编)，(1988)，“Antibodies-ALaboratoryManual(抗体-实验室手册)”，ColdSpringHarborLaboratory，N.Y.中所述的杂交瘤技术制备对目的靶分子特异性的单克隆抗体，其典型地包含Fab部分。
当需要检测或成像或功能性检测TSPOmRNA转录物或其片段时，样品可以通过任何适合分析样品中的一种或多种核酸的方式制备，例如，包括从所述样品提取总RNA，从所述样品提取聚A+RNA，和/或制备表示所述样品中信使RNA的表达的cDNA。所述cDNA制备物可以是总cDNA制备物，以使其表示样品中所有或基本上所有mRNA种类的文库，或者cDNA制备物可以以这样的方式制备，所述方式针对特定种类的包含进行富集，所述特定种类诸如一种或多种用于给定分析的目的标记。
例如，用于检测或成像TSPOmRNA转录物或其片段的方法可以通过来自生物样品的mRNA或其扩增的或克隆版本与对TSPO基因序列的全部或部分独特的多核苷酸杂交进行。使用标记的探针的适当的核酸检测方法在本领域中是公知的，并且包括，但不限于，RNA酶保护测定，荧光原位杂交(FISH)，原位杂交，Northern，South-Western，Northern-western和Southern印迹或差异显示。
探针可以连接到可检测的标记或其他报道分子上。典型的标记的非限制性实例包括放射性同位素，酶底物，辅因子，配体，化学发光剂或荧光剂，半抗原，和酶。例如，标记的方法和选择适于不同目的的标记的指导在Sambrook等.(在MolecularCloning：ALaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)，CSHL，NewYork，1989)和Ausubel等.(在CurrentProtocolsinMolecularBiology(现代分子生物学方法)，JohnWiley&Sons，NewYork，1998)中讨论。
例如，用于制备和使用核酸探针的方法记述在Sambrook等.(在MolecularCloning：ALaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)，CSHL，NewYork，1989)，Ausubel等.(ed.)(在CurrentProtocolsinMolecularBiology(现代分子生物学方法)，JohnWiley&Sons，NewYork，1998)和Innis等.(PCRProtocols，AGuidetoMethodsandApplications(PCR方法，方法和应用指导)，AcademicPress，Inc.，SanDiego，CA，1990)中。
在一个实施方案中，本文所述的本发明的动物、后代、细胞、组织和/或无限增殖化的细胞系用作阴性对照，用于检测TSPO基因产物或用于分析由于生物样品中不存在一种或多种功能性TSPO等位基因导致的选择性TSPO-介导的作用或适应性反应。
在特定实施方案中，所述生物样品来自患有或怀疑患有TSPO-相关的病症的受试者。
本发明的动物、后代、细胞、组织和/或无限增殖化细胞系在基于TSPO或TSPO-相关的基因产物的检测、成像或功能性研究的测定和实验中作为阴性对照的应用可以辅助TSPO-相关的疾病和病症的诊断。
应该理解，术语“诊断”包括区分在给定的时间具有和没有TSPO-相关的病症，以及区分在受试者生命过程中的任意时间具有和没有增加的发展TSPO-相关的病症的危险。例如，可以认为异常的TSPO基因表达与TSPO-相关的疾病和病症以及发展TSPO-相关的疾病和病症的趋势相关。本发明的动物、后代、细胞、组织和/或无限增殖化细胞系在与TSPO-相关的疾病和病症相关的任意其他检测中用作阴性对照。
本文所述的本发明的非人类动物、组织、细胞和无限增殖化细胞系还可以用于鉴定和筛选用治疗受试者中TSPO-相关的疾病或病症的候选化合物。
因此，候选化合物可以包括具有确定的或怀疑的针对TSPO基因产物或TSPO-相关的基因产物的亲和力的化合物。候选化合物的非限制性实例包括PK11195，Ro54864，PBR111和CLINDE。
为了用于治疗TSPO-相关的疾病或病症，候选化合物通常需要关于其针对目的靶标(诸如TSPO或TSPO-相关的基因产物)的特异性和选择性的表征。可以在本发明所述的非人类动物、组织、细胞或无限增殖化细胞系模型中，即，在目的靶标不存在或以低于野生型模型的水平表达的模型中，确定地建立选择性或特异性结合或相互作用与同其他靶标的非选择性和非特异性结合或相互作用的区分。研究已表明TSPO在大部分物种中是高度保守的，这允许将来源于使用非人类动物的研究的有意义的信息应用于人和其他受试者中的TSPO-相关的疾病和病症。
关于所述候选化合物，结合选择性是所述化合物相对于另一种靶标结合特定靶标的亲和力的测量。结合特异性可以在数字上表示为选择性系数。结合特异性涉及候选化合物可以结合靶分子的方式。
因此，本文所述的本发明的非人类动物、组织、细胞和无限增殖化细胞系可以用于多种筛选和鉴定测定。例如，已经筛选并鉴定了怀疑影响TSPO表达和活性或TSPO-相关的基因产物的表达和活性的多种化合物可用于治疗受试者中TSPO-相关的疾病和病症。
在本发明的某些非限制性的实施方案中，可用于治疗TSPO-相关的疾病或病症的化合物是如在美国专利6,379,649(其公开内容通过引用结合在本文中)中公开的通式(I)的化合物：
其中
X或不存在，或是碘或是其同位素；
Y选自F，Cl，Br，I，OH，SH，NH2，CN和COOH；
Z选自N(R3)C(O)R4和C(O)NR3R4；
R1和R2独立地选自(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C3-C6)环烷基，(C6-C12)芳基，(C6-C12)芳基氧基，(C6-C12)芳基(C1-C6)烷基，杂芳基，杂芳基(C1-C6)烷基，杂环，(C2-C6)烷酰基和(C2-C7)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的1-3个取代基取代的：卤素或其同位素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C2-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH；
R3和R4分别独立地是氢或选自下述的基团：(C1-C4)烷基，(C2-C4)烯基，(C2-C4)炔基，(C3-C6)环烷基，(C6-C12)芳基，(C6-C12)芳基(C1-C4)烷基，杂芳基，杂芳基(C1-C4)烷基，杂环，(C1-C4)烷氧基羰基和(C2-C5)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的1-3个取代基取代的：卤素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C1-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH，
或者R3与R4一起是(C2-C7)亚烷基，其可以任选地由1-3个选自由下述组成的组的取代基取代：卤素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C1-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH；
m和n独立地是0，1或2；并且
p是1；
其中在每种情形
(i)烯基具有乙烯单-或二-不饱和烷基或乙烯单-或二-不饱和环烷基的意思；
(ii)环烷基具有环式烷基或烷基取代的环式烷基的意思；
(iii)杂芳基具有芳香族杂环式环系统的单一、多核、缀合的和稠合的残基的意思。
用于所述方法的式(I)化合物的非限制性实例包括下述化合物，其中：
Y选自F，Cl，Br，I，CN和OH；
Z选自N(R3)C(O)R4和C(O)NR3R4；
R1和R2独立地选自(C1-C3)烷基，(C1-C3)烷氧基，(C2-C3)烯基，(C5-C6)环烷基，苯基，萘基，苯氧基，萘氧基，苄基，吡啶基，呋喃基，噻吩基，哌啶基，吗啉基，四氢呋喃基，二噁烷基，(C2-C4)烷酰基和(C2-C4)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的取代基取代：卤素，OH，(C2-C4)烷氧基，NH2，(C1-C3)烷基氨基，二((C1-C3)烷基)氨基，羧基，(C1-C3)烷氧基羰基，(C2-C4)烷酰基，氧代和酰氨基；
R3和R4分别独立地是氢或选自下述的基团：(C1-C3)烷基，(C2-C3)烯基，(C5-C6)环烷基，苯基，萘基，苄基和(C2-C4)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的取代基取代：卤素，OH，(C1-C3)烷氧基，NH2，(C-C3)烷基氨基，二((C1-C3)烷基)氨基，羧基，(C1-C3)烷氧基羰基，(C2-C4)烷酰基，氧代和酰氨基，
或R3与R4一起是(C2-C3)亚烷基，其可以任选地由选自由下述组成的组的取代基取代：卤素，OH，(C1-C3)烷氧基，NH2，(C1-C3)烷基氨基，二((C1-C3)烷基)氨基，羧基，(C1-C3)烷氧基羰基，(C2-C4)烷酰基，氧代和酰氨基；并且
m和n独立地是0或1。
用于所述方法的式(I)化合物的非限制性实例包括是式(IA)的2-(4′-碘代苯基)-咪唑[1，2-a]吡啶-3-乙酰胺衍生物的化合物：
其中：
X是碘或其同位素；
Y是卤素；并且
R3和R4独立地选自氢，(C1-C4)烷基和(C2-C4)烯基，或者R3与R4一起是(C2-C3)亚烷基。
式(IA)的化合物的一个典型实例是[125I]CLINDE，其中：X是125I；Y是Cl；m和n是0；并且R3和R4是CH2CH3。
备选地，用于所述方法的式(I)的化合物的非限制性实例包括是式(IB)的衍生物的化合物：
其中：
Y是卤素；
R1独立地选自(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C3-C6)环烷基，(C6-C12)芳基，(C6-C12)芳基氧基，(C6-C12)芳基(C1-C6)烷基，杂芳基，杂芳基(C1-C6)烷基，杂环，(C2-C6)烷酰基和(C2-C7)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由1-3个选自由下述组成的组的取代基取代：卤素或其同位素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C2-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH；并且
R3和R4独立地选自氢，(C1-C4)烷基和(C2-C4)烯基，或R3与R4一起是(C2-C3)亚烷基。
式(IB)的化合物的一个典型实例是[18F]PBR111，其中：Y是Cl；R1是OCH2CH2 18F；并且R3和R4是CH2CH3。
筛选和鉴定的方法和测定包括将候选化合物施用或暴露于本发明的非人类动物、组织、细胞和/或无限增殖化细胞系，并且评估这些候选化合物对所述非人类动物、组织、细胞和/或无限增殖化细胞系的表型或TSPO和TSPO-相关的基因产物在所述非人类动物、组织、细胞和无限增殖化细胞系中的表达水平的影响。所述方法可以包括比较同种的野生型非人类动物、组织、细胞和/或无限增殖化细胞系的表型或表达水平，以确定所述候选化合物可能具有的对用在所述方法中的本发明的试验非人类动物、组织、细胞和无限增殖化细胞系的表型或表达水平的作用的性质。
应该理解，动物的表型包括动物可观察到的特点，其包括，但不限于，形态，生化特征，生理和行为。这些特点可以在动物中、在来源于动物的样品(如组织或细胞)或来源于动物的无限增殖化细胞系中观察到。例如，生化特征可以包括目的基因产物的功能和相互作用。动物的表型可以受到遗传因素和外界环境因素的影响，所述外界环境因素诸如施用或暴露于候选化合物。任意基因产物的表达水平可以以绝对形式或关于对照基因产物进行测量。所述对照基因产物可以是相同的基因产物或不同的基因产物。
使用本发明的非人类动物、细胞、组织和无限增殖化细胞系筛选和鉴定候选化合物的方法可以提供不同种类的信息，包括，但不限于下述：
第一，所述方法可以揭示候选化合物在包含具有至少一个非功能性TSPO基因拷贝的细胞的动物中非选择性或非特异性结合或相互作用的量(即，结合除TSPO外的靶标的化合物的量)。第二，其中功能性TSPO基因产物不存在或以低于野生型动物的水平表达的动物可以揭示所述动物通过其补偿功能性TSPO基因产物的不存在或降低的表达(诸如TSPO-相关基因产物的不存在、减少或增加的表达)的生物学途径和机制，其又影响其他相关的或功能性相关联的基因的调节。第三，其中仅一个TSPO基因拷贝是非功能性的杂合型动物可以表现出其他相关的或功能性相关联的基因的适应性或补偿性调节，其可能与其中两个TSPO基因拷贝都是非功能性的动物所观察到的适应性的或补偿性的反应不同。
应该理解，在受试者中已知的或新候选化合物关于TSPO或TSPO-相关的基因产物的结合或功能性调节的选择性和特异性需要针对具有改变的内源性TSPO基因表达的非人类动物、组织、细胞或无限增殖化细胞系(诸如本文所述的本发明的非人类动物、组织、细胞或无限增殖化细胞系)检测这些化合物。
因此，本发明还提供用于筛选候选化合物针对TSPO或TSPO-相关的基因产物的结合特异性或选择性的方法。所述方法包括将候选化合物施用或暴露于本文所述的本发明的非人类动物、组织、细胞或无限增殖化细胞系，并且将所述候选化合物针对所述测试样品中的TSPO或TSPO-相关的基因产物的结合选择性或特异性与针对野生型动物中的TSPO或TSPO-相关的基因产物的结合选择性或特异性进行比较。
特别地，并且关于下述实施例，即，实施例13，本发明人已经表明TSPO在调节系统和/或细胞能量持有、调节线粒体氧化途径、线粒体ATP产生、和响应高脂肪饮食的能量存储中起作用。具体地，本发明人已经表明，当与野生型动物相比时，在本发明所述的TSPO敲除动物中，以持久的、高脂肪饮食形式的增加的能量摄入导致显著减少的(并且少于预测的)提供增加。因此，已经提供了TSPO和TSPO-介导的信号传导在防止由高脂肪饮食导致的肥胖中的作用。
参考下述实施例，并且特别是实施例5(图9)，以及实施例8，图15-21，本发明人已经进一步表明，按照本发明的方法，已经鉴定通式(I)的化合物是高度特异性和选择性的TSPO结合分子。如在本领域中充分确定的，特异性的和选择性的受体结合分子是有效的受体功能抑制剂，并且通常用于产生“药理学敲除”，即，如此有效地抑制受体功能，以便可以产生反映由遗传敲除获得的完全功能丧失的表型。
因此，在某些非限制性实施方案中，本发明涉及通式(I)的化合物抑制TSPO功能的应用：
其中
X或不存在，或是碘或是其同位素；
Y选自F，Cl，Br，I，OH，SH，NH2，CN和COOH；
Z选自N(R3)C(O)R4和C(O)NR3R4；
R1和R2独立地选自(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C3-C6)环烷基，(C6-C12)芳基，(C6-C12)芳基氧基，(C6-C12)芳基(C1-C6)烷基，杂芳基，杂芳基(C1-C6)烷基，杂环，(C2-C6)烷酰基和(C2-C7)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的1-3个取代基取代的：卤素或其同位素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C2-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH；
R3和R4分别独立地是氢或选自下述的基团：(C1-C4)烷基，(C2-C4)烯基，(C2-C4)炔基，(C3-C6)环烷基，(C6-C12)芳基，(C6-C12)芳基(C1-C4)烷基，杂芳基，杂芳基(C1-C4)烷基，杂环，(C1-C4)烷氧基羰基和(C2-C5)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的1-3个取代基取代的：卤素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C1-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH，
或者R3与R4一起是(C2-C7)亚烷基，其可以任选地由1-3个选自由下述组成的组的取代基取代：卤素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C1-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH；
m和n独立地是0，1或2；并且
p是1；
其中在每种情形
(i)烯基具有乙烯单-或二-不饱和烷基或乙烯单-或二-不饱和环烷基的意思；
(ii)环烷基具有环式烷基或烷基取代的环式烷基的意思；
(iii)杂芳基具有芳香族杂环式环系统的单一、多核、缀合的和稠合的残基的意思。
在其他非限制性实施方案中，本发明涉及通式(I)的化合物用于改变系统和/或细胞能量持有的应用，
其中
X或不存在，或是碘或是其同位素；
Y选自F，Cl，Br，I，OH，SH，NH2，CN和COOH；
Z选自N(R3)C(O)R4和C(O)NR3R4；
R1和R2独立地选自(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C3-C6)环烷基，(C6-C12)芳基，(C6-C12)芳基氧基，(C6-C12)芳基(C1-C6)烷基，杂芳基，杂芳基(C1-C6)烷基，杂环，(C2-C6)烷酰基和(C2-C7)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的1-3个取代基取代的：卤素或其同位素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C2-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH；
R3和R4分别独立地是氢或选自下述的基团：(C1-C4)烷基，(C2-C4)烯基，(C2-C4)炔基，(C3-C6)环烷基，(C6-C12)芳基，(C6-C12)芳基(C1-C4)烷基，杂芳基，杂芳基(C1-C4)烷基，杂环，(C1-C4)烷氧基羰基和(C2-C5)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的1-3个取代基取代的：卤素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C1-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH，
或者R3与R4一起是(C2-C7)亚烷基，其可以任选地由1-3个选自由下述组成的组的取代基取代：卤素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C1-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH；
m和n独立地是0，1或2；并且
p是1；
其中在每种情形
(i)烯基具有乙烯单-或二-不饱和烷基或乙烯单-或二-不饱和环烷基的意思；
(ii)环烷基具有环式烷基或烷基取代的环式烷基的意思；
(iii)杂芳基具有芳香族杂环式环系统的单一、多核、缀合的和稠合的残基的意思。
在其他非限制性实施方案中，本发明涉及通式(I)的化合物用于改变线粒体氧化途径的应用，
其中
X或不存在，或是碘或是其同位素；
Y选自F，Cl，Br，I，OH，SH，NH2，CN和COOH；
Z选自N(R3)C(O)R4和C(O)NR3R4；
R1和R2独立地选自(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C3-C6)环烷基，(C6-C12)芳基，(C6-C12)芳基氧基，(C6-C12)芳基(C1-C6)烷基，杂芳基，杂芳基(C1-C6)烷基，杂环，(C2-C6)烷酰基和(C2-C7)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的1-3个取代基取代的：卤素或其同位素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C2-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH；
R3和R4分别独立地是氢或选自下述的基团：(C1-C4)烷基，(C2-C4)烯基，(C2-C4)炔基，(C3-C6)环烷基，(C6-C12)芳基，(C6-C12)芳基(C1-C4)烷基，杂芳基，杂芳基(C1-C4)烷基，杂环，(C1-C4)烷氧基羰基和(C2-C5)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的1-3个取代基取代的：卤素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NF2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C1-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH，
或者R3与R4一起是(C2-C7)亚烷基，其可以任选地由1-3个选自由下述组成的组的取代基取代：卤素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C1-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH；
m和n独立地是0，1或2；并且
p是1；
其中在每种情形
(i)烯基具有乙烯单-或二-不饱和烷基或乙烯单-或二-不饱和环烷基的意思；
(ii)环烷基具有环式烷基或烷基取代的环式烷基的意思；
(iii)杂芳基具有芳香族杂环式环系统的单一、多核、缀合的和稠合的残基的意思。
在其他非限制性实施方案中，本发明涉及通式(I)的化合物用于调节线粒体ATP产生的应用，
其中
X或不存在，或是碘或是其同位素；
Y选自F，Cl，Br，I，OH，SH，NH2，CN和COOH；
Z选自N(R3)C(O)R4和C(O)NR3R4；
R1和R2独立地选自(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C3-C6)环烷基，(C6-C12)芳基，(C6-C12)芳基氧基，(C6-C12)芳基(C1-C6)烷基，杂芳基，杂芳基(C1-C6)烷基，杂环，(C2-C6)烷酰基和(C2-C7)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的1-3个取代基取代的：卤素或其同位素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C2-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH；
R3和R4分别独立地是氢或选自下述的基团：(C1-C4)烷基，(C2-C4)烯基，(C2-C4)炔基，(C3-C6)环烷基，(C6-C12)芳基，(C6-C12)芳基(C1-C4)烷基，杂芳基，杂芳基(C1-C4)烷基，杂环，(C1-C4)烷氧基羰基和(C2-C5)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的1-3个取代基取代的：卤素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C1-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH，
或者R3与R4一起是(C2-C7)亚烷基，其可以任选地由1-3个选自由下述组成的组的取代基取代：卤素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C1-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH；
m和n独立地是0，1或2；并且
p是1；
其中在每种情形
(i)烯基具有乙烯单-或二-不饱和烷基或乙烯单-或二-不饱和环烷基的意思；
(ii)环烷基具有环式烷基或烷基取代的环式烷基的意思；
(iii)杂芳基具有芳香族杂环式环系统的单一、多核、缀合的和稠合的残基的意思。
在其他非限制性实施方案中，本发明涉及通式(I)的化合物用于调节TSPO-介导的信号传导的应用，
其中
X或不存在，或是碘或是其同位素；
Y选自F，Cl，Br，I，OH，SH，NH2，CN和COOH；
Z选自N(R3)C(O)R4和C(O)NR3R4；
R1和R2独立地选自(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C3-C6)环烷基，(C6-C12)芳基，(C6-C12)芳基氧基，(C6-C12)芳基(C1-C6)烷基，杂芳基，杂芳基(C1-C6)烷基，杂环，(C2-C6)烷酰基和(C2-C7)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的1-3个取代基取代的：卤素或其同位素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C2-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH；
R3和R4分别独立地是氢或选自下述的基团：(C1-C4)烷基，(C2-C4)烯基，(C2-C4)炔基，(C3-C6)环烷基，(C6-C12)芳基，(C6-C12)芳基(C1-C4)烷基，杂芳基，杂芳基(C1-C4)烷基，杂环，(C1-C4)烷氧基羰基和(C2-C5)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的1-3个取代基取代的：卤素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C1-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH，
或者R3与R4一起是(C2-C7)亚烷基，其可以任选地由1-3个选自由下述组成的组的取代基取代：卤素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C1-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH；
m和n独立地是0，1或2；并且
p是1；
其中在每种情形
(i)烯基具有乙烯单-或二-不饱和烷基或乙烯单-或二-不饱和环烷基的意思；
(ii)环烷基具有环式烷基或烷基取代的环式烷基的意思；
(iii)杂芳基具有芳香族杂环式环系统的单一、多核、缀合的和稠合的残基的意思。
在其他非限制性实施方案中，本发明涉及通式(I)的化合物用于调节TSPO-介导的能量存储的应用，
其中
X或不存在，或是碘或是其同位素；
Y选自F，Cl，Br，I，OH，SH，NH2，CN和COOH；
Z选自N(R3)C(O)R4和C(O)NR3R4；
R1和R2独立地选自(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C3-C6)环烷基，(C6-C12)芳基，(C6-C12)芳基氧基，(C6-C12)芳基(C1-C6)烷基，杂芳基，杂芳基(C1-C6)烷基，杂环，(C2-C6)烷酰基和(C2-C7)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的1-3个取代基取代的：卤素或其同位素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C2-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH；
R3和R4分别独立地是氢或选自下述的基团：(C1-C4)烷基，(C2-C4)烯基，(C2-C4)炔基，(C3-C6)环烷基，(C6-C12)芳基，(C6-C12)芳基(C1-C4)烷基，杂芳基，杂芳基(C1-C4)烷基，杂环，(C1-C4)烷氧基羰基和(C2-C5)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的1-3个取代基取代的：卤素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C1-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH，
或者R3与R4一起是(C2-C7)亚烷基，其可以任选地由1-3个选自由下述组成的组的取代基取代：卤素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C1-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH；
m和n独立地是0，1或2；并且
p是1；
其中在每种情形
(i)烯基具有乙烯单-或二-不饱和烷基或乙烯单-或二-不饱和环烷基的意思；
(ii)环烷基具有环式烷基或烷基取代的环式烷基的意思；
(iii)杂芳基具有芳香族杂环式环系统的单一、多核、缀合的和稠合的残基的意思。
在一些实施方案中，本发明的上述应用提供针对肥胖的保护作用。在其他实施方案中，本发明的上述应用提供对抗高脂肪饮食-诱导的重量增加的保护作用。
按照本发明使用的式(I)化合物的非限制性实例包括PBR111和CLINDE。
如上文所示，并且参考实施例8和图2，TSPO敲除小鼠示例了下述令人惊讶的发现：TSPO功能的整体丧失似乎对神经元损伤后小胶质细胞的激活没有作用或仅有最少的作用。
因此，在另一个非限制性实施方案中，本发明涉及通式(I)的化合物用于研究与神经元损伤相关的炎症反应的应用，
其中
X或不存在，或是碘或是其同位素；
Y选自F，Cl，Br，I，OH，SH，NH2，CN和COOH；
Z选自N(R3)C(O)R4和C(O)NR3R4；
R1和R2独立地选自(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C3-C6)环烷基，(C6-C12)芳基，(C6-C12)芳基氧基，(C6-C12)芳基(C1-C6)烷基，杂芳基，杂芳基(C1-C6)烷基，杂环，(C2-C6)烷酰基和(C2-C7)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的1-3个取代基取代的：卤素或其同位素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C2-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH；
R3和R4分别独立地是氢或选自下述的基团：(C1-C4)烷基，(C2-C4)烯基，(C2-C4)炔基，(C3-C6)环烷基，(C6-C12)芳基，(C6-C12)芳基(C1-C4)烷基，杂芳基，杂芳基(C1-C4)烷基，杂环，(C1-C4)烷氧基羰基和(C2-C5)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的1-3个取代基取代的：卤素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C1-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH，
或者R3与R4一起是(C2-C7)亚烷基，其可以任选地由1-3个选自由下述组成的组的取代基取代：卤素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C1-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH；
m和n独立地是0，1或2；并且
p是1；
其中在每种情形
(i)烯基具有乙烯单-或二-不饱和烷基或乙烯单-或二-不饱和环烷基的意思；
(ii)环烷基具有环式烷基或烷基取代的环式烷基的意思；
(iii)杂芳基具有芳香族杂环式环系统的单一、多核、缀合的和稠合的残基的意思。
受试者
所述受试者是人类或可以不是人类。提及受试者或个体意指人类或非人类，诸如有社会、经济或研究重要性的任意物种的个体，包括，但不限于，绵羊、牛、马、猪、猫科、犬科、灵长类动物、啮齿类动物种类的成员，尤其是这些种类的驯养成员，诸如绵羊、牛、马和狗。
本领域普通技术人员应该理解，可以在不背离广泛描述的本发明的精神或范围的前提下，可以对具体的实施方案中公开的本发明进行多种变化和/或改进。因此，本实施方案应该作为示例性的而非限制性的以所有方面考虑。
实施例
实施例1：开发TSPO敲除的动物
材料和方法
构建体设计和转基因动物产生
TSPO敲除小鼠的开发由Ozgene(BentleyDC，WA，澳大利亚)进行。TSPO敲除小鼠使用Cre-Lox重组法产生。为了产生TSPO敲除小鼠，产生具有一些添加的与野生型TSPO等位基因同源的靶向构建体(见图1)。所述构建体还包含侧连外显子2和3的一对LoxP位点，其包含TSPO起始密码子、新霉素盒，以筛选所述靶向构建体以及翻转酶识别靶标(FRT)位点的成功获得。包含FRT位点，以允许在较晚的阶段产生条件型敲除小鼠。所述新霉素盒给成功结合了所述构建体的细胞赋予新霉素抗性。将所述构建体通过电穿孔递送至Bruce4小鼠胚胎干(ES)细胞中，由此允许来自所述靶向构建体的修饰的TSPO序列通过同源重组替换野生型TSPO序列。随后利用由新霉素基因赋予的G418(一种阻断真核细胞中的多肽合成的抗生素)抗性来筛选包含所述靶向构建体的ES细胞。
将所选的ES细胞注射到白化病C57BL/6胚囊中，并且植入到代孕母体中，以产生嵌合子代。将嵌合小鼠与野生型白化病C57BL/6小鼠杂交，以产生对所述修饰的TSPO序列杂合的子代。由于仅使用白化病胚囊和交配配偶，所以，任意具有黑色毛皮的子代包含所述靶向构建体。然后，使对所述修饰的TSPO序列杂合的黑色小鼠与C57BL/6Cre缺失小鼠杂交，并且选择对TSPO基因杂合的子代。将这些对TSPO和Cre重组酶基因杂合的小鼠进一步与野生型C57BL/6小鼠杂交，以去除Cre重组酶基因。然后，使对TSPO基因杂合且不表达Cre重组酶基因的子代彼此交配，以产生TSPO纯合型敲除、TSPO杂合型敲除和TSPO野生型动物。
所有的动物程序都得到悉尼大学动物伦理委员会和ANSTO动物护理和伦理委员会的核准。TSPO纯合型敲除小鼠品系已经被给予另外的命名GuwiyangWurra(在当地的Dharawal语言中为‘火鼠’)。因此，提及本发明的TSPO纯合型敲除小鼠还可以通过提及C57BL/6-TSPOtm1GuMu(GuwiyangWurra)小鼠或小鼠品系进行。
动物交配
将TSPO敲除动物交配，以便获得适当数目的TSPO纯合型敲除、TSPO杂合型敲除和TSPO野生型动物。为了评估TSPO敲除小鼠的生育力，将TSPO纯合型敲除小鼠与两个性别的TSPO纯合型和杂合型敲除小鼠交配。
出生后，然后通过粪便gDNA提取、PCR和凝胶电泳确定每只动物的基因型。将来自该代的动物用于行为评估；将不用于行为评估的动物用来建立交配群落，并且将来自该群落的后代用于产生体重和一般健康数据。
基因分型
组织基因组DNA分离
在麻醉后采集来自远端尾巴区的小鼠组织样品。剪下约1cm的远端尾巴，并且用于gDNA提取。使用PureLink基因组DNA迷你试剂盒(Qiagen)按照供应商的使用说明从组织样品收集gDNA。简言之，将尾巴剪下物放置在加入180μLPureLink基因组消化缓冲液和20μL蛋白酶K的无菌eppendorf管中。将该管短暂涡旋，并在55℃不时涡旋地温育直到完全溶解，这典型地花费大约3-4小时。完全溶解后，将裂解物在室温以10000g离心3分钟。将上清转移到加入20μLRNA酶A的新的eppendorf管中。然后，将这通过短暂涡旋混合，并且允许在室温温育2分钟。
温育后，然后向裂解物中加入200μLPureLink基因组溶解/结合缓冲液和200μL96％乙醇，并且涡旋5秒。将全部裂解物以200μL的量在室温通过PureLink离心柱以10000g离心1分钟。然后，将离心柱用500μL洗涤缓冲液1和500μL洗涤缓冲液2清洗，分别在室温以10000g离心1分钟和3分钟。每次清洗后，弃掉收集管，并且使用新的一个收集管。为了洗脱gDNA，将100μLPureLink基因组洗脱缓冲液加入到离心柱中，将离心柱放置在无菌微量离心管中，并且在室温温育1分钟后，在室温以10000g离心。在需要之前将洗脱的gDNA保存在-20℃。
使用Nanodrop2000c分光光度计分光光度测定确定gDNA的浓度。
使用基因组DNA的Southern印迹分析
通过Southern印迹对动物进行基因分型：使用从小鼠尾巴活组织检查样品分离的基因组DNA，用ScaI消化所述DNA，并且用探针杂交，对野生型等位基因产生8.8kb的片段，对敲除等位基因产生4.2kb的片段。
粪便样品基因组DNA分离
通过将单只小鼠放置在动物笼养盒中收集粪便样品，典型地在30秒内获得粪便样品。粪便样品新鲜使用，或在液氮中速冻并且保存在-80℃备用。使用QIAampDNA粪便迷你试剂盒(Qiagen)按照供应商的使用说明收集gDNA。简言之，将粪便样品在1.6mlASL缓冲液中用1mL移液管通过涡旋和研磨匀浆。然后，将样品在室温以10000g离心1分钟，将上清转移到其中加入InhibitEX片剂的新管中。将InhibitEX片剂涡旋直到溶解，并且允许在室温温育至少1分钟。温育后，将样品在室温以10000g离心3分钟，并且将每份样品的上清新管中，并再次全速离心另外的3分钟。离心后，将600μL上清移液到含有25μL蛋白酶K和600μL缓冲液AL的新管中，并且通过15秒的涡旋将这组合。然后，将混合物在70℃温育10分钟。
为了沉淀DNA，向混合物中加入600μL乙醇，并且通过短暂涡旋混合。通过离心柱在室温以10000g离心1分钟收集gDNA，并且用500μL缓冲液AW1和500μL缓冲液AW2清洗，分别在室温以10000g离心1分钟和3分钟。为了洗脱gDNA，将缓冲液AE直接转移到离心柱膜上，温育至少1分钟，并且全速离心1分钟。所用的缓冲液AE的体积取决于初始粪便样品的尺寸变化。将洗脱的gDNA保存在-20℃备用。使用Nanodrop2000c分光光度计分光光度测定确定gDNA的浓度。然后，对分离的gDNA进行PCR，以确定TSPO基因的存在。
聚合酶链式反应
对于常规基因分型，使用一组设计为区分TSPO敲除小鼠的不同基因型的三个引物对分离的gDNA进行PCR。引物组由一个正向(FP)和两个反向引物(RP1和RP2)组成(见图1)，野生型和敲除等位基因分别产生2个和1个独特的PCR产物尺寸。这允许一种基于标准凝胶电泳并在UV灯下观察来确定动物基因型的简单有效的方式。对于野生型等位基因预测的PCR产物条带尺寸为489和1501个碱基对，并且对于敲除等位基因约为246个碱基对。图2显示引物设计和预测的凝胶图像的示意图。该设计的原理避免作为指示敲除等位基因的无检测，其赋予在DNA提取或PCR设置中不混淆TSPO敲除等位基因的存在与差的或错误的表现的优点，并且允许基因分型过程中整体上较高的准确性。参见表1，在基因分型过程中使用的引物。
表1：在动物基因分型中所用的引物的序列
(FP) 5′-GGTAGACTAGTGTGGGAAGATTTGA-3′
(RP1) 5′-TAGATACTGACCCTATCTGGGATGT-3′
(RP2) 5′-ATGGTGATTGCAACTGATGTTC-3′
PCR以25μL的终体积进行，并且由5μL绿色GoTaq反应缓冲液(Promega)、1.5μLMgCL2(Promega)、0.5μLPCR核苷酸混合物(Promega)、0.625μL正向引物、0.3125μL反向1引物、0.625μL反向2引物、0.125μLGoTaq(r)热启动聚合酶(Promega)和用不含核酸酶的H2O稀释至16.3125μL的约200nggDNA组成。使用T100热循环仪(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)进行PCR。PCR扩增运行周期条件为：95℃2分钟，4个循环：95℃30秒，68℃30秒和72℃2分钟，之后是4个循环：95℃30秒，65℃30秒和72℃2分钟，之后是30个循环：95℃30秒，62℃30秒和72℃2分钟，之后是72℃5分钟，然后设定保持在4℃。将PCR反应产物保存在4℃备用。
为了观察所扩增的产物，使用用GelRed(Biotium)和TAE缓冲液(40mMTris，20mM乙酸和1mMEDTA，pH8)浇筑的1％琼脂糖通过凝胶电泳分析每次PCR。GoTaq反应缓冲液包含染料，允许PCR直接负载在凝胶上。将总计10μl每种PCR以及100bpDNAStepLadder(Promega)上样到所述凝胶上。凝胶以80V运行45分钟，然后在GelDocXR+(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)凝胶成像系统中在UV灯下观察。
结果
所述的交配策略能够产生TSPO纯合型敲除体、TSPO杂合型敲除体或TSPO野生型动物，并且这些基因型中的每一种都可以通过southern印迹分析和/或PCR明确地确定。开始，通过southern印迹分析评估祖先动物，图3(a)显示用针对TSPO外显子4的探针检测的子代的选择的基因组DNA(见图1，用于退火位点)。在泳道2(DO44)中存在8.8kb和4.2kb的产物指示杂合体，而DO45(泳道3)是TSPO纯合型敲除小鼠，并且DO47(泳道7)是野生型小鼠。
图3(b)显示通过使用正向引物和反向引物的PCR基因分型的小鼠的结果。证实的野生型小鼠的PCR基因分型(泳道2和5)产生单个489bp的PCR产物，而纯合型TSPO敲除小鼠的PCR基因分型产生单个246bp的PCR产物。对TSPO野生型等位基因杂合的小鼠表现出两种PCR产物。这些结果如在图2中所预测的。
实施例2：放射性配体膜结合
材料和方法
膜制备
将组织样品用T25数字Ultra-Turrax匀浆仪(Ika，Wilmington，NC，USA)在约45mL冰冷的TRIS缓冲液(pH7.4)中以5或20000rpm的速度设置进行匀浆，通过以48000g离心收集，然后弃去上清。然后，立即重复该步骤，这作为额外的清洗步骤，以去除放射性配体结合的任何可溶的干扰物质(Byland等.1993)。在第二次离心和去除上清后，将样品重悬在约50体积的冰冷的TRIS缓冲液(pH7.4)中。将样品等分保存在-80℃备用。
蛋白浓度测量
使用二辛可宁酸(BCA)蛋白测定试剂盒(ThermoFisherScientific，Scoresby，VIC，澳大利亚)按照供应商的使用说明测量蛋白浓度。简言之，以50∶1的比例(BCA试剂A∶B)组合BCA试剂A盒BCA试剂B，产生BCA工作试剂，将用TRIS缓冲液稀释的蛋白样品以20∶1的比例(工作试剂：蛋白)加入到所述BCA工作试剂中。然后，将样品在37℃温育30分钟，并且用分光光度计在562nm测量。使用该试剂盒所提供的牛血清白蛋白标准物产生标准曲线。
饱和结合
对于TSPO敲除小鼠研究，使用3H-PK11195消旋物在一定范围的浓度下进行放射性配体结合(图4)。PK11195是TSPO特异性探针。通过在0.56nM-20nM范围内的8个浓度的3H-PK11195确定总结合和非特异性结合。通过向所有浓度的3H-PK11195中加入5μMPK11195确定非特异性结合。
放射性配体结合的通用方法包括制备用于总结合的3H-PK11195，用于非特异性结合的3H-PK11195与PK11195，并且加入冰上解冻的匀浆化的蛋白。将3H-PK11195、PK11195和蛋白样品添加到硼硅酸盐玻璃管中，并且如果需要，将蛋白样品用TRIS缓冲液(pH7.4)稀释。每支管含有60μg蛋白样品，并且最终反应混合物是400μL。在总结合和非特异性结合中每种浓度的放射性配体一式三份进行。
将结合3H-PK11195的蛋白样品在冰上温育90分钟，然后通过预先浸没在0.5％聚乙烯亚胺溶液中的玻璃纤维WhatmanGF/C滤器(CrownScientific，Minto，NSW，澳大利亚)快速过滤进行收集。进行收集的同时用10mL冰冷的TRIS缓冲液(pH7.4)洗涤所有的管。收集滤液，并且放置在小马瓶中用于与2mLUltimaGold液闪混合物(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)一起进行液闪计数。在使用Tri-Carb2100TR液闪计数仪(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)确定放射性的量之前，将瓶在室温放置至少12小时，这样做是允许放射性充分扩散到闪烁液中(Bylund等，1993)。
为了确定Bmax和Kd值，通过针对实验获得的值拟合直线估测在3H-PK11195的4个最高浓度的非特异性结合。通过拟合总结合和非特异性结合，使用用于Windows的GraphPadPrism版本5.04(GraphPad软件，SanDiego，CA，USA)通过非线性回归拟合Bmax和Kd值。
结果
来自野生型、TSPO杂合型和TSPO纯合型小鼠的肾组织样品的分析可见于图4。野生型小鼠具有最高的TSPO表达，TSPO杂合型小鼠次之。TSPO敲除小鼠没有表现出与TSPO-选择性探针PK11195的结合。
实施例3：通过放射性自显影分析组织中的TSPO水平
材料和方法
将速冻组织在低温恒温器中以20μm切片，解冻封固在聚-L-赖氨酸-包被的载玻片上，并且保存在-80℃直到实验那天。在实验那天，将载玻片在室温下解冻，并且用冷气流风干。通过在存在或不存在在130mMTRIS-HCl缓冲液(pH7.4)中的3μMofPK11195的条件下在室温用1nM3H-PK11195温育20分钟而确定总结合和非特异性结合。温育后，将载玻片短暂地浸没在130mMTRIS-HCl缓冲液中两次，在室温在新鲜130mMTRIS-HCl中洗涤两次持续5分钟。最后将所述载玻片在冷的蒸馏水(H2O)中短暂润洗3次，在冷气流下晾干，并且允许晾干过夜。将切片暴露于KodakBioMaxMR胶片以及X辐射盒中具有已知活性浓度的微量氚。33天后将胶片显色，并用GS800带刻度密度计(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)数字化。用QuantityOne成像分析程序(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)分析图像；为评估3H-PK11195结合的水平，在组织上画出目的区域，并且计算平均光学密度/mm2。将从个体胶片获得的进行胶片间变量的数据通过微量氚的光学密度针对其他胶片标准化。
结果
从野生型(TSPO+/+)、杂合型(TSPO+/-)和纯合型(TSPO-/-)小鼠摘取用于胶片放射性自显影的器官，包括脑、视网膜、心脏、肾和睾丸，并且在液氮中速冻。将18μm的低温恒温器器官切片放置在superfrost载玻片(Menzel-Glaser，Braunschweig，德国)上，并且在实验之前，在-20℃暗处保存不超过1周。使用具有3.14TBq.mmol-1特异性活性的R-[N-甲基-3H]PK11195乙醇溶液(PerkinElmer，Waltham，Massachusetts，U.S.A.)进行胶片放射性自显影。在4℃在每个超级胶片(Hyperfilm)-3H(KodakFilm)上共同暴露60天的氚标准物(AmershamBiosciences，Uppsala，瑞典)与所述器官切片用于定量放射自显影测量的结合。所述超级胶片用KodakGBX显影剂和固定剂(SigmaAldrich，St.Louis，MO，U.S.A.)显色。在用ArtixScan1800f平板扫描仪(Microtek，Hsinchu，台湾)扫描之前，将所述超级胶片晾干过夜，使用400％的放大率和2400像素/英寸的光学解析度的灰度。没有应用扫描前操作或滤光片。
图5显示放射自显影的结果。左侧的图片是总结合(特异性的和非特异性的(NS))，而右侧的图片是非特异性的结合。较暗的区域表示较高的PK11195结合(即，较高的TSPO密度)。右侧的条状图与左侧的图像对应。其显示了在所有器官中在野生型(TSPO+/+)小鼠中最高的TSPO表达，杂合型(TSPO+/-)小鼠次之，但是在纯合型(TSPO-/-)小鼠中几乎没有TSPO表达。图表中所示的值在减去背景然后减去非特异性结合(NS)后获得。所选的背景是在器官切片之外的区域。
实施例4：通过放射性自显影分析脑组织中可诱导的TSPO水平
材料和方法
用于面神经轴突切断术的程序得到悉尼大学动物伦理委员会的核准。将动物用异氟烷麻醉剂麻醉。在程序过程中使用多种监测设备监测动物的呼吸、心率、氧饱和和温度的组合，以确保麻醉深度。当不再引发足垫或足底反射时，开始手术过程。将在颈部身体同侧(右侧)上的毛从耳向后剃下，并且用70％的乙醇清洁皮肤。做出一个在覆盖茎乳孔的肌肉组织上的小切口(长度为0.5-0.7cm)。鉴定、分离面神经，然后完全横断。切口的皮肤用愈合胶闭合。手术后身体同侧的胡须运动指示面神经轴突切断术的成功。轴突切断术后3天，将动物用CO2安乐死，并且立即摘下脑组织，包括脑干和小脑中的面神经核，在液氮中速冻，然后保存在-80℃冰箱中，直到进行低温恒温切片时。使用R-[N-甲基-3H]PK11195利用胶片放射性自显影揭示TSPO表达的水平。
结果
通过一侧面神经轴突切断术诱导面神经核中的神经炎症。摘下的脑组织的胶片放射性自显影显示在图6中。面神经轴突切断术在野生型小鼠的身体同侧面神经核中诱导高水平的TSPO表达(在左侧图像右手侧的红色圆圈)。在杂合型小鼠中观察到较低的TSPO表达(在中间图像右手侧的圆圈)，而在纯合型敲除小鼠中没有检测到TSPO(右侧图像右手侧的圆圈)。应该注意到，TSPO表达水平在野生型和杂合型小鼠而不是在纯合型小鼠中轴突切断术身体对侧中也是升高的(每张图像左手侧的圆圈)。
在小脑中，在野生型小鼠中的TSPO表达水平高。由于PK11195结合的强度与周围背景一样，因此，在纯合型小鼠中检测不到TSPO表达(右侧图像，图6)。在杂合型小鼠中的TSPO表达水平(中间图像，图6)在对野生型小鼠(左侧图像，图6)和纯合型小鼠所观察到的水平之间。
实验模型，诸如在啮齿动物面神经轴突切断术范例，允许系统性详细的研究神经元和其微环境对不同类型的刺激的反应。充分研究的实验实例包括周围神经外伤，神经毒素的逆向轴突输送和在与轴突切断术联合诱导实验性自体免疫性脑脊髓炎后局部增强的炎症。这些研究已经引起对运动神经元再生程序、小胶质细胞和星形胶质细胞在突触可塑性中的作用和胶质细胞的生物学的新型洞察。重要的是，所获得的发现中有多种已经在其他功能性系统中且甚至跨越物种障碍被证明是有效的。具体地，已经发现主要组织相容复合物分子的小神经胶质表达响应不同类型的神经元损伤发生，并且现在被视为是“神经胶质炎症”的特征性成分。
重要的是，面神经的周围神经损伤在损伤的面神经核中导致从头表达的TSPO的诱导，通常是单向性的，但是在年老的动物中，在两个损伤的面神经核中也是双向的。这在包括帕金森病和阿尔茨海默病的多种神经变性病症的情形中发现。传入轴突末端与再生运动神经元表面膜的剥离和它们随后被小胶质细胞替代(“突触剥离”)和被星形胶质细胞持久的隔离也已经在人中得到证实。这些发现的医药含义是明显的。此外，大叔和小鼠的面神经系统已经成为用于评价神经营养因子的充分研究的和最广泛应用的测试系统。
实施例5：使用正电子发射断层摄影术(PET)的体内成像和使用计算机断层摄影术(CT)的解剖信息
材料和方法
使用小动物InveonPET/CT扫描仪(Siemens，Knoxville，TN，USA)进行测试小鼠的PET扫描。在扫描之前，将小鼠用5％(v/v)异氟烷麻醉，并且放置在PET/CT扫描仪中。此后保持异氟烷的水平在1-2％。用反馈调节的加热垫维持体温，并且在整个扫描期间监测生理参数(呼吸和体温)(BioVet；m2mImagingCorp.)。将泪润滑油(Lacri-lube)(Allergan)放置在小鼠眼中，以防止小鼠麻醉时变干。PET扫描与尾静脉注射[18F]PBR111(8-18MBq/100μL，0.2nmol)同时发生。成像40分钟后，通过尾静脉注射PBR111(1mg/kg，在2％醋酸-盐水中)，以确定器官中的非特异性积聚，并且再成像10分钟。当完成PET扫描时，对小鼠进行CT扫描10分钟用于解剖信息。在研究结束时，在成像后在动物仍然完全麻醉时通过颈脱位法将小鼠处死。
结果
PBR111是结合TSPO蛋白的配体。图7表明，左侧图像显示在野生型小鼠(TSPO+/+)中记录的放射性示踪剂([18F]-PBR111)的高强度，而在右侧的TSPO敲除(纯合型，TSPO-/-)小鼠中没有观察到任一种放射性示踪剂。特别感兴趣的区域是肾上腺，显示在圆圈区域中，原因在于其在野生型小鼠中具有最高的TSPO表达水平。在肾上腺下方可以看到肾。
图9表示在肾上腺、心脏、肾脏和肝脏中在0分钟注射放射性示踪剂并且在第40分钟用PBR111置换后摄入的时程。在野生型小鼠(TSPO+/+)的肾上腺、肾脏和肝脏中的放射性示踪剂的摄入缓慢增加，但是直到应用与放射性示踪剂[18F]PBR111竞争的配体PBR111一直保持峰值水平。然而，在TSPO敲除小鼠(TSPO-/-)的肾上腺、肾脏、肝脏和心脏中放射性示踪剂的摄入快速达到峰值，然后减少到非特异性水平(即，在PBR111之后的值)。在野生型小鼠的心脏中放射性示踪剂摄入的模式与敲除小鼠的模式类似，但是减少要慢得多。
实施例6：动物健康评估
材料和方法
动物感觉和反射检测
在5月龄检查小鼠神经学反射。以下述顺序检查反射一段时间：正面(righting)，角膜，耳廓，触须，触及(reaching)和负趋地性反射(negativegeotaxisreflexes)。按下述确定反射的存在：
正面反射：将动物仰卧放置，并且记录重新获得腹部向下体位的迹象。
角膜反射：使用棉签，用光刺激眼睛区域，记录眨眼行为的迹象。
耳廓反射：使用棉签，轻轻刺激耳道，记录耳部收缩和头部运动的迹象。
触须反射：使用棉签，刺激触须，记录头部运动、胡须运动性和眨眼行为。
触及反射：将动物通过它们的尾根缓慢放低到桌子表面上，记录前肢和后腿的伸展。
负趋地性反射：将动物头朝下放置在斜面上，记录转回头朝上的趋势。
除了反射，检查视力和听力。视力通过在触及反射检查过程中的前爪触及进行评估，对于视力的评估不同于触及反射，原因在于触及反射评估整个动物体位，包括前肢和后腿的伸展，而视力涉及前爪的主动触及。听力通过在动物后弹手指并且检查听觉受惊或僵住行为(freezingbehaviour)的存在来评估。
结果
结果总结在下表2中。对于TSPO敲除是纯合型的小鼠都表现为正常。
表2：动物感觉和反射检测的结果。
实施例7：关于焦虑相关的行为的行为评估
材料和方法
对3-4月龄的小鼠进行关于焦虑相关的行为的行为检测，行为评估所涉及的所有小鼠在断奶后有规律地进行处理，以减少行为测试过程中处理压力的影响。焦虑相关的行为通过一组行为检测进行检查，并且按下述顺序进行：开放场地试验，出现检测，光暗喜好性检测和凸起的加号迷宫(elevatedplusmaze)。所有的行为检测在灯光微暗的房间中在12：30p.m.至6：30p.m.发生。在检测前至少60分钟，将小鼠作为在其原始笼子(homecages)中的一组运到实验房间中，以允许充分适应实验环境。为了确保所有动物之间一致的行为检测经历，一旦笼子中的所有动物都已经被检测时，迅速将动物送回其笼子和原始房间中。在每次检测开始之前，去除任何的尿和粪便排放物，在下一次检测开始之前，将台子用80％乙醇彻底清洁，并且允许干燥。为了减少训练历史的影响，行为检测间隔至少7天进行。
所有的行为实验用高架摄影机记录在DVD上，之后用MotmanTracker4.5软件(MotionMensura，CooksHill，NSW，澳大利亚)进行分析。MotmanTracker允许实时空间和时间运动追踪，并且根据所记录的录像，允许进一步的分析，包括目的区域计算。
开放场地试验
开放场地试验测量一般的运动元(locomotor)活动和焦虑相关的行为。该试验由用四面壁围绕的开放的方形台子组成，没有障碍物或物体。台子测量为44cm×44cm，并且壁测量为高26cm，台基和壁由染成红色的丙烯酸塑料构建而成。在开放场地试验中，动物通常倾向于沿着台子边缘探索，很少停留在更加暴露的中心。穿过台子中心的时间和频率量用作焦虑的指示。
在实验过程中，台子用无阴影照明系统用红灯均匀光照。台子的亮度约为28lux，使用Testo545lux计(Testo，CroydonSouth，VIC，澳大利亚)测量。将小鼠放置在台子中心，并允许其自由探索15分钟。评估穿过台子中心的持续时间和频率、移动的总距离、活动花费的时间和粪便排放的次数。
出现检测
出现检测与开放场地试验相似，并且利用相似的原理，测试在添加有小的隐藏盒的开放的台子上进行。当动物从隐藏盒中“出现”时，该检测评估探索行为、焦虑和活动水平。台子测量为44cm×44cm，并且壁测量为高26cm，隐藏盒测量为13×13cm，高为8.5cm，隐藏盒的开口测量为4×4cm，形状是拱形的，透明的丙烯酸板连接在隐藏盒的顶部，以在实验过程中防止动物跳到隐藏盒顶部。将隐藏盒沿着台子一边的中心放置，使其入口朝向台子中心。除在隐藏盒上的透明的丙烯酸板之外，台子和隐藏盒是由红色丙烯酸塑料制成的。
在实验过程中，台子用无阴影照明系统用红灯均匀光照。台子和隐藏盒的亮度分别为28和19lux，使用Testo545lux计(Testo，VIC，澳大利亚)测量。将动物放置在台子中心，朝向隐藏盒的开口，并且允许自由探索15分钟。评估进入隐藏盒的持续时间和频率、移动的总距离、活动花费的时间和粪便排放的次数。
光暗喜好性检测
光暗喜好性检测利用这样的观察：啮齿类动物发现亮光和新环境具有适度的压力。该检测使用与开放场地试验中相同的台子，但是将所述台子分隔成暗室和亮室。暗室通过加入大盒子产生，沿着边具有开口，以产生通道。台子测量为44cm×44cm，并且壁测量为高26cm，暗室盒测量为22cm×43.5cm，高度为26cm，该室盒开口测量为4×4cm，形状为拱形。台子和暗室盒都是由红色丙烯酸塑料制成。
在检测过程中，台子用无阴影照明系统用红灯均匀光照，测量的亮室和暗室的亮度分别约为16和3lux，使用Testo545lux计(Testo，CroydonSouth，VIC，澳大利亚)测量。将动物放置在亮室中，朝向暗室的开口，然后允许小鼠自由探索15分钟。评估进入每个室的持续时间和频率、移动的总距离、活动花费的时间和粪便排放的次数。
凸起的加号迷宫
凸起的加号迷宫是关于焦虑相关的行为的检测，并且还能够检测危险评估行为。其是基于这样的观察：啮齿类动物倾向于避开开放的空间，而是保留在被环绕的空间中，这可能是由于被环绕的空间被认为是更安全的环境。凸起的加号迷宫由与中心平台连接的4个等距离的长平台或臂组成，产生加号样形状。臂在开放的没有环绕的壁到封闭的壁环绕的臂之间交替。所述臂以23cm的高度凸出，并且测量为长28cm宽6cm，封闭的臂的壁测量为高20cm。该凸起的加号迷宫由染成红色的丙烯酸塑料和坐落在臂顶部的白色加号形状的可检测的木平台构建而成。
在检测过程中，迷宫用标准的高架荧光灯照明，测量的亮度在封闭的臂中约为100lux，在开放的臂中为350lux，使用Testo545lux计(Testo，CroydonSouth，VIC，澳大利亚)测量。将小鼠放置在中央平台上，朝向开放的臂，并且允许自由探索15分钟。评估进入开放的臂的持续时间和频率、危险评估行为涉及的持续时间和频率、移动的总距离、活动花费的时间和粪便排放的次数。危险评估定义为动物头的方向朝向开放臂，其身体超过15％处在开放臂中，而其质量中心保留在封闭的臂或中央平台内。
旋转试验
旋转棒是广泛用于评估运动协调性和平衡的试验。将小鼠放置在以固定的或加速的速度旋转的棒上，并且从棒上掉下的时间用作运动协调性和平衡的测量。按照标准化筛选指南的欧洲小鼠表型资源(EuropeanMousePhenotypingResourceofStandardisedScreensguidelines)，在IITC系列8旋转棒(IITCLifeScience，WoodlandHills，CA，USA)上，检测大约5月龄的TSPO敲除小鼠。简言之，将动物带到实验房间，并且在检测前允许适应15分钟。旋转试验由训练期和检测期组成。训练期由间隔10分钟休息时间的3次试验组成，并且检测期由间隔15分钟休息时间的4次试验组成。训练和检测期由30分钟的休息时间隔开。设定棒的旋转方向，以使动物背对实验者。在每个阶段开始时用70％乙醇清洁旋转棒并干燥。
训练期由3次试验组成，每次持续60秒，棒保持恒速。第一次试验，棒保持为0rpm，并且第二次和第三次试验，保持为4rpm。如果在第三次训练试验中，动物能够在棒上停留完整的60秒，纳米在30分钟休息时间后，动物继续检测期。如果在第三次训练试验中动物跌落，那么给予另外的训练试验(4rpm，60秒)，并且不管表现如何，在标准的30分钟休息时间后，动物继续进行检测期。检测期由4次相同的试验组成，每次持续300秒，棒从4rpm加速至40rpm。在最后一次检测试验后，将动物送回到它们的笼子中并且运回到它们的原始房间中。
结果
关于焦虑病症行为评估的结果显示在图10-14中。在野生型与TSPO纯合型敲除之前没有报道或观察到明显的区别。整体健康、交配、断奶、生长、活动、基因型的遗传分布和雄/雌比例分布与野生型副本相同。此外，发现神经学检查(包括正面、角膜、耳廓、触须、触及和负趋地性反射的检查)在TSPO敲除小鼠中没有明显的缺陷。另外，听力和视力似乎是正常的。在TSPO敲除小鼠中，基本行为(诸如一般活动水平、理毛行为、毛皮状态、社会行为和食物/水消耗)的详细检查都是正常的。
实施例8-13
参考下文列出的实例实施例8-13，此处提供了描述用于示例的实验的材料和相关的方法的具体部分。然而，有经验的读者应该理解，可以进行其他等价的方法来获得相应的数据。
实施例8-13-材料和方法
TSPO-/-小鼠的产生
使用包含侧连外显子2和3的loxP位点和插入在外显子3和4之间的新霉素盒的靶向构建体产生TSPO敲除小鼠。将所述靶向构建体电穿孔到C57BL/6Bruce4胚胎干(ES)细胞中，并且将通过同源重组正确靶向的细胞注射到白化病C57BL/6胚囊中。使雄性嵌合体与雌性白化病C57BL/6小鼠交配，筛选得到的具有黑色毛皮的子代中靶向的TSPO等位基因的存在。
使对靶向的等位基因的存在是阳性的小鼠与C57BL/6Cre-缺失小鼠杂交，以去除新霉素盒和外显子2和3，从而产生杂合型整个TSPO缺失的小鼠。为了去除Cre转基因，使动物与野生型C57BL/6小鼠交配。
为了产生用于实验的动物，使杂合型动物杂交，以产生野生型同窝仔对照。所有的动物程序都得到悉尼大学动物伦理委员会和ANSTO动物护理和伦理委员会的核准。TSPO-/-小鼠品系已经被给予另外的命名GuwiyangWurra(在当地的Dharawal语言中为‘火鼠’)。由此，其他命名将是C57BL/6-TSPOtm1GuMu(GuwiyangWurra)。
使用从尾部活组织检查样品分离的基因组DNA通过Southern印迹分析对小鼠进行基因分型。对于常规的基因分型，基因组DNA分离自尾部活组织检查样品、耳部活组织检查样品或粪便样品，并且使用引物P1(5’-GGTAGACTAGTGTGGGAAGATTTGA)，P2(5’-ATGGTGATTGCAACTGATGTTC)和P3(5’-TAGATACTGACCCTATCTGGGATGT)通过PCR扩增，从而对于野生型等位基因产生489bp的产物，对敲除等位基因产生246bp的产物。PCR由下述组成：在95℃初始温育2分钟，然后是4个循环：95℃30秒，68℃30秒，和72℃2分钟，然后是4个循环：95℃30秒，65℃30秒，和72℃2秒，然后是30个循环：95℃30秒，62℃30秒，和72℃2分钟，最后一步是72℃5分钟。
免疫印迹
将裂解物(20μg蛋白)与2xLaemmli样品缓冲液(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)混合，加热至70℃10分钟，并且在4-20％Mini-PROTEANTGX凝胶(Bio-Rad)上解析。将蛋白用转印迹Turbo转移系统(Bio-Rad)转移到硝基纤维素膜上。将该膜用1∶10000稀释的抗-TSPO抗体(#109497，Abcam，Cambridge，UK)或1∶1000稀释的抗-GAPDH(#37168，Abcam)和1∶10000稀释的过氧化物酶-缀合的抗兔抗体(#A0545，Sigma-Aldrich，StLouis，MO，USA)温育。使用PierceECLWestern印迹底物(ThermoScientific，Scoresby，VIC，澳大利亚)，并且使用ImageQuantLAS4000(GEHealthcare，Rydalmere，NSW，澳大利亚)显现膜。
RNA提取、cDNA合成和定量实时PCR
将组织样品在TRIzol(LifeTechnologies，Carlsbad，CA，USA)中匀浆，并且用PureLinkRNA迷你试剂盒(LifeTechnologies)按照供应商的使用说明用柱上DNA酶处理分离总RNA。将纯化的DNA(1μg)用SuperScriptIII第一链合成试剂盒(LifeTechnologies)反转录为cDNA。对于定量实时PCR，将cDNA加入到2.5μlSsoFastEvaGreen超级混合物(Bio-Rad)和0.5μM每种引物中，最终反应体积为5μl。使用下述引物：Actb(正向5’-GGACCTGACGGACTACCTCATG，反向5’-TCTTTGATGTCACGCACGATTT)32；
P450Scc(正向5’-ACATGGCCAAGATGGTACAGTTG，反向5’-ACGAAGCACCAGGTCATTCAC)33；
Gapdh(正向5’-CCATGGAGAAGGCTGGGG，反向5’-CAAAGTTGTCATGGATGACC)34；
StAR(正向5’-TCTCTAGTGTCTCCCACTGCATAGC，反向5’-TTAGCATCCCCTGTTCGTAGCT)33；
TSPO(正向5’-GGGAGCCTACTTTGTGCGTGG，反向5’-CAGGTAAGGATACAGCAAGCGGG)35；
TSPO2(正向5’-CCAGTCGGTGTGAGGATGAG，反向5’-AGTAGAGACCAAGGGGCAGT)。反应在CFX384实时PCR检测系统(Bio-Rad)上通过下述循环进行：98℃30秒，接着是45个循环：98℃5秒和63℃(对于TSPO2测定是61℃)10秒。进行解链曲线分析，以验证每个反应的特异性。每份样品一式两份运行。使用引物-BLAST设计TSPO2引物，并且通过DNA测序验证特异性。
动物重量和葡萄糖耐受性检测
小鼠保持标准饮食(大鼠和小鼠质量好的饲养饮食，Gordon’sSpecialtyStockfeeds)，并且每周记录体重。为了诱导肥胖，对14周龄的小鼠喂饲购自SpecialtyFeeds的高脂肪饮食(HFD)(SF03-002，59％的能量来自脂肪)或对照饮食(AIN93M，9％的能量来自脂肪)。每周记录体重，而每天测量食物和水的摄取。对照或HFD9周后，使小鼠进行葡萄糖耐受性检测。6小时禁食后，使用AlphaTRAK2血糖测量仪(AbbottLaboratories，AbbottPark，IL，USA)测量来自尾静脉的血液。小鼠接受2g/kg体重的腹膜内葡萄糖注射，并且在此后15，30，60和120分钟测量血糖。
原卟啉IX
将来自处死的小鼠的血液放置在肝素管中置于冰上，去除血浆，将细胞在冰冷的磷酸缓冲盐水(PBS)中洗涤两次，然后重悬在PBS中至初始体积。将样品平分(每份300μl)，一份接受1mM5-ALA，另一份接受无菌H2O，并且在摇动的培养箱中在37℃温育4小时。向每份样品中加入乙酸乙酯/乙酸(4∶1)，然后混合并且离心，然后将上清(1mL)转移到具有1mL1.5MHCl的新管中。混合并且离心样品后，在荧光分光光度计中测量下层HCl相的等分试样(激发波长为407nm，狭缝宽度10nm，发射谱450-800，以1nm增长)。在整个实验中使用玻璃管和容器，并且使样品避光。
面神经轴突切断术
对用异氟烷麻醉的TSPO+/+和TSPO-/-小鼠进行面神经轴突切断术(Banati，R.B.，Myers，R.&Kreutzberg，G.W.PK(′peripheralbenzodiazepine′)-bindingsitesintheCNSindicateearlyanddiscretebrainlesions：microautoradiographicdetectionof[3H]PK11195bindingtoactivatedmicroglia(CNS中的PK(‘周围苯并二氮杂’)-结合位点表示早期和离散的脑损伤：与激活的小角质细胞结合的[3H]PK11195显微放射自显影检测).JNeurocytol26，77-82(1997)；Moran，L.B.&Graeber，M.B.Thefacialnerveaxotomymodel(面神经轴突切断术模型).BrainResBrainResRev44，154-178，doi：10.1016/j.brainresrev.2003.11.004(2004))。在耳部背侧和侧面0.5cm处的皮肤上做出小切口(0.5-0.7cm)，并且在手术显微镜下将面神经横切。切口用3MTMVetbondTM组织粘附剂(St.Paul，MN，USA)闭合。手术的成功得到丧失身体同侧触须运动的证实。仔细监控小鼠，并且在手术后三天用CO2处死。摘下脑，放置在OCT中，转移到液氮中，并且在低温切片之前保存在-80℃。
PET和CT成像
将异氟烷(5％(v/v))麻醉并且保持在1-2％异氟烷中的小鼠用小动物InveonPET/CT扫描仪(Siemens，Knoxville，TN，USA)按照之前所述的方法(Disselhorst，J.A.等.Image-qualityassessmentforseveralpositronemittersusingtheNEMANU4-2008standardsintheSiemensInveonsmall-animalPETscanner(在西门子Inveon小动物PET扫描仪中使用NEMANU4-2008标准对一些正电子发射体进行图像质量评估).JNuclMed51，610-617，doi：10.2967/jnumed.109.068858(2010)；Mattner，F.等.CentralnervoussystemexpressionandPETimagingofthetranslocatorproteininrelapsing-remittingexperimentalautoimmuneencephalomyelitis(易位蛋白在复发-缓和性实验自身免疫性脑脊髓炎中中枢神经系统的表达和PET成像).JNuclMed54，291-298，doi：10.2967/jnumed.112.108894(2013))进行扫描。用反馈调节的加热垫保持体温，并且监控呼吸(BioVet；m2mImagingCorp，Cleveland，OH，USA)。扫面以尾静脉注射[18F]PBR111(8-18MBq/100μL，0.2nM)开始。成像40分钟后，注射PBR111(在2％乙酸-盐水中，1mg/kg)，以确定器官中的非特异性积聚，并且成像10分钟。然后，小鼠进行10分钟的CT-扫描获取解剖信息。收集所有的PET数据，标准化并用OSEM3D-MAP算法重建，以产生活性浓度的PET体积(kBq/ml)。
放射性自显影
将来自TSPO+/+、TSPO+/-和TSPO-/-小鼠的组织切片在含有1nM[3H]PK11195(特异性活性84Ci/mmol；PerkinElmer，Waltham，MA，USA)的170mMTris-HClpH7.4中在室温温育20分钟，在170mMTris-HCl中洗涤两次持续5分钟，在冰冷的MilliQH2O中用3次浸没润洗，并且干燥。将另外的切片在含有3nM[125I]CLINDE(特异性活性100Ci/mmol；由ANSTOLifeSciences合成)的50mMTris-HClpH7.4中在冰上温育1小时，在冰冷的50mMTris-HCl中洗涤两次持续2分钟，在冰冷的MilliQH2O中1分钟，并且干燥。在PK11195(10μM)、CLINDE(10μM)和PBR-111(10μM)的存在下进行置换结合。将单面乳剂胶片暴露于切片和标志物(14C或3H)3小时([125I]CLINDE)或10周([3H]PK11195)。
免疫组织化学
如前文所述进行免疫组织化学(Banati，R.B.等.Theperipheralbenzodiazepinebindingsiteinthebraininmultiplesclerosis：quantitativeinvivoimagingofmicrogliaasameasureofdiseaseactivity(在多发性硬化症中在脑中的周围苯并二氮杂结合位点：小胶质细胞的体内定量成像作为疾病活性的测量).Brain123(Pt11)，2321-2337(2000)；Graeber，M.B.，Streit，W.J.&Kreutzberg，G.W.AxotomyoftheRatFacial-NerveLeadstoIncreasedCr3ComplementReceptorExpressionbyActivatedMicroglialCells(大鼠面神经的轴突切断导致激活的小胶质细胞增加的Cr3补体受体表达).JNeurosciRes21，18-24，doi：DOI10.1002/jnr.490210104(1988)；Liu，G.J.，Nagarajah，R.，Banati，R.B.&Bennett，M.R.Glutamateinducesdirectedchemotaxisofmicroglia(谷氨酸诱导小胶质细胞的定向趋化性).EuropeanJournalofNeuroscience29，1108-1118，doi：10.1111/j.1460-9568.2009.06659.x(2009))。将组织切片(用于放射性自显影)用在PBS中的3.7％甲醛固定5分钟，然后用冰冷的丙酮透明化。用在PBS中的10％马血清和2％BSA封闭非特异性结合。切片用TSPO单克隆抗体(Abcam#109497)在4℃温育过夜，并且用二级HRP-缀合的山羊抗-兔抗体在RT温育1小时(Sigma#A0545)。用过氧化物酶3，3’-二氨基联苯胺四氢氯化物液体底物系统(Sigma-Aldrich)检测HRP活性。将切片用乙醇脱水，用二甲苯温育，并且将载玻片用盖玻片封固在D.P.X.封固介质中。在倒置OlympusBX51显微镜(Olympus，Tokyo，日本)下显现切片，并且用Q-成像摄像机和ImagePro5.1程序捕获。
使用具有5xECPlan-NeofluarNA0.16物镜的ZeissLSM710共聚焦显微镜进行面神经核的荧光显微镜检。使用488/561/633二色镜，用561nm激光激发AlexaFluor568，并且捕获565-640nm的发射。
对于免疫细胞化学，按照Zhang等.(Theisolationandcharacterizationofmurinemacrophages(鼠巨噬细胞的分离和表征).CurrProtocImmunolChapter14，Unit1411，doi：10.1002/0471142735.im1401s83(2008))分离腹膜巨噬细胞。在完全培养基中2天后，巨噬细胞的纯度＞97％，这由与FITC缀合的巨噬细胞特异性标记IB4(Sigma-Aldrich)证实。将盖玻片上的细胞用与用于组织切片相同的方法固定和温育，加入小鼠抗-人/小鼠线粒体电子转运链复合物IV抗体(AbcamAB14705)，然后与二级抗体AlexaFluor(AF)594-缀合的山羊抗-兔抗体(LifeTechnologies)和AF488-缀合的山羊抗-小鼠抗体(LifeTechnologies)温育。将盖玻片上的细胞用含有DAPI的ProLongGold抗褪色试剂(LifeTechnologies)封固，并且在BX61WIOlympus显微镜下观察。用数字摄像机(CoolSNAP，Photometrics，Tucson，AZ，USA)和ImageInVivo程序(Photometrics)捕获图像。用AutoDeblur程序(Photometrics)进行图像的重叠合法，并用ImageJ(NIH，Baltimore，MD，USA)进一步处理。
原代小胶质细胞培养
按照之前所述的方法(Liu，G.J.，Nagarajah，R.，Banati，R.B.&Bennett，M.R.Glutamateinducesdirectedchemotaxisofmicroglia(谷氨酰胺诱导小胶质细胞的定向趋化性).EurJNeurosci29，1108-1118，doi：EJN6659[pii]10.1111/j.1460-9568.2009.06659.x(2009))，培养来自0至2日龄的TSPO+/+和TSPO-/-小鼠的小胶质细胞。简言之，摘下整个脑，切除小块，并且用0.025％胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)处理。将它们在补充有10％胎牛血清(FBS；LifeTechnologies)、1％青霉素-链霉素-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich)和0.5ng/mlGM-CSF(Abcam)的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM/F12；Sigma-Aldrich)中培养。
通过在37℃以350rpm摇动50分钟，通过离心沉淀，而纯化小胶质细胞，重悬在补充的DMEM/F12中，并且放置(4x104个细胞/孔)在用FBS在室温预包被15分钟的96孔SeahorseXF细胞培养板(SeahorseBioscience，NorthBillerica，MA，USA)中。15分钟后，将孔洗涤两次，以却出未附着的细胞。小胶质细胞培养物的纯度＞99％，如通过用小胶质细胞标记AlexaFluor-缀合的异凝集素GS-IB4(LifeTechnologies)证实的。在用SeahorseXF96分析仪(SeahorseBioscience)评价线粒体功能之前，使小胶质细胞生长2-3天。
线粒体呼吸作用的测量
使用SeahorseXF96分析仪确定原代小胶质细胞培养物中的氧消耗率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)。OCR是线粒体呼吸作用的指示剂，ECAR主要是糖酵解的结果(Brand，M.D.&Nicholls，D.G.Assessingmitochondrialdysfunctionincells(评估细胞中的线粒体功能障碍).TheBiochemicaljournal435，297-312，doi：10.1042/BJ20110162(2011)；Yadava，N.&Nicholls，D.G.SparerespiratorycapacityratherthanoxidativestressregulatesglutamateexcitotoxicityafterpartialrespiratoryinhibitionofmitochondrialcomplexIwithrotenone(备用的呼吸能力，而不是氧化胁迫，调节用鱼藤酮部分呼吸抑制线粒体复合物I后的谷氨酸兴奋性毒性).JNeurosci27，7310-7317，doi：10.1523/JNEUROSCI.0212-07.2007(2007))。实验前那天，向XF96孔实用平板的每个孔中加入200μLSeahorseXFCalibrant(pH7.4)。将传感器头放置在平板顶部，并在无CO2培养箱中在37℃水合16小时。重复在37℃进行的细胞基础水平测量的流程(开始，校正探头，平衡，混合2分钟，1分钟延迟，测量3分钟)两次。然后，注辐射粒体胁迫化合物(寡霉素，FCCP，鱼藤酮和抗霉素A)，接着：2分钟混合，1分钟延迟，测量3分钟(重复3次)。
在实验那天，将对于野生型和敲除小胶质细胞都是纯度＞98％且存活度＞92％的小胶质细胞用未缓冲的DMEM加25mM葡萄糖(无缓冲液)洗涤3次，并且在37℃(无CO2)温育1小时。在SeahorseXF96分析仪上运行四次检测，每次使用四种药物(寡霉素，FCCP，和与抗霉素A联合的鱼藤酮)，所述药物选择用来检查线粒体电子转运链的四种主要的参数：基础水平呼吸，ATP产生，质子泄露和最大的呼吸作用(Brand，M.D.&Nicholls，D.G.Assessingmitochondrialdysfunctionincells(平细胞中的线粒体功能障碍).TheBiochemicaljournal435，297-312，doi：10.1042/BJ20110162(2011)；Yadava，N.&Nicholls，D.G.SparerespiratorycapacityratherthanoxidativestressregulatesglutamateexcitotoxicityafterpartialrespiratoryinhibitionofmitochondrialcomplexIwithrotenone(备用的呼吸能力，而不是氧化胁迫，调节用鱼藤酮部分呼吸抑制线粒体复合物I后的谷氨酸兴奋性毒性).JNeurosci27，7310-7317，doi：10.1523/JNEUROSCI.0212-07.2007(2007))(图4A)。以0.3μM，1μM，3μM(任选的)和10μM的浓度注射寡霉素和与抗霉素A联合的鱼藤酮。FCCP以0.1μM(任选的)，0.3μM，1μM和3μM的浓度注射。
放射性配体结合
将器官匀浆，通过以48000xg离心在冰冷的50mMTris-HCl(pH7.4)中洗涤两次，重悬在50体积的冰冷的50mMTris-HCl中，并且用BCA蛋白测定试剂盒(ThermoFisherScientific)确定蛋白浓度。在通过经由在0.5％聚乙烯亚胺溶液中预先浸没的WhatmanGF/C滤器(GEHealthcareLifeScience，澳大利亚)快速过滤收集之前，通过将膜蛋白(60μL)与[3H]PK11195(0.56nM-20nM)在冰上温育90分钟的饱和结合确定Bmax和Kd。用5μMPK11195确定非特异性结合。将滤器在闪烁混合物(PerkinElmer)中放置12小时，并且用Tri-Carb2100TR液闪计数仪(PerkinElmer)确定放射性。通过拟合总结合和非特异性结合，使用GraphPadPrism5.04(GraphPadSoftware，LaJolla，CA，USA)通过非线性回归获得Bmax和Kd值。
胆固醇转运和生物合成
按照Tuckey(Tuckey，R.C.，Woods，S.T.&Tajbakhsh，M.ElectrontransfertocytochromeP-450scclimitscholesterol-side-chain-cleavageactivityinthehumanplacenta(在人胎盘中，电子转运至细胞色素P-450scc限制胆固醇侧链分解活性).Europeanjournalofbiochemistry/FEBS244，835-839(1997))和Slominski(Slominski，A.T.等.CytochromeP450scc-dependentmetabolismof7-dehydrocholesterolinplacentaandepidermalkeratinocytes(胎盘和表皮角质细胞中，7-脱氢胆固醇的细胞色素P450scc-依赖性代谢).Theinternationaljournalofbiochemistry&cellbiology44，2003-2018，doi：10.1016/j.biocel.2012.07.027(2012))，测量小鼠睾丸中的P450Scc代谢机制。简言之，通过在250mM蔗糖，50mMTris(pH7.4)中离心制备富集的线粒体级分，并且在下述条件下进行胆固醇到孕烯醇酮的酶促转化至最大2小时的时间点：50mMHEPESpH7.4，250mM蔗糖，20mMKCl，5mMMgSO4，0.2mMEDTA，1mg/mlBSA，8μM曲洛司坦，0.05μCi3H-胆固醇，500mM异柠檬酸，5mMNaNADP。加入4℃的二氯甲烷终止反应。保留有机相，并且将水相再萃取两次以上到二氯甲烷中。将萃取物合并，在氮气下干燥，并且溶解在100μl乙酸乙酯中。用己烷∶二乙醚∶乙酸(15∶15∶1)移动相通过薄层层析分离孕烯醇酮和胆固醇，并且通过液闪计数定量每个点的放射性的量。
检测血清孕烯醇酮
通过按照供应商的使用说明(AbnovaCooperation，台湾)进行的酶联免疫吸附测定(ELISA)确定雄性和雌性TSPO+/+和TSPO+/+小鼠的血清孕烯醇酮。简言之，收集血液，允许凝固，并且收集血清。将标准物、对照和样品在具有或不具有缀合物和抗体的密封平板中一式两份在200rpm的平板摇床上(KS4000ic，IKA，Selangor，Malaysia)在室温温育1小时。温育后，将孔倒空，洗涤5次，并且将平板在无绒纸巾上轻轻敲打，以去除任何残留的缓冲液。将孔在200rpm的平板摇床上用HRP缀合物在室温温育30分钟，洗涤5次，并且用TMB底物在室温温育10分钟。向每个孔中加入终止溶液，20分钟后，测量450nm的光学密度。将数据针对血液体积标准化，并且用4参数对数曲线拟合程序MasterPlexReaderFit：用于ELISA分析的曲线-拟合软件(HitachiSolutionAmerica，SanFrancisco，CA，USA)进行分析。
血液表型确定
将用于行为实验的三十只小鼠(10只TSPO+/+，10只TSPO+/-，10只TSPO-/-，5月龄，雄/雌平均分布)用CO2处死。通过切开下腔静脉从肺腔中收集血液，并且放置在具有肝素(血液病学和淋巴细胞分析)或凝胶凝固激活剂(生物化学分析)的微管中。将脾收集在10mL冰冷的无菌PBS中。将血液(室温)和脾(置于冰上)送到(在收集的3-7小时内)澳大利亚表型学机构(AustralianPhenomicsFacility)进行流式细胞术和生物化学分析。
对于一般的血液病学，将血液1∶2稀释，并使用Advia2120血液病学系统(Siemens，Munich，德国)用荧光激活的细胞分选(FACS)进行分析。评估血液细胞亚群，包括白血细胞和血小板。对于淋巴细胞分析，分析血液存在或不存在T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞中的异常。T细胞亚群包括CD4+和CD8+亚群，而B细胞亚群包括不成熟的和成熟的B细胞和IgE+单核细胞。脾通过流式细胞术进行分析，并且针对NK细胞，B细胞，包括成熟的和不成熟的亚群，和针对T细胞，包括CD4+和CD8细胞以及它们活化的亚群进行染色。关于所检验的细胞类型的列表，参见表1。
对于生物化学，将血液离心，收集血清，并且通过OlympusAU400化学分析仪(Olympus)运行，其检测胆固醇、甘油三酯、葡萄糖、高密度脂蛋白(HDL)、白蛋白、肌酸激酶活性和丙氨酸氨基转移酶活性的水平。关于所检验的生物化学参数的列表，参见表1。
小鼠精子分析
通过用解剖刀切开每个尾段(cauda)并且在150μl预热的Biggers-Whitten-Whittingham(BWW)培养基中在37℃温育5分钟，而从TSPO+/+和TSPO-/-小鼠的附睾尾(caudaepididymides)释放精子。温育后，加入另外的250μlBWW培养基，去除组织，并用计算机辅助的精子分析(CASA)系统(HamiltonThorne，Beverly，MA，USA)评估精子。评估的参数为总能动性，进行的能动性，平均路径速率(VAP)，直线速率(VSL)和曲线速率(VCL)。
评估焦虑相关的行为
对3-4月龄的小鼠进行行为检测，规律性地处理以减少检测过程中处理压力的影响。用下述检查焦虑相关的行为：开放场地试验，出现检测，光/暗喜好性检测和凸起的加号迷宫。在每种检测中，允许小鼠在装置中自由探索15分钟。评估进入每个室的持续时间和频率，移动的总距离，活动花费的时间和粪便排放的次数。在凸起的加号迷宫中，危险评估定义为当动物头的方向朝向开放臂，其身体超过15％处在开放臂中，而其质量中心保留在封闭的臂或中央平台内。在检测过程中，实验中不知晓动物的基因型。检查至少间隔7天进行，以减小训练历史的影响(Paylor，R.&Lindsay，E.Mousemodelsof22q11deletionsyndrome(22q11缺失综合征的小鼠模型).BiolPsychiatry59，1172-1179，doi：10.1016/j.biopsych.2006.01.018(2006))。所有的实验用高架摄像机录制到DVD上，以后用MotmanTracker4.5软件(MotionMensura，CooksHill，NSW，澳大利亚)分析。
统计学
所示的结果是来自至少3个孔和批次的小胶质细胞培养物，其中(n)是指取样用于线粒体呼吸作用的孔的数目。每组至少3只动物用在其他实验中。除PET定量和胆固醇转运数据(其中给出SD)之外，数据表示为平均数±SEM。组间比较使用具有Bonferroni’spost-hoc检验的单变量方差分析进行。认为P值≤0.05是统计学显著的。
实施例8：证实整体TSPO+/-和TSPO-/-敲除
结果
去除TSPO基因的外显子2和3产生可存活的TSPO+/-和TSPO-/-动物。TSPO的破坏通过Southern印迹，PCR，RT-qPCR，Western印迹，(图15-18)，特异性抗体染色(图19，20和21a-21g)，使用TSPO配体[18F]PBR111的体内示踪剂动力学PET/CT研究(图21h和i；图24)，使用[3H]PK11195和[125I]CLINDE的受体-放射性自显影和膜受体结合(分别为图21a和21b)验证。
除了证实不存在TSPO蛋白之外，我们的数据证明了原始用于药理学表征周围苯并二氮杂结合位点18的分子[3H]PK11195的高选择性。此外，我们在体内和体外证明了[18F]PBR111和[125I]CLINDE的高选择性(图21a至21g)，由此其是在具有任何组成型、或诱导的特异性TSPO结合无效背景的动物中验证的用于TSPO的第一类新化合物。
重要地，我们表明，与正常的野生型不同，在TSPO-/-动物中，在周围面神经损伤后，面神经核中的小胶质细胞应答与TSPO配体[3H]PK11195和[125I]CLINDE结合的增加无关。这证明了在病理组织改变中，[3H]PK11195和[125I]CLINDE的选择性保持不变，并且没有发生另外的非选择性结合。我们的数据还表明，神经元周小胶质细胞激活的早期阶段(在小胶质细胞形态上具有其典型的变化)没有受到TSPO丢失的明显影响，并且神经-胶质信号传导机制保持完好(图21f和21g)。
实施例9：一般健康、存活性、可育性和行为表型
结果
在正常的喂养和笼养条件下，对600只动物的观察没有揭示任何明显的临床消弱，在杂合型TSPO+/-或纯合型TSPO-/-动物中也没有偶发病理学的增加，随时间二者均具有与群落对照野生型TSPO+/+动物相同的性别比、生长率和体重增加(图25)。类似地，没有可育性或寿命减少的迹象，最老的动物目前已经超过20个月没有疾病。精子存活力和功能的检测得出在来自TSPO+/+(平均能动性：82.7±9.33％；平均进展：47.7±10.2％；平均速率VAP：98.6±13.0μm/s，VSL：65.7±8.90μm/s，和VCL：179±20.2μm/s)和TSPO-/-动物(平均能动性：86.1±5.74％；平均进展：49.6±5.32％；平均速率VAP：105±6.54μm/s，VSL：67.5±5.08μm/s，和VCL：197±11.2μm/s)的精子之间没有区别。标准的开放场地、出现、光/暗喜好性和凸起的加号迷宫试验揭示对所有基因型相似的行为(表3)。
表3-行为表型
在基因型之间没有发现显著的行为区别。
实施例10：一般健康、存活性、可育性和行为表型
结果
在两种雄性和雌性TSPO-/-小鼠中，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量的所有的血清孕烯醇酮浓度都在群落对照野生型中观察到的正常范围内(TSPO+/+：雄性，131±46.5ng/ml；雌性：150±36.5ng/ml)和(TSPO-/-：雄性，145±44.8ng/ml；雌性：141±26.8ng/ml)(图22a)。
作为线粒体胆固醇转运读数的在多至2小时的时间期间内P450Scc将3H-胆固醇酶促转化为孕烯醇酮揭示在所有基因型之间在平均转化率百分数中没有统计学显著差异(TSPO+/+：14.35±4.6％(std)；TSPO+/-：14.28±3.6％(std)；TSPO-/-：15.6±4.0％(std)；p＞＞.05)。
实施例11：P450Scc，StAR和TSPO2
结果
类似地，定量RT-qPCR表明，在已知表达TSPO的主要器官之间对于StAR、P450Scc和TSPO2的基因表达模式在基因型之间是相似的，这表明整体丧失TSPO不导致这些被认为与作为类固醇合成调节剂的TSPO最密切相关的基因的任何补偿性的转录调节(图22b)。
实施例12：血液病学分析和生物化学
结果
血液分析，包括细胞分选，证明在两种性别中的血液表型很大程度上保持不受TSPO基因的杂合型或纯合型丢失的影响，唯一的例外是，与雌性TSPO+/+相比，在雌性TSPO-/-小鼠中天然杀伤(NK)细胞中统计学显著的增加趋势(表4)。因此，TSPO-/-小鼠没有表现出在斑马鱼TSPO基因沉默实验中观察到的细胞血液组成的变化。
表4-血液表型
*雌性TSPO-/-小鼠中NK细胞的相对丰度(％)显著高于雌性TSPO+/+和雌性TSPO+/-小鼠中的丰度(P＜0.05)
在TSPO+/+、TSPO+/-和TSPO-/-小鼠血液中原卟啉IX(PPIX)(认为是内源性的TSPO配体)的浓度不可区分，并且在用5-氨基酮戊酸(ALA)处理后类似地增加(图22c)，5-氨基酮戊酸(ALA)是血红素生物合成的第一个中间体和PPIX的前体，由此表示正常的血红素代谢。
实施例13对高脂肪饮食的线粒体代谢和反应
结果
尽管在标准饮食的TSPO+/+和TSPO-/-动物之间的体重增加方面没有区别，但是，尽管有相同的食物和水摄入，高脂肪饮食的TSPO-/-动物具有显著减少的相对体重增加，这与TSPO+/+动物不同(图22d至22f和表5)。在TSPO-/-动物中没有观察到由于高脂肪饮食引起的葡萄糖耐受性的显著变化，而TSPO+/+动物表现出预期的针对葡萄糖耐受性的趋势(图22g)。
表5-饮食组成
成分
计算的氨基酸
计算的总矿物质
钙 0.46％ 0.47％ 1.01％
磷 0.32％ 0.35％ 0.77％
镁 0.09％ 0.09％ 0.18％
钠 0.12％ 0.15％ 0.30％
氯化物 0.16％ 0.16％
钾 0.40％ 0.40％ 0.54％
硫 0.20％ 0.17％
铁 72mg/kg 75mg/kg 97.0mg/kg
铜 7.0mg/kg 6.9mg/kg 10.6mg/kg
碘 0.2mg/kg 0.2mg/kg 1.15mg/kg
锰 18mg/kg 19.5mg/kg 87.4mg/kg
钴 无数据 无数据
锌 51mg/kg 47mg/kg 48.1mg/kg
钼 0.15mg/kg 0.15mg/kg
硒 0.3mg/kg 0.3mg/kg 0.1mg/kg
镉 No data No data
铬 1.0mg/kg 1.0mg/kg
氟化物 1.0mg/kg 1.0mg/kg
锂 0.1mg/kg 0.1mg/kg
硼 2.1mg/kg 3.1mg/kg
镍 0.5mg/kg 0.5mg/kg
钒 0.1mg/kg 0.1mg/kg
计算的总维生素
使用氧和质子敏感性荧光团，以及电子转运链的选择性抑制剂或解偶联剂比较分析来自TSPO+/+和TSPO-/-小鼠的小胶质细胞(线粒体中富含的细胞)原代培养物中线粒体呼吸作用和ATP产生(图23a)，揭示与野生型相比，TSPO-/-线粒体具有：
1)显著更低的基础水平线粒体样消耗率(OCR)(图23b)和
2)在用寡霉素抑制复合物V后减少的ATP产生(图23d)；
3)解偶联后，即，用FCCP减少质子梯度，显著减少的最大呼吸作用(贮备能力)(图23f)；和
4)显著增加的质子泄露(图23j)，这通过从在对复合物I和III用鱼藤酮和抗霉素A组合抑制下的OCR(图23h)中减去寡霉素-抑制的OCR(图23d所示)计算所得。
TSPO-/-线粒体减少的ATP产生不与糖酵解的补偿性增加(由细胞外酸化率(ECAR)测量的)相关(图23c，23e，23g和23i)，这表明由于更多的质子泄露导致的ATP产生的减少没有通过非线粒体途径得到补偿。
实施例8-13-讨论
在真细菌(eubacteria)、古细菌(archaeabacteria)和真核生物中广泛存在TSPO的直向同系物(Gavish，M.等.Enigmaoftheperipheralbenzodiazepinereceptor(周围苯并二氮杂受体之谜).PharmacolRev51，629-650(1999)；Papadopoulos，V.等.Translocatorprotein(18kDa)：newnomenclaturefortheperipheral-typebenzodiazepinereceptorbasedonitsstructureandmolecularfunction(易位蛋白(18kDa)：周围型苯并二氮杂受体基于其结构和分子功能的新命名).TrendsPharmacolSci27，402-409，doi：S0165-6147(06)00153-2[pii]10.1016/j.tips.2006.06.005(2006))。TSPO蛋白家族的大部分成员包含针对异喹啉咪唑羧酰胺PK11195的特异性结合位点，所述位点在历史上用于药理学定义TSPO并且将其与其他苯并二氮杂结合受体如GABAA受体蛋白复合物区分开来(Gavish，M.等.Enigmaoftheperipheralbenzodiazepinereceptor(周围苯并二氮杂受体之谜).PharmacolRev51，629-650(1999)；LeFur，G.等.Peripheralbenzodiazepinebindingsites：effectofPK11195，1-(2-chlorophenyl)-N-methyl-(1-methylpropyl)-3isoquinolinecarboxamide.II.Invivostudies(周围苯并二氮杂结合位点：PK11195，即1-(2-氯苯基)-N-甲基-(1-甲基丙基)-3异喹啉咪唑羧酰胺的作用).LifeSci32，1849-1856(1983))。一种进化上较近的C端胆固醇识别氨基酸共有(CRAC)结构域主要在动物门中发现。TSPO的类似物TSPO2由于基因复制的结果存在于鸟类和哺乳动物中，其保留了CRAC结构域，但是失去了异喹啉结合位点(Fan，J.，Rone，M.B.&Papadopoulos，V.Translocatorprotein2isinvolvedincholesterolredistributionduringerythropoiesis(在红细胞生成过程中，易位蛋白2参与胆固醇重新分布).JBiolChem284，30484-30497，doi：10.1074/jbc.M109.029876(2009))。
根据对基因的保守核心功能的明显的进化压力，和报道的蛋白在胆固醇合成中重要作用，令人惊讶地发现本发明所述的整体TSPO敲除小鼠不仅存活而且还表现出明显“正常的”表型。
然而，尽管已经表明对TSPO敲除的功能性影响是谨慎的，但是，在上述实施例中列出的实验数据表明TSPO和TSPO-介导的信号传导在细胞和系统能量持有中的重要作用。具体地，本文所述的数据表明，当与野生型动物相比时，通过高脂肪饮食持久的增量摄入增加在TSPO敲除动物中导致显著减少(并且少于预期)的体重增加，由此提供了TSPO和TSPO介导的信号传导在防止由高脂肪饮食导致的肥胖中的作用。类似地，所述数据表明TSPO在能量存储中起作用，在不存在TSPO时，能量存储似乎较不有效。因此，TSPO更可能在线粒体氧化途径的激活中起作用，并且细胞测量表明在TSPO敲除动物中观察到的较不有效的能量存储是由于增加的线粒体质子泄露导致的。
按照本发明的实施方案描述的结果可以帮助阐释细胞和系统能量持有中TSPO-介导的变化(作为ATP产生的变化测量)能够怎样间接对能量依赖性类固醇生物发生的调节作用。然而，现在通过产生本发明所述的转基因动物可能进行的令人惊讶的观察允许之前产生的与TSPO及其体内功能和相关性相关的数据的重新评价和有力的验证，或者备选地不予考虑。特别地，这包括在本发明所述的方法和应用中使用具有所述的针对TSPO的选择性和特异性的化合物的研究。
因此，尽管已经描述了据信是本发明的优选实施方案的内容，但是，本领域技术人员应该认识到，在不背离本发明的精神的前提下，可以对其进行其他和另外的改进，并且旨在要求落入本发明的范围内的所有这样的改变和改进。

Claims (50)

1.一种转基因非人类动物，其包含具有至少一个非功能性内源性TSPO基因拷贝的细胞。
2.权利要求1的动物，其中所述细胞不包含功能性TSPO基因。
3.权利要求1或权利要求2的动物，其中所述非功能性TSPO基因包含至少一个选自由缺失、插入、移码突变、重排或取代组成的组的突变。
4.权利要求1-3中任一项的动物，其中所述突变是组成型的。
5.权利要求1-3中任一项的动物，其中所述突变是条件型的。
6.权利要求3-4中任一项的动物，其中所述突变包括所述TSPO基因内的外显子1、2、3和/或4的全部或部分的缺失。
7.权利要求3-5中任一项的动物，其中所述突变包括所述TSPO基因内的外显子2和/或3的全部或部分的缺失。
8.前述权利要求中任一项的动物，其中所述动物选自果蝇属(Drosophila)、蛭纲(Hirudinea)、鼠科(Murine)或鲤科(Cyprinidae)。
9.权利要求8的动物，其中所述动物是小鼠。
10.权利要求1-9中任一项的动物的后代。
11.由权利要求9的小鼠与下述杂交产生的后代：pKZ1小鼠，Brca2纯合型小鼠，Tg(CAT)(+/+)小鼠，A-T突变的杂合型/纯合型小鼠，Csbm/m小鼠，胰岛素类生长因子1杂合型和纯合型小鼠，P53杂合型和纯合型小鼠，辐射敏感性和耐受性转基因小鼠，精神分裂症DISC1敲除小鼠，精神分裂症神经调节蛋白1敲除小鼠，基因工程模型肿瘤小鼠，神经炎症模型小鼠，阿尔茨海默病模型小鼠，帕金森病模型小鼠，或胰岛素耐受性和易感饮食诱导的肥胖的具有2型脱碘酶基因靶向缺失(D2KO)的小鼠。
12.用于鉴定用于治疗受试者中TSPO-相关的疾病或病症的化合物的方法，所述方法包括给权利要求1-9中任一项的非人类动物或权利要求10或权利要求11的后代施用候选化合物，并且评估所述候选化合物对所述非人类动物的表型的影响。
13.用于鉴定用于治疗受试者中TSPO-相关的疾病或病症的化合物的方法，所述方法包括给权利要求1-9中任一项的非人类动物或权利要求10或权利要求11的后代施用候选化合物，并且评估所述候选化合物对可能存在于所述非人类动物中的TSPO-相关的基因产物或任意TSPO基因产物的表达水平的影响。
14.用于筛选用于治疗受试者中TSPO-相关的疾病或病症的候选化合物的结合特异性或选择性的方法，所述方法包括给权利要求1-9中任一项的试验非人类动物，或权利要求10或权利要求11的后代和同种的野生型非人类动物，施用候选化合物，并且将所述候选化合物对可能存在于所述野生型非人类动物中的TSPO-相关的基因产物或任意TSPO基因产物的结合特异性或选择性，与所述候选化合物对可能存在于所述试验非人类动物中的TSPO-相关的基因产物或任意TSPO基因产物的结合特异性或选择性进行比较。
15.权利要求1-9中任一项的动物或权利要求10或权利要求11的后代，其用于鉴定用于治疗受试者中TSPO-相关的疾病或病症的化合物。
16.权利要求1-9中任一项的动物或权利要求10或权利要求11的后代，其用于筛选用于治疗受试者中TSPO-相关的疾病或病症的候选化合物的结合特异性或选择性。
17.权利要求1-9中任一项的动物或权利要求10或权利要求11的后代，其用于诊断受试者中TSPO-相关的疾病或病症。
18.来源于权利要求1-9中任一项的动物或权利要求10或权利要求11的后代的细胞、组织或无限增殖化细胞系。
19.权利要求18的细胞、组织或无限增殖化细胞系作为检测生物样品中的TSPO基因产物的阴性对照的应用。
20.权利要求18的细胞、组织或无限增殖化细胞系作为检测来自患有或怀疑患有TSPO-相关的疾病或病症的受试者的生物样品中的TSPO基因产物的阴性对照的应用。
21.权利要求18的细胞、组织或无限增殖化细胞系用于诊断受试者中TSPO-相关的疾病或病症的应用。
22.权利要求18的细胞、组织或无限增殖化细胞系，其用于鉴定用于治疗受试者中TSPO-相关的疾病或病症的化合物。
23.权利要求18的细胞、组织或无限增殖化细胞系，其用于筛选用于治疗受试者中TSPO-相关的疾病或病症的候选化合物的结合特异性或选择性。
24.权利要求8的细胞、组织或无限增殖化细胞系，其用于诊断受试者中TSPO-相关的疾病或病症。
25.用于鉴定用于治疗TSPO-相关的疾病或病症的化合物的方法，所述方法包括将权利要求18的细胞、组织或无限增殖化细胞系暴露于候选化合物，并且评估所述候选化合物对所述细胞、组织或无限增殖化细胞系的表型的影响。
26.用于鉴定用于治疗受试者中TSPO-相关的疾病或病症的化合物的方法，所述方法包括将权利要求18的细胞、组织或无限增殖化细胞系暴露于候选化合物，并且评估所述候选化合物对可能存在于所述细胞、组织或无限增殖化细胞系中的TSPO-相关的基因产物或任意TSPO基因产物的表达水平的影响。
27.用于筛选用于治疗受试者中TSPO-相关的疾病或病症的候选化合物的结合特异性或选择性的方法，所述方法包括将野生型细胞、野生型组织或野生型无限增殖化细胞系与权利要求18的细胞或无限增殖化细胞系暴露于候选化合物，并且将所述候选化合物针对可能存在于所述野生型细胞、野生型组织或野生型无限增殖化细胞系中的TSPO-相关的基因产物或任意TSPO基因产物的结合特异性或选择性与所述候选化合物针对可能存在于权利要求18所述的细胞、组织或无限增殖化细胞系中的TSPO-相关的基因产物或任意TSPO基因产物的结合特异性或选择性进行比较。
28.权利要求12-14或25-27中任一项的方法，其中所述TSPO-相关的疾病或病症选自由下述组成的组：癌症，神经炎症，阿尔茨海默病，帕金森病，癫痫，脑损伤，缺血-再灌损伤，行为或神经学或精神病学病症，包括急性和慢性压力，焦虑性障碍，情绪障碍，和精神分裂症，周围神经病，多发性硬化症，神经性疼痛，肥胖，糖尿病和恶病质。
29.权利要求15-17中任一项的动物或后代，其中所述TSPO-相关的疾病或病症选自由下述组成的组：癌症，神经炎症，阿尔茨海默病，帕金森病，癫痫，脑损伤，缺血-再灌损伤，行为或神经学或精神病学病症，包括急性和慢性压力，焦虑性障碍，情绪障碍，和精神分裂症，周围神经病，多发性硬化症，神经性疼痛，肥胖，糖尿病和恶病质。
30.权利要求20或权利要求21的应用，其中所述TSPO-相关的疾病或病症选自由下述组成的组：癌症，神经炎症，阿尔茨海默病，帕金森病，癫痫，脑损伤，缺血-再灌损伤，行为或神经学或精神病学病症，包括急性和慢性压力，焦虑性障碍，情绪障碍，和精神分裂症，周围神经病，多发性硬化症，神经性疼痛，肥胖，糖尿病和恶病质。
31.权利要求22-24中任一项的细胞、组织或无限增殖化细胞系，其中所述TSPO-相关的疾病或病症选自由下述组成的组：癌症，神经炎症，阿尔茨海默病，帕金森病，癫痫，脑损伤，缺血-再灌损伤，行为或神经学或精神病学病症，包括急性和慢性压力，焦虑性障碍，情绪障碍，和精神分裂症，周围神经病，多发性硬化症，神经性疼痛，肥胖，糖尿病和恶病质。
32.通过权利要求12、13、25、26或28中任一项的方法鉴定的化合物。
33.通式(I)的化合物抑制TSPO功能的应用，
其中
X或不存在，或是碘或是其同位素；
Y选自F，Cl，Br，I，OH，SH，NH2，CN和COOH；
Z选自N(R3)C(O)R4和C(O)NR3R4；
R1和R2独立地选自(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C3-C6)环烷基，(C6-C12)芳基，(C6-C12)芳基氧基，(C6-C12)芳基(C1-C6)烷基，杂芳基，杂芳基(C1-C6)烷基，杂环，(C2-C6)烷酰基和(C2-C7)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的1-3个取代基取代的：卤素或其同位素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C2-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH；
R3和R4分别独立地是氢或选自下述的基团：(C1-C4)烷基，(C2-C4)烯基，(C2-C4)炔基，(C3-C6)环烷基，(C6-C12)芳基，(C6-C12)芳基(C1-C4)烷基，杂芳基，杂芳基(C1-C4)烷基，杂环，(C1-C4)烷氧基羰基和(C2-C5)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的1-3个取代基取代的：卤素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C1-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH，
或者R3与R4一起是(C2-C7)亚烷基，其可以任选地由1-3个选自由下述组成的组的取代基取代：卤素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C1-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH；
m和n独立地是0，1或2；并且
p是1；
其中在每种情形
(i)烯基具有乙烯单-或二-不饱和烷基或乙烯单-或二-不饱和环烷基的意思；
(ii)环烷基具有环式烷基或烷基取代的环式烷基的意思；
(iii)杂芳基具有芳香族杂环式环系统的单一、多核、缀合的和稠合的残基的意思。
34.通式(I)的化合物用于改变系统和/或细胞能量持有的应用，
其中
X，Y，Z，R1，R2，R3，R4，m，n和p如关于权利要求33的化合物所定义；并且
其中在每种情形
(i)烯基具有乙烯单-或二-不饱和烷基或乙烯单-或二-不饱和环烷基的意思；
(ii)环烷基具有环式烷基或烷基取代的环式烷基的意思；
(iii)杂芳基具有芳香族杂环式环系统的单一、多核、缀合的和稠合的残基的意思。
35.通式(I)的化合物用于改变线粒体氧化途径的应用，
其中
X，Y，Z，R1，R2，R3，R4，m，n和p如关于权利要求33的化合物所定义；并且
其中在每种情形
(i)烯基具有乙烯单-或二-不饱和烷基或乙烯单-或二-不饱和环烷基的意思；
(ii)环烷基具有环式烷基或烷基取代的环式烷基的意思；
(iii)杂芳基具有芳香族杂环式环系统的单一、多核、缀合的和稠合的残基的意思。
36.通式(I)的化合物用于调节线粒体ATP产生的应用，
其中
X，Y，Z，R1，R2，R3，R4，m，n和p如关于权利要求33的化合物所定义；并且
其中在每种情形
(i)烯基具有乙烯单-或二-不饱和烷基或乙烯单-或二-不饱和环烷基的意思；
(ii)环烷基具有环式烷基或烷基取代的环式烷基的意思；
(iii)杂芳基具有芳香族杂环式环系统的单一、多核、缀合的和稠合的残基的意思。
37.通式(I)的化合物用于调节TSPO-介导的信号传导的应用，
其中
X，Y，Z，R1，R2，R3，R4，m，n和p如关于权利要求33的化合物所定义；并且
其中在每种情形
(i)烯基具有乙烯单-或二-不饱和烷基或乙烯单-或二-不饱和环烷基的意思；
(ii)环烷基具有环式烷基或烷基取代的环式烷基的意思；
(iii)杂芳基具有芳香族杂环式环系统的单一、多核、缀合的和稠合的残基的意思。
38.通式(I)的化合物用于调节TSPO-介导的能量存储的应用，
其中
X，Y，Z，R1，R2，R3，R4，m，n和p如关于权利要求33的化合物所定义；并且
其中在每种情形
(i)烯基具有乙烯单-或二-不饱和烷基或乙烯单-或二-不饱和环烷基的意思；
(ii)环烷基具有环式烷基或烷基取代的环式烷基的意思；
(iii)杂芳基具有芳香族杂环式环系统的单一、多核、缀合的和稠合的残基的意思。
39.权利要求33-38中任一项的应用，其中所述应用提供对抗肥胖的保护作用。
40.权利要求33至权利要求39中任一项的应用，其中所述应用提供对抗高脂肪饮食诱导的重量增加的保护作用。
41.通式(I)的化合物用于研究与神经元损伤相关的炎症反应的应用，
其中
X，Y，Z，R1，R2，R3，R4，m，n和p如关于权利要求33的化合物所定义；并且
其中在每种情形
(i)烯基具有乙烯单-或二-不饱和烷基或乙烯单-或二-不饱和环烷基的意思；
(ii)环烷基具有环式烷基或烷基取代的环式烷基的意思；
(iii)杂芳基具有芳香族杂环式环系统的单一、多核、缀合的和稠合的残基的意思。
42.权利要求33-38或权利要求41中任一项的应用，其中n是0。
43.权利要求33-38或权利要求41中任一项的应用，其中：
Y选自F，Cl，Br，I，CN和OH；Z选自N(R3)C(O)R4和C(O)NR3R4；
R1和R2独立地选自(C1-C3)烷基，(C1-C3)烷氧基，(C2-C3)烯基，(C5-C6)环烷基，苯基，萘基，苯氧基，萘氧基，苄基，吡啶基，呋喃基，噻吩基，哌啶基，吗啉基，四氢呋喃基，二噁烷基，(C2-C4)烷酰基和(C2-C4)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的取代基取代：卤素，OH，(C2-C4)烷氧基，NH2，(C1-C3)烷基氨基，二((C1-C3)烷基)氨基，羧基，(C1-C3)烷氧基羰基，(C2-C4)烷酰基，氧代和酰氨基；
R3和R4分别独立地是氢或选自下述的基团：(C1-C3)烷基，(C2-C3)烯基，(C5-C6)环烷基，苯基，萘基，苄基和(C2-C4)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由选自由下述组成的组的取代基取代：卤素，OH，(C1-C3)烷氧基，NH2，(C-C3)烷基氨基，二((C1-C3)烷基)氨基，羧基，(C1-C3)烷氧基羰基，(C2-C4)烷酰基，氧代和酰氨基，
或R3与R4一起是(C2-C3)亚烷基，其可以任选地由选自由下述组成的组的取代基取代：卤素，OH，(C1-C3)烷氧基，NH2，(C1-C3)烷基氨基，二((C1-C3)烷基)氨基，羧基，(C1-C3)烷氧基羰基，(C2-C4)烷酰基，氧代和酰氨基；并且
m和n独立地是0或1。
44.权利要求33-38或权利要求41中任一项的应用，其中所述式(I)的化合物是式(IA)的2-(4′-碘代苯基)-咪唑[1，2-a]吡啶-3-乙酰胺衍生物
其中：
X是碘或其同位素；
Y是卤素；并且
R3和R4独立地选自氢，(C1-C4)烷基和(C2-C4)烯基，或者R3与R4一起是(C2-C3)亚烷基。
45.权利要求44的应用，其中：
X是125I；
Y是Cl；并且
R3与R4是CH2CH3。
46.权利要求45的应用，其中所述化合物是[125I]CLINDE。
47.权利要求33-38或权利要求41中任一项的应用，其中所述式(I)的化合物是式(IB)的衍生物
其中：
Y是卤素；
R1独立地选自(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C3-C6)环烷基，(C6-C12)芳基，(C6-C12)芳基氧基，(C6-C12)芳基(C1-C6)烷基，杂芳基，杂芳基(C1-C6)烷基，杂环，(C2-C6)烷酰基和(C2-C7)酰基，它们中的每一个可以是未取代的或由1-3个选自由下述组成的组的取代基取代：卤素或其同位素，OH，(C1-C4)烷氧基，SH，NH2，(C1-C4)烷基氨基，二((C1-C4)烷基)氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，(C2-C4)烷酰基，氧代，酰氨基，CN，CNS，SCN，CNO，OCN和NHOH；并且
R3和R4独立地选自氢，(C1-C4)烷基和(C2-C4)烯基，或R3与R4一起是(C2-C3)亚烷基。
48.权利要求47的应用，其中：
Y是Cl；
R1是OCH2CH2 18F；并且
R3与R4是CH2CH3。
49.权利要求48的应用，其中所述化合物是[18F]PBR111。
50.权利要求3-6中任一项的动物，其中所述突变是所述TSPO基因内的外显子2和3的缺失。
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