CN105274078B - 一种采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法。该方法采用如下步骤制备纳豆激酶：菌种培养，空消，投料，实消，接菌种悬浮液，移种，放罐清洗，过滤，低温冷冻干燥，粉碎，分装，包装，储存。采用本发明的方法制备纳豆激酶，产量高，产品纯净，杂质含量低，纳豆激酶含量可大4000IU/g以上，达到了具有口服药用效果所规定的含量，也可以作为保健品长期服用该产品，该制备方法简单，流程容易控制，重复性高。
Description
技术领域
本发明涉及一种高产纳豆激酶的提取方法，特别涉及一种采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法。
背景技术
纳豆菌产自纳豆，纳豆是日本人把煮熟的大豆用稻草包起来、在40℃的温度下发酵而成的一种食品。纳豆菌的发酵产物中含有纳豆激酶，是一种能够溶解血栓的酵素，并且无毒副作用，纳豆激酶是一种理想的治疗和预防血栓的潜在药物，只是，纳豆菌发酵产生的纳豆激酶产量低，酶不稳定容易失活，限制了其发展应用，但是，作为纳豆菌发酵的食品和饮料，长期使用，则有一定的预防和保健效果。
目前，采用自然发酵的纳豆产生的纳豆菌含量低，且不容易提取，只能作为一种保健食品使用。专利00107589.6公开了一种纳豆激酶的生产方法和用途；专利200610104111.2公开了纳豆激酶粉制备方法及纳豆巴西菇胶囊；专利201310154402.2公开了一种以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法；专利200810228955.7公开了一种产生纳豆激酶的枯草芽孢杆菌纳豆亚种及其应用；专利200710151453.4公开了纳豆制备工艺及含纳豆提取物的保健食品。上述专利公开的方法制备的纳豆激酶产量低，活性不高，含杂质较多，作为保健品使用可以，作为治疗血栓的口服药物使用则不够理想。
发明内容
本发明是为了克服上述现有技术中缺陷，通过采用深层液体发酵提取纳豆激酶，获得高活性纳豆激酶产品。
一种采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法，按照如下步骤进行：
(1)菌种培养
将保存的纳豆菌菌种进行活化，斜面培养的步骤，收集斜面培养的菌种加入到含有菌悬液的摇瓶中，镜检孢子数达到1X108-1X109/ml；
(2)空消
种子罐经消洗，检查后关闭所有与罐体连通的阀门，盖紧人孔，开三路蒸汽，打开蒸汽阀，排净空气，关闭排气阀，使罐压升至0.10-0.20mpa，打开所有与种子罐有关的小排气阀，排气20-40分钟，再关闭小排气阀，使罐压升至0.10-0.20mpa，然后全开排气阀，待罐压降至0时，打开人孔，排尽管内的冷凝水，关种子罐底阀门，准备进料；
(3)投料
关闭种子罐底出料阀，开启罐顶入料阀，关闭取样过滤器，冷却水进口；打开配料罐出口阀，输送泵入口，起泵，开启泵出口门上料；上料完毕停泵反吹料液管道，扫净料液管中残料；
(4)实消
按空消方式三路进蒸汽，开排气门，当罐压升至0.01-0.03mpa，调节蒸汽门，保持恒温打开所有罐顶通向外面的阀门，排气10-30分钟，关闭蒸汽，打开空气过滤器出口通入罐内，用牛皮纸包扎接种关口，关闭小排气阀，开启冷却水，使罐温降至35-37℃，关闭冷却水；
(5)接菌种悬浮液
将种子罐的压降至0，除去接种口上的盖帽，在火焰下将摇瓶种子倒入种子罐，拧紧种子罐接种口的盖帽，调整罐压至0.05-0.15mpa；
(6)移种
将种子罐底阀至分配站、发酵罐的管道灭菌，管道从发酵罐方通入0.1-0.2mpa无菌蒸汽，灭菌10-30分钟，打开所有管道上的小排气阀；灭菌 完毕，打开发酵罐接种阀，通入无菌空气，关闭小排气阀，待管路冷却至接种温度30-35℃，种子罐底阀，升高种子罐压力至0.1-0.2mpa，切换分配站阀门，降低发酵罐压至0.02-0.04mpa，将种子液压入发酵罐；接种完毕，调罐压至0.05-0.15mpa，温度30-34℃，发酵周期150-180h，移种完毕，用蒸汽冲洗移种管线中的残料，关闭阀门；
(7)放罐清洗
当PH达到7.0-7.5，终止发酵，停空气，停搅拌，打开出料阀，发酵液贮罐入料阀，利用压缩空气将料压至发酵液贮罐；料压净后，关闭出料阀，开排污阀，停压缩空气，当罐压为零时，打开人孔，用水清洗罐内所有装置，冲洗完毕通入空气，吹出CO2；
(8)过滤
利用板框压缩，除去菌丝体，至过滤液透明无菌丝，残渣中杂质质量分数小于1％；
(9)低温冷冻干燥：
操作温度在-25℃--30℃，操作时间为72小时-96小时；
(10)粉碎，分装，包装，储存。
所述纳豆菌菌种为枯草芽孢杆菌菌株QR，其保藏号为CGMCC No.11274。
所述发酵罐中装填发酵料，所述发酵料为处理加工过的黄豆，处理加工过程为：选取黄豆清洗干净，浸泡24小时，磨碎，121℃高温灭菌60min，降温至常温备用。
所述发酵罐中装填发酵料，所述发酵料为处理加工过的红豆，处理加工过程为：选取红豆清洗干净，浸泡36小时，磨碎，121℃高温灭菌60min，降温至常温备用。
所述发酵罐中装填发酵料，所述发酵料为水果，所述水果经过去核或去皮，磨碎，115℃灭菌30min，降温至常温备用，所述水果选自苹果，梨，桃，柿子，杏，柑橘，柚子，橙子，香蕉，西瓜，葡萄中的一种或一种以上。
所述发酵罐中装填发酵料，所述发酵料为蔬菜，所述蔬菜经过磨碎，115℃灭菌30min，降温至常温备用，所述蔬菜选自白菜，土豆，萝卜，胡萝卜，洋葱，菠菜，韭菜，香菜，芹菜中的一种或一种以上。
所述种子罐中装填培养基，所述培养基由以下重量份数的组分组成：蛋白胨50-60份，磷酸二氢钾1-3份，硫酸铵1-5份，氯化钠1-5份，葡萄糖20-45份，硫酸镁1-2份，蔗糖10-30份，琼脂10-20份，去离子水500-800份。
所述步骤(8)所述过滤的操作步骤为：
1)检查板框液压系统及装置，将合格滤布平整地铺在板框间；
2)启动液压泵，顶紧，压力控制在7-9Mpa；
3)将发酵液用泵输入板框，起泵时，掀开板框入料阀、回流阀，开贮罐口、泵入口，起泵；
4)过滤时，料液要始终保证温度恒定，搅拌不能停止，滤液要保证清晰透明,出料减慢时，证明滤渣已满，停止进料,罐渣吹干后将接收槽内料液排净，堵好出口，启动液压系统，退回板框，清理框内滤饼，洗好滤布，重新装好顶紧。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：采用本发明的方法制备纳豆激酶，产量高，产品纯净，杂质含量低，纳豆激酶含量可大4000IU/g以上，达到了具有口服药用效果所规定的含量，也可以作为保健品长期服用该产品，该制备方法简单，流程容易控制，重复性高。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
一种采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法，按照如下步骤进行：
(1)菌种培养
将保存的纳豆菌菌种进行活化，斜面培养的步骤，收集斜面培养的菌种加入到含有菌悬液的摇瓶中，镜检孢子数达到5X108/mL；所述纳豆菌菌种为枯草芽孢杆菌菌株QR，其保藏号为CGMCC No.11274，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为Bacillus subtilis。
(2)空消
种子罐经消洗，检查后关闭所有与罐体连通的阀门，盖紧人孔，开三路蒸汽，打开蒸汽阀，排净空气，关闭排气阀，使罐压升至0.15mpa，打开所有与种子罐有关的小排气阀，排气30分钟，再关闭小排气阀，使罐压升至0.15mpa，然后全开排气阀，待罐压降至0时，打开人孔，排尽管内的冷凝水，关种子罐底阀门，准备进料；
(3)投料
关闭种子罐底出料阀，开启罐顶入料阀，关闭取样过滤器，冷却水进口；打开配料罐出口阀，输送泵入口，起泵，开启泵出口门上料；上料完毕停泵反吹料液管道，扫净料液管中残料；所述种子罐中装填培养基，所述培养基由以下重量份数的组分组成：蛋白胨55份，磷酸二氢钾2份，硫酸铵2份，氯化钠2份，葡萄糖30份，硫酸镁1.5份，蔗糖20份，琼脂15份，去离子水700份。
(4)实消
按空消方式三路进蒸汽，开排气门，当罐压升至0.02mpa，调节蒸汽门， 保持恒温打开所有罐顶通向外面的阀门，排气20分钟，关闭蒸汽，打开空气过滤器出口通入罐内，用牛皮纸包扎接种关口，关闭小排气阀，开启冷却水，使罐温降至36℃，关闭冷却水；
(5)接菌种悬浮液
将种子罐的压降至0，除去接种口上的盖帽，在火焰下将摇瓶种子倒入种子罐，拧紧种子罐接种口的盖帽，调整罐压至0.10mpa；
(6)移种
将种子罐底阀至分配站、发酵罐的管道灭菌，管道从发酵罐方通入0.15mpa无菌蒸汽，灭菌20分钟，打开所有管道上的小排气阀；灭菌完毕，打开发酵罐接种阀，通入无菌空气，关闭小排气阀，待管路冷却至接种温度32℃，种子罐底阀，升高种子罐压力至0.15mpa，切换分配站阀门，降低发酵罐压至0.03mpa，将种子液压入发酵罐；接种完毕，调罐压至0.10mpa，温度32℃，发酵周期160h，移种完毕，用蒸汽冲洗移种管线中的残料，关闭阀门；所述发酵罐中装填发酵料，所述发酵料为处理加工过的黄豆，处理加工过程为：选取黄豆清洗干净，浸泡24小时，磨碎，121℃高温灭菌60min，降温至常温备用。
(7)放罐清洗
当PH达到7.2，终止发酵，停空气，停搅拌，打开出料阀，发酵液贮罐入料阀，利用压缩空气将料压至发酵液贮罐；料压净后，关闭出料阀，开排污阀，停压缩空气，当罐压为零时，打开人孔，用水清洗罐内所有装置，冲洗完毕通入空气，吹出CO2；
(8)过滤
利用板框压缩，除去菌丝体，至过滤液透明无菌丝，残渣中杂质质量分数小于1％；
具体操作步骤为：
1)检查板框液压系统及装置，将合格滤布平整地铺在板框间；
2)启动液压泵，顶紧，压力控制在8Mpa；
3)将发酵液用泵输入板框，起泵时，掀开板框入料阀、回流阀，开贮罐口、泵入口，起泵；
4)过滤时，料液要始终保证温度恒定，搅拌不能停止，滤液要保证清晰透明,出料减慢时，证明滤渣已满，停止进料,罐渣吹干后将接收槽内料液排净，堵好出口，启动液压系统，退回板框，清理框内滤饼，洗好滤布，重新装好顶紧。
(9)低温冷冻干燥：
操作温度在-28℃，操作时间为80小时；
(10)粉碎，分装，包装，储存。
采用平板法测定酶活，以尿激酶单位计IU，纳豆激酶含量达到4800IU/g。
实施例2
一种采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法，按照如下步骤进行：
(1)菌种培养
将保存的纳豆菌菌种进行活化，斜面培养的步骤，收集斜面培养的菌种加入到含有菌悬液的摇瓶中，镜检孢子数达到1X108/ml；所述纳豆菌菌种为枯草芽孢杆菌菌株QR，其保藏号为CGMCC No.11274。
(2)空消
种子罐经消洗，检查后关闭所有与罐体连通的阀门，盖紧人孔，开三路蒸汽，打开蒸汽阀，排净空气，关闭排气阀，使罐压升至0.10mpa，打开所有与种子罐有关的小排气阀，排气20分钟，再关闭小排气阀，使罐压升至 0.10mpa，然后全开排气阀，待罐压降至0时，打开人孔，排尽管内的冷凝水，关种子罐底阀门，准备进料；
(3)投料
关闭种子罐底出料阀，开启罐顶入料阀，关闭取样过滤器，冷却水进口；打开配料罐出口阀，输送泵入口，起泵，开启泵出口门上料；上料完毕停泵反吹料液管道，扫净料液管中残料；所述种子罐中装填培养基，所述培养基由以下重量份数的组分组成：蛋白胨50份，磷酸二氢钾1份，硫酸铵1份，氯化钠1份，葡萄糖20份，硫酸镁1份，蔗糖10份，琼脂10份，去离子水500份。
(4)实消
按空消方式三路进蒸汽，开排气门，当罐压升至0.01mpa，调节蒸汽门，保持恒温打开所有罐顶通向外面的阀门，排气10分钟，关闭蒸汽，打开空气过滤器出口通入罐内，用牛皮纸包扎接种关口，关闭小排气阀，开启冷却水，使罐温降至35℃，关闭冷却水；
(5)接菌种悬浮液
将种子罐的压降至0，除去接种口上的盖帽，在火焰下将摇瓶种子倒入种子罐，拧紧种子罐接种口的盖帽，调整罐压至0.05mpa；
(6)移种
将种子罐底阀至分配站、发酵罐的管道灭菌，管道从发酵罐方通入0.1mpa无菌蒸汽，灭菌10分钟，打开所有管道上的小排气阀；灭菌完毕，打开发酵罐接种阀，通入无菌空气，关闭小排气阀，待管路冷却至接种温度30℃，种子罐底阀，升高种子罐压力至0.1mpa，切换分配站阀门，降低发酵罐压至0.02mpa，将种子液压入发酵罐；接种完毕，调罐压至0.05mpa，温度30℃，发酵周期150h，移种完毕，用蒸汽冲洗移种管线中的残料，关闭阀门；所述 发酵罐中装填发酵料，所述发酵料为处理加工过的红豆，处理加工过程为：选取红豆清洗干净，浸泡36小时，磨碎，121℃高温灭菌60min，降温至常温备用。
(7)放罐清洗
当PH达到7.0，终止发酵，停空气，停搅拌，打开出料阀，发酵液贮罐入料阀，利用压缩空气将料压至发酵液贮罐；料压净后，关闭出料阀，开排污阀，停压缩空气，当罐压为零时，打开人孔，用水清洗罐内所有装置，冲洗完毕通入空气，吹出CO2；
(8)过滤
利用板框压缩，除去菌丝体，至过滤液透明无菌丝，残渣中杂质质量分数小于1％；
具体操作步骤为：
1)检查板框液压系统及装置，将合格滤布平整地铺在板框间；
2)启动液压泵，顶紧，压力控制在7Mpa；
3)将发酵液用泵输入板框，起泵时，掀开板框入料阀、回流阀，开贮罐口、泵入口，起泵；
4)过滤时，料液要始终保证温度恒定，搅拌不能停止，滤液要保证清晰透明,出料减慢时，证明滤渣已满，停止进料,罐渣吹干后将接收槽内料液排净，堵好出口，启动液压系统，退回板框，清理框内滤饼，洗好滤布，重新装好顶紧。
(8)低温冷冻干燥：
操作温度在-25℃，操作时间为72小时；
(10)粉碎，分装，包装，储存。
采用平板法测定酶活，以尿激酶单位计IU，纳豆激酶含量达到4500IU/g。
实施例3
一种采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法，按照如下步骤进行：
(1)菌种培养
将保存的纳豆菌菌种进行活化，斜面培养的步骤，收集斜面培养的菌种加入到含有菌悬液的摇瓶中，镜检孢子数达到1X109/ml；所述纳豆菌菌种为枯草芽孢杆菌菌株QR，其保藏号为CGMCC No.11274。
(2)空消
种子罐经消洗，检查后关闭所有与罐体连通的阀门，盖紧人孔，开三路蒸汽，打开蒸汽阀，排净空气，关闭排气阀，使罐压升至0.20mpa，打开所有与种子罐有关的小排气阀，排气40分钟，再关闭小排气阀，使罐压升至0.20mpa，然后全开排气阀，待罐压降至0时，打开人孔，排尽管内的冷凝水，关种子罐底阀门，准备进料；
(3)投料
关闭种子罐底出料阀，开启罐顶入料阀，关闭取样过滤器，冷却水进口；打开配料罐出口阀，输送泵入口，起泵，开启泵出口门上料；上料完毕停泵反吹料液管道，扫净料液管中残料；所述种子罐中装填培养基，所述培养基由以下重量份数的组分组成：蛋白胨60份，磷酸二氢钾3份，硫酸铵5份，氯化钠5份，葡萄糖45份，硫酸镁2份，蔗糖30份，琼脂20份，去离子水800份。
(4)实消
按空消方式三路进蒸汽，开排气门，当罐压升至0.03mpa，调节蒸汽门，保持恒温打开所有罐顶通向外面的阀门，排气30分钟，关闭蒸汽，打开空气过滤器出口通入罐内，用牛皮纸包扎接种关口，关闭小排气阀，开启冷却水， 使罐温降至37℃，关闭冷却水；
(5)接菌种悬浮液
将种子罐的压降至0，除去接种口上的盖帽，在火焰下将摇瓶种子倒入种子罐，拧紧种子罐接种口的盖帽，调整罐压至0.15mpa；
(6)移种
将种子罐底阀至分配站、发酵罐的管道灭菌，管道从发酵罐方通入0.2mpa无菌蒸汽，灭菌30分钟，打开所有管道上的小排气阀；灭菌完毕，打开发酵罐接种阀，通入无菌空气，关闭小排气阀，待管路冷却至接种温度35℃，种子罐底阀，升高种子罐压力至0.2mpa，切换分配站阀门，降低发酵罐压至0.04mpa，将种子液压入发酵罐；接种完毕，调罐压至0.15mpa，温度34℃，发酵周期180h，移种完毕，用蒸汽冲洗移种管线中的残料，关闭阀门；所述发酵罐中装填发酵料，所述发酵料为苹果，所述苹果经过去核或去皮，磨碎，115℃灭菌30min，降温至常温备用。所述发酵料还可以为土豆，所述土豆经过磨碎，115℃灭菌30min，降温至常温备用。
(7)放罐清洗
当PH达到7.5，终止发酵，停空气，停搅拌，打开出料阀，发酵液贮罐入料阀，利用压缩空气将料压至发酵液贮罐；料压净后，关闭出料阀，开排污阀，停压缩空气，当罐压为零时，打开人孔，用水清洗罐内所有装置，冲洗完毕通入空气，吹出CO2；
(8)过滤
利用板框压缩，除去菌丝体，至过滤液透明无菌丝，残渣中杂质质量分数小于1％；
具体操作步骤为：
1)检查板框液压系统及装置，将合格滤布平整地铺在板框间；
2)启动液压泵，顶紧，压力控制在9Mpa；
3)将发酵液用泵输入板框，起泵时，掀开板框入料阀、回流阀，开贮罐口、泵入口，起泵；
4)过滤时，料液要始终保证温度恒定，搅拌不能停止，滤液要保证清晰透明,出料减慢时，证明滤渣已满，停止进料,罐渣吹干后将接收槽内料液排净，堵好出口，启动液压系统，退回板框，清理框内滤饼，洗好滤布，重新装好顶紧。
(9)低温冷冻干燥：
操作温度在-30℃，操作时间为96小时；
(10)粉碎，分装，包装，储存。
采用平板法测定酶活，以尿激酶单位计IU，纳豆激酶含量达到4300IU/g。
实施例4
一种采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法，按照如下步骤进行：
(1)菌种培养
将保存的纳豆菌菌种进行活化，斜面培养的步骤，收集斜面培养的菌种加入到含有菌悬液的摇瓶中，镜检孢子数达到5X108/mL；所述纳豆菌菌种为枯草芽孢杆菌菌株QR，其保藏号为CGMCC No.11274。
(3)空消
种子罐经消洗，检查后关闭所有与罐体连通的阀门，盖紧人孔，开三路蒸汽，打开蒸汽阀，排净空气，关闭排气阀，使罐压升至0.15mpa，打开所有与种子罐有关的小排气阀，排气30分钟，再关闭小排气阀，使罐压升至0.15mpa，然后全开排气阀，待罐压降至0时，打开人孔，排尽管内的冷凝水，关种子罐底阀门，准备进料；
(3)投料
关闭种子罐底出料阀，开启罐顶入料阀，关闭取样过滤器，冷却水进口；打开配料罐出口阀，输送泵入口，起泵，开启泵出口门上料；上料完毕停泵反吹料液管道，扫净料液管中残料；所述种子罐中装填培养基，所述培养基由以下重量份数的组分组成：蛋白胨55份，碎米莎粉2份，磷酸二氢钾2份，硫酸铵2份，氯化钠2份，葡萄糖30份，硫酸镁1.5份，蔗糖20份，琼脂15份，去离子水700份。所述碎米莎粉为碎米莎的叶片进过晒干，磨粉，过80目筛得到。
(4)实消
按空消方式三路进蒸汽，开排气门，当罐压升至0.02mpa，调节蒸汽门，保持恒温打开所有罐顶通向外面的阀门，排气20分钟，关闭蒸汽，打开空气过滤器出口通入罐内，用牛皮纸包扎接种关口，关闭小排气阀，开启冷却水，使罐温降至36℃，关闭冷却水；
(5)接菌种悬浮液
将种子罐的压降至0，除去接种口上的盖帽，在火焰下将摇瓶种子倒入种子罐，拧紧种子罐接种口的盖帽，调整罐压至0.10mpa；
(7)移种
将种子罐底阀至分配站、发酵罐的管道灭菌，管道从发酵罐方通入0.15mpa无菌蒸汽，灭菌20分钟，打开所有管道上的小排气阀；灭菌完毕，打开发酵罐接种阀，通入无菌空气，关闭小排气阀，待管路冷却至接种温度32℃，种子罐底阀，升高种子罐压力至0.15mpa，切换分配站阀门，降低发酵罐压至0.03mpa，将种子液压入发酵罐；接种完毕，调罐压至0.10mpa，温度32℃，发酵周期160h，移种完毕，用蒸汽冲洗移种管线中的残料，关闭阀门；所述发酵罐中装填发酵料，所述发酵料为处理加工过的黄豆，处理加工过程为：选取黄豆清洗干净，浸泡24小时，磨碎，121℃高温灭菌60min，降温至 常温备用。
(7)放罐清洗
当PH达到7.2，终止发酵，停空气，停搅拌，打开出料阀，发酵液贮罐入料阀，利用压缩空气将料压至发酵液贮罐；料压净后，关闭出料阀，开排污阀，停压缩空气，当罐压为零时，打开人孔，用水清洗罐内所有装置，冲洗完毕通入空气，吹出CO2；
(8)过滤
利用板框压缩，除去菌丝体，至过滤液透明无菌丝，残渣中杂质质量分数小于1％；
具体操作步骤为：
1)检查板框液压系统及装置，将合格滤布平整地铺在板框间；
2)启动液压泵，顶紧，压力控制在8Mpa；
3)将发酵液用泵输入板框，起泵时，掀开板框入料阀、回流阀，开贮罐口、泵入口，起泵；
4)过滤时，料液要始终保证温度恒定，搅拌不能停止，滤液要保证清晰透明,出料减慢时，证明滤渣已满，停止进料,罐渣吹干后将接收槽内料液排净，堵好出口，启动液压系统，退回板框，清理框内滤饼，洗好滤布，重新装好顶紧。
(9)低温冷冻干燥：
操作温度在-28℃，操作时间为80小时；
(10)粉碎，分装，包装，储存。
采用平板法测定酶活，以尿激酶单位计IU，纳豆激酶含量达到5500IU/g。
对比例1
一种采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法，按照如下步骤进行：
(1)菌种培养
采用传统方法制备纳豆，从纳豆中分离出纳豆菌保存，将保存的普通纳豆菌菌种进行活化，斜面培养的步骤，收集斜面培养的菌种加入到含有菌悬液的摇瓶中，镜检孢子数达到5X108/mL。
(4)空消
种子罐经消洗，检查后关闭所有与罐体连通的阀门，盖紧人孔，开三路蒸汽，打开蒸汽阀，排净空气，关闭排气阀，使罐压升至0.15mpa，打开所有与种子罐有关的小排气阀，排气30分钟，再关闭小排气阀，使罐压升至0.15mpa，然后全开排气阀，待罐压降至0时，打开人孔，排尽管内的冷凝水，关种子罐底阀门，准备进料；
(3)投料
关闭种子罐底出料阀，开启罐顶入料阀，关闭取样过滤器，冷却水进口；打开配料罐出口阀，输送泵入口，起泵，开启泵出口门上料；上料完毕停泵反吹料液管道，扫净料液管中残料；所述种子罐中装填培养基，所述培养基由以下重量份数的组分组成：蛋白胨55份，磷酸二氢钾2份，硫酸铵2份，氯化钠2份，葡萄糖30份，硫酸镁1.5份，蔗糖20份，琼脂15份，去离子水700份。
(4)实消
按空消方式三路进蒸汽，开排气门，当罐压升至0.02mpa，调节蒸汽门，保持恒温打开所有罐顶通向外面的阀门，排气20分钟，关闭蒸汽，打开空气过滤器出口通入罐内，用牛皮纸包扎接种关口，关闭小排气阀，开启冷却水，使罐温降至36℃，关闭冷却水；
(5)接菌种悬浮液
将种子罐的压降至0，除去接种口上的盖帽，在火焰下将摇瓶种子倒入种子罐，拧紧种子罐接种口的盖帽，调整罐压至0.10mpa；
(8)移种
将种子罐底阀至分配站、发酵罐的管道灭菌，管道从发酵罐方通入0.15mpa无菌蒸汽，灭菌20分钟，打开所有管道上的小排气阀；灭菌完毕，打开发酵罐接种阀，通入无菌空气，关闭小排气阀，待管路冷却至接种温度32℃，种子罐底阀，升高种子罐压力至0.15mpa，切换分配站阀门，降低发酵罐压至0.03mpa，将种子液压入发酵罐；接种完毕，调罐压至0.10mpa，温度32℃，发酵周期160h，移种完毕，用蒸汽冲洗移种管线中的残料，关闭阀门；所述发酵罐中装填发酵料，所述发酵料为处理加工过的黄豆，处理加工过程为：选取黄豆清洗干净，浸泡24小时，磨碎，121℃高温灭菌60min，降温至常温备用。
(7)放罐清洗
当PH达到7.2，终止发酵，停空气，停搅拌，打开出料阀，发酵液贮罐入料阀，利用压缩空气将料压至发酵液贮罐；料压净后，关闭出料阀，开排污阀，停压缩空气，当罐压为零时，打开人孔，用水清洗罐内所有装置，冲洗完毕通入空气，吹出CO2；
(8)过滤
利用板框压缩，除去菌丝体，至过滤液透明无菌丝，残渣中杂质质量分数小于1％；
具体操作步骤为：
1)检查板框液压系统及装置，将合格滤布平整地铺在板框间；
2)启动液压泵，顶紧，压力控制在8Mpa；
3)将发酵液用泵输入板框，起泵时，掀开板框入料阀、回流阀，开贮罐口、泵入口，起泵；
4)过滤时，料液要始终保证温度恒定，搅拌不能停止，滤液要保证清晰透明,出料减慢时，证明滤渣已满，停止进料,罐渣吹干后将接收槽内料液排净，堵好出口，启动液压系统，退回板框，清理框内滤饼，洗好滤布，重新装好顶紧。
(9)低温冷冻干燥：
操作温度在-28℃，操作时间为80小时；
(10)粉碎，分装，包装，储存。
采用平板法测定酶活，以尿激酶单位计IU，纳豆激酶含量达到2000IU/g。
以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)菌种培养
将保存的纳豆菌菌种进行活化，斜面培养的步骤，收集斜面培养的菌种加入到含有菌悬液的摇瓶中，镜检孢子数达到1×108-1×109/ml；
所述纳豆菌菌种为枯草芽孢杆菌菌株QR，其保藏号为CGMCC No.11274；
(2)空消
种子罐经消洗，检查后关闭所有与罐体连通的阀门，盖紧入孔，开三路蒸汽，打开蒸汽阀，排净空气，关闭排气阀，使罐压升至0.10-0.20mpa，打开所有与种子罐有关的小排气阀，排气20-40分钟，再关闭小排气阀，使罐压升至0.10-0.20mpa，然后全开排气阀，待罐压降至0时，打开入孔，排尽管内的冷凝水，关种子罐底阀门，准备进料；
(3)投料
关闭种子罐底出料阀，开启罐顶入料阀，关闭取样过滤器，冷却水进口；打开配料罐出口阀，输送泵入口，起泵，开启泵出口门上料；上料完毕停泵反吹料液管道，扫净料液管中残料；
所述种子罐中装填培养基，所述培养基由以下重量份数的组分组成：蛋白胨50-60份，磷酸二氢钾1-3份，硫酸铵1-5份，氯化钠1-5份，葡萄糖20-45份，硫酸镁1-2份，蔗糖10-30份，琼脂10-20份，去离子水500-800份；
(4)实消
按空消方式三路进蒸汽，开排气门，当罐压升至0.01-0.03mpa，调节蒸汽门，保持恒温打开所有罐顶通向外面的阀门，排气10-30分钟，关闭蒸汽，打开空气过滤器出口通入罐内，用牛皮纸包扎接种关口，关闭小排气阀，开启冷却水，使罐温降至35-37℃，关闭冷却水；
(5)接菌种悬浮液
将种子罐的压降至0，除去接种口上的盖帽，在火焰下将摇瓶种子倒入种子罐，拧紧种子罐接种口的盖帽，调整罐压至0.05-0.15mpa；
(6)移种
将种子罐底阀至分配站、发酵罐的管道灭菌，管道从发酵罐方通入0.1-0.2mpa无菌蒸汽，灭菌10-30分钟，打开所有管道上的小排气阀；灭菌完毕，打开发酵罐接种阀，通入无菌空气，关闭小排气阀，待管路冷却至接种温度30-35℃，升高种子罐压力至0.1-0.2mpa，切换分配站阀门，降低发酵罐压至0.02-0.04mpa，将种子液压入发酵罐；接种完毕，调罐压至0.05-0.15mpa，温度30-34℃，发酵周期150-180h，移种完毕，用蒸汽冲洗移种管线中的残料，关闭阀门；
所述发酵罐中装填发酵料，所述发酵料为水果、蔬菜、处理加工过的黄豆、处理加工过的红豆中的任意一种；
所述发酵料为水果时，所述水果经过去核或去皮，磨碎，115℃灭菌30min，降温至常温备用，所述水果为苹果；
所述发酵料为蔬菜时，所述蔬菜经过磨碎，115℃灭菌30min，降温至常温备用，所述蔬菜为土豆；
(7)放罐清洗
当pH达到7.0-7.5，终止发酵，停空气，停搅拌，打开出料阀，发酵液贮罐入料阀，利用压缩空气将料压至发酵液贮罐；料压净后，关闭出料阀，开排污阀，停压缩空气，当罐压为零时，打开入孔，用水清洗罐内所有装置，冲洗完毕通入空气，吹出CO2；
(8)过滤
利用板框压缩，除去菌丝体，至过滤液透明无菌丝，残渣中杂质质量分数小于1％；
(9)低温冷冻干燥：
操作温度在-25℃至-30℃，操作时间为72小时-96小时；
(10)粉碎，分装，包装，储存。
2.根据权利要求1所述的采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法，其特征在于，所述发酵料为处理加工过的黄豆时，处理加工过程为：选取黄豆清洗干净，浸泡24小时，磨碎，121℃高温灭菌60min，降温至常温备用。
3.根据权利要求1所述的采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法，其特征在于，所述发酵料为处理加工过的红豆时，处理加工过程为：选取红豆清洗干净，浸泡36小时，磨碎，121℃高温灭菌60min，降温至常温备用。
4.根据权利要求1所述的采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法，其特征在于，步骤(8)所述过滤的操作步骤为：
1)检查板框液压系统及装置，将合格滤布平整地铺在板框间；
2)启动液压泵，顶紧，压力控制在7-9Mpa；
3)将发酵液用泵输入板框，起泵时，掀开板框入料阀、回流阀，开贮罐口、泵入口，起泵；
4)过滤时，料液要始终保证温度恒定，搅拌不能停止，滤液要保证清晰透明,出料减慢时，证明滤渣已满，停止进料,罐渣吹干后将接收槽内料液排净，堵好出口，启动液压系统，退回板框，清理框内滤饼，洗好滤布，重新装好顶紧。
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| CN103602651A (zh) * | 2013-11-06 | 2014-02-26 | 北京燕京啤酒股份有限公司 | 一种纳豆激酶生产方法 |
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