CN105273052B

CN105273052B - 血栓靶向释放rgds的抗栓剂聚天冬酰-rgds的合成和应用

Info

Publication number: CN105273052B
Application number: CN201410272960.3A
Authority: CN
Inventors: 赵明; 彭师奇; 王玉记; 吴建辉; 陈双玲
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2014-06-19
Filing date: 2014-06-19
Publication date: 2019-01-15
Anticipated expiration: 2034-06-19
Also published as: CN105273052A

Abstract

本发明涉及血栓靶向释放RGDS的聚天冬酰‑RGDS，涉及它的制备方法，涉及它在大鼠血栓模型上的靶向抗血栓作用。因而本发明阐明了聚天冬酰‑RGDS作为靶向抗血栓剂的临床应用前景。本发明属于生物医药领域。

Description

血栓靶向释放RGDS的抗栓剂聚天冬酰-RGDS的合成和应用

发明领域

本发明涉及血栓靶向释放RGDS的聚天冬酰-RGDS，涉及它的制备方法，涉及它在大鼠血栓模型上的靶向抗血栓作用。因而本发明阐明了聚天冬酰-RGDS作为靶向抗血栓剂的临床应用前景。本发明属于生物医药领域。

背景技术

血小板血栓是血栓形成的起始阶段，可以分为血小板粘附、活化和聚集三个过程。在血小板血栓形成过程中，血小板膜上GPIIb/IIIa活化，构象发生改变，然后在Ca²⁺的参与下，与纤维蛋白原或vWF上的RGD四肽序列特异性结合将血小板和红血球偶联起来，形成血栓。在血小板聚集过程中，纤维蛋白原或vWF上的RGDS与活化的血小板表面受体GP IIb/IIIa结合起至关重要的作用。外源性RGDS与被GP IIb/IIIa识别并竞争性抑制纤维蛋白原或vWF与血小板结合，抑制血小板聚集。血栓形成部位富集了活化的血小板，这些血小板是血栓形成的重要构件。如果能把RGDS定向释放到血栓形成部位，就可以使这些活化的血小板不能参与血栓形成，从而有效地抑制血栓形成。可是，这个目标在本发明申请之前没有达到。根据这些认识，发明人提出了本发明。本发明的突出创造性在于用聚天冬酰-RGDS将RGDS输送到血栓形成部位，然后在血栓中有效地释放RGDS，发挥靶向抗血栓作用。

发明内容

本发明的第一个内容是采用常规的液相合成，逐步接肽制备HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Se(Bzl)-OBzl。

本发明的第二个内容是采用标准方法，制备平均分子量为20964，链长为173个天冬氨酸残基的聚天冬氨酸。

本发明的第三个内容是采用EDC法将HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Se(Bzl)-OBzl偶联到聚天冬氨酸的羧基上然后脱去RGDS的侧链和羧端保护基，制备聚天冬酰-RGDS。

本发明的第四个内容是测定聚天冬酰-RGDS的抗血小板聚集活性。

本发明的第五个内容是测定聚天冬酰-RGDS的抗血栓活性。

本发明的第六个内容是测定聚天冬酰-RGDS对GPIIb/IIIa的影响。

本发明的第七个内容是测定聚天冬酰-RGDS在血栓中释放RGDS。

本发明中所出现的缩略语的说明：

RGDS Arg-Gly-Asp-Ser

PD 聚天冬氨酸

聚天冬酰-RGDS 聚天冬酰-Arg-Gly-Asp-Ser

THF 四氢呋喃

DCC 二环己基酰亚胺

DCU 二环己基脲

OBzl 苄氧基

Boc 叔丁氧羰基

Tos 对甲苯磺酸基

OMe 甲氧基

HOBt N-羟基苯并三唑

NMM N-甲基吗啉

EDC 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺

PAF 血小板活性因子

ADP 腺苷二磷酸

AA 花生四烯酸

TE 凝血酶

附图说明

图1.聚天冬酰-RGDS的合成路线.i)85％H₃PO₄，180℃，减压；ii)NaOH，H₂O，0℃；iii)EDC/HOBt；iv)DCC，HoBt，0℃；v)NaOH(2N)，H₂O，0℃；vi)氯化氢的乙酸乙酯溶液(4N)；vii)CF₃CO₂H，CF₃SO₃H。

图2.聚天冬酰-RGDS治疗的大鼠血液提取物的FT-MS谱(上)和血栓提取物的FT-MS谱(下)。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl

1)制备Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl

将4.986g(11.64mmol)Boc-Arg(Tos)，1.310g(9.7mmol)HOBt溶于30mL无水THF，往得到的溶液中加2.398g(11.64mmol)DCC的无水THF溶液，冰浴搅拌20min，得到反应液I。将3.273g(9.7mmol)Tos·Gly-OBzl与30mL无水THF的溶液用NMM调pH9，得到反应液II。将反应液II加到反应液I中，室温反应12小时。TLC(丙酮∶石油醚＝2∶1)显示反应完成。过滤除去DCU沉淀，滤液减压浓缩，残留物用150mL乙酸乙酯溶解，过滤除去DCU沉淀。滤液分别用饱和NaHCO₃(50mL×1)，5％NaHCO₃(50mL×2)，饱和NaCl(50mL×3)，5％KHSO₄(50mL×3)，饱和NaCl(50mL×3)，5％NaHCO₃(50mL×3)，饱和NaCl(50mL×3)洗，加无水NaSO₄干燥。滤出干燥后的乙酸乙酯溶液，减压浓缩得到的5.339g淡黄色固体粗品用硅胶柱纯化(丙酮∶石油醚＝1∶4)，得到4.93g(88％)纯品，为无色固体。

2)制备Boc-Arg(Tos)-Gly

在冰浴下将5.291g(9.19mmol)Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl溶于20mL甲醇，往得到的溶液中加14mLNaOH水溶液(2N)，搅拌1小时，TLC(丙酮∶石油醚＝1∶1)显示反应完成。反应液用饱和KHSO₄调pH7，减压浓缩。残留液先用NaOH水溶液(2N)调pH9，再用乙醚萃取。水层用饱和KHSO₄调pH2，用50mL乙酸乙酯萃取3次，合并的乙酸乙酯萃取液加无水NaSO₄干燥。滤出干燥后的乙酸乙酯溶液，减压浓缩得到3.782g(84％)Boc-Arg(Tos)-Gly，为无色固体。ESI-MS(m/e)：377[M+H]⁺。

3)制备Boc-Asp(OBzl)-Se(Bzl)-OBzl

按照制备Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl的方法，从2.716g(8.4mmol)Boc-Asp(OBzl)和3.273g(7mmol)HCl·Ser(Bzl)-OBzl，得到3.339g(81％)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl，为浅黄色固体。

4)制备HCl·Asp(OBzl)-Se(Bzl)-OBzl

在冰浴下将2.379g(4mmol)Boc-Asp(OBzl)-Se(Bzl)-OBzl溶于6mL乙酸乙酯中，往得到的溶液中加入20mL氯化氢的乙酸乙酯溶液，搅拌4小时，TLC(丙酮∶石油醚＝1∶5)显示反应完成，减压抽去乙酸乙酯。残留物加20mL无水乙醚溶解，溶液减压浓缩。该操作反复5次，以除去产品中的氯化氢。残留物最后加5mL无水乙醚研磨，得到1.862g(92％)产品，为无色粉末，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/e)：413[M+H]⁺。

5)制备Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Se(Bzl)-OBzl

按照制备Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl的方法，从1398mg(2.88mmol)Boc-Arg(Tos)-Gly和1264mg(2.4mmol)HCl·Asp(OBzl)-Se(Bzl)-OBzl得到2023mg(88％)Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Se(Bzl)-OBzl。ESI-MS(m/e)：958[M+H]⁺.¹H NMR(500MHz，CDCl₃)d/ppm＝7.725(d，2H)，7.583(m，2H)，7.235(m，18H)，6.436(s，2H)，6.200(s，1H)，5.653(d，J＝7.0Hz，1H)，5.240(m，4H)，4.907(m，1H)，4.677(m，1H)，4.213(s，1H)，3.942(m，1H)，3.289(s，1H)，3.144(s，1H)，2.904(m，1H)，2.795(s，1H)，2.336(m，3H)，2.251(s，2H)，1.775(d，J＝5.5Hz，1H)，1.594(d，J＝6.5Hz，1H)，1.509(s，2H)，1.385(s，11H)，1.257(s，1H)。

6)制备HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Se(Bzl)-OBzl

按照制备HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl的方法，从2.1g(2.19mmol)Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl得1.782g(91％)HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Se(Bzl)-OBzl固体，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)817[M+H]⁺。

实施例2制备聚天冬氨酸

1)制备聚丁二酰亚胺

将20.0g D，L-Asp和10.4g H₃PO₄(85％)混匀并在180℃减压(0.1MPa)反应3.5小时。反应物趁热产物用80mL DMF溶解，得到的溶液滴入400mL水中。生成的沉淀用砂芯漏斗抽滤，滤饼磨碎成粉末，用水洗至中性，35℃减压干燥至恒重，得到14.4g(98.8％)聚丁二酰亚胺，为淡灰色粉末。¹H NMR(500MHz，CDCl₃)d/ppm：5.294(丁二酰亚胺的H-3)，3.233(丁二酰亚胺的H-4).¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)d/ppm：173.96(丁二酰亚胺的C-3)，172.69(丁二酰亚胺的C-1)，47.82(丁二酰亚胺的C-4)，33.10(丁二酰亚胺的C-5).IRδ/cm^-1：1711和1801(丁二酰亚胺的C＝O)，1160和1213(丁二酰亚胺的C-N)。

2)制备聚天冬氨酸

冰浴下将3g聚丁二酰亚胺和1.4g NaOH用20mL水溶解，搅拌1小时，用浓度为35％的盐酸调pH1，得到的溶液倒入300mL甲醇中。滤出生成的沉淀在40℃真空干燥，得3.2g聚天冬氨酸，为淡黄色固体。采用凝胶渗透色谱-多角激光光散射法测得聚天冬氨酸的数均分子量(Mn)为20964g/mol，重均分子量(Mw)为30476g/mol，分子量分布(d)为1.4537，数均聚合度为173。[α]_D ²⁵＝1.21(C＝0.01，H₂O)。¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)d/ppm＝177.87，173.41，172.75，172.05，171.89，51.76，51.60，39.12，37.61。

实施例3制备聚天冬酰-Arg(Tos)-Gly-Asp-(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl

先将87mg(0.75mmol)聚天冬氨酸溶于1mL无水DMF，冰浴下加入101mg(0.75mmol)HOBt和288mg(1.50mmol)EDC，0.5小时后加入624mg(0.75mmol)HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl，NMM调pH9。室温搅拌24小时，TLC(二氯甲烷∶甲醇，5∶1)显示HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物依次用乙醚(20mL×3)，20mL KHSO₄水溶液(5％)和H₂O(20mL×3)研磨，得到的固体经37℃真空干燥48小时重229mg，为淡黄色。直接用于下一步反应。

实施例4制备聚天冬酰-Arg-Gly-Asp-Ser(聚天冬酰-RGDS)

冰浴下将229mg聚天冬酰-Arg(Tos)-Gly-Asp-(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl溶于6mL三氟乙酸，往得到的溶液中加入2mL三氟甲磺酸，搅拌90分钟。反应混合物用乙醚洗(150mL×3)，残留物溶于50mL水，用NaOH水溶液(2N)调pH7。得到的混浊液离心30分钟，上层清液用孔径为5000的透析膜透析72小时，截留的残留物冷冻干燥，得113mg(49％)聚天冬酰-RGDV，为乳白色固体。[α]_D ²⁵＝-21.56(C＝0.01，H₂O)。¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)d/ppm＝177.33，171.92，170.50，170.07，156.79，138.48，137.48，129.79，129.43，128.56，126.84，60.52，56.21，53.66，53.09，51.25，42.43，40.58，38.83，37.63，27.96，24.32.按照数均聚合度为173计算，聚天冬酰-RGDS的分子量为85911。

实施例5测定聚天冬酰-RGDS的抗血小板聚集活性

1)制备2×10⁸血小板/mL血浆

用1％的硅醚溶液将采血容器硅烷化。在硅烷化的容器中收集猪血，按照猪血∶抗凝剂9∶1(体积比)加入枸橼酸钠(3.8％)抗凝，水平缓慢晃匀。将抗凝的猪血在120g离心10分钟，得到的上清液即是富血小板血浆(PRP)。残留的猪血继续在1500g离心10分钟，得到的上清液即是贫血小板血浆(PPP)。光学显微镜下观察，用PPP调PRP使血小板数目为2×10⁸血小板/mL血浆。

2)测定聚天冬酰-RGDS的抗血小板聚集活性(IC₅₀)

在血小板聚集分析仪测量管内加入240μL PRP，轻微搅拌下37℃温育10分钟，调零。大约1分钟后加入5μL生理盐水(空白对照)或西洛他唑的生理盐水溶液(阳性对照，终浓度为1mM)或聚天冬酰-RGDS的生理盐水溶液(终浓度为0.01，0.1，1.0，10，100μM)。大约1分钟后加入5μLADP的生理盐水溶液(终浓度为500μM)或PAF的生理盐水溶液(终浓度为50μM)或AA的生理盐水溶液(终浓度为7.5mg/mL)或TE的生理盐水溶液(终浓度为50U/mL)。待浊度从100下降进入平台期，记录约6分钟的稳定曲线为最大聚集率，计算各种浓度下聚天冬酰-RGDS对血小板聚集的抑制率。每个浓度平行测6次，求平均值。计算式为抑制率％＝(生理盐水存在下的血小板聚集率-聚天冬酰-RGDS存在下的血小板聚集率)/生理盐水存在下的血小板聚集率。按照5种浓度聚天冬酰-RGDS存在下血小板聚集的抑制率，计算IC₅₀值。用IC₅₀表示活性，结果见表1。

表1聚天冬酰-RGDS对ADP，PAF，AA和TH诱导的血小板聚集的影响(n＝6)*

*聚天冬氨酸未测出抗血小板聚集活性.

表1的数据说明，与RGDS相比聚天冬酰-RGDS抑制ADP，PAF，AA和TE诱导的血小板聚集的活性分别高40，1668，2387和1712倍。可见将RGDS连接到聚天冬氨酸上，大大提高了RGDS的抗血小板聚集活性。

实施例6测定聚天冬酰-RGDS对GPIIb/IIIa的抑制作用

1)制备聚天冬酰-RGDS处理的活化血小板样品

雄性SD大鼠(220～230g)按1200mg/kg剂量腹腔注射乌拉坦水溶液使麻醉。在硅烷化的容器中收集大鼠动脉血，加1/9体积的枸橼酸钠(3.8％)抗凝，水平缓慢晃匀，120g离心10分钟，取上清液，得到PRP血浆。向96μL血浆中加入2μL聚天冬酰-RGDS的生理盐水溶液(终浓度50nM)，孵育5分钟，加2μL AA的生理盐水溶液(终浓度7.5mg/mL)，37℃温育3分钟。

2)测定聚天冬酰-RGDS对GPIIb/IIIa抑制作用

按照GPIIb/IIIa ELISA试剂盒(上海源叶生物科技有限公司)的标准方法，96孔板室温平衡20分钟，设置标准品孔和聚天冬酰-RGDS孔。绘制标准曲线用的标准品孔先加50μL试剂盒的标准溶液(终浓度为1600，800，400，200，100和0ng/mL)，再加100μL辣根过氧化物酶标记的检测抗体。聚天冬酰-RGDS孔先加96μL PRP血浆和10μL聚天冬酰-RGDS的生理盐水溶液(终浓度50nM)，37℃孵育5分钟，再加2μL AA的生理盐水溶液(终浓度7.5mg/mL)，37℃温育3分钟，后加40μL试剂盒的样本稀释液。RGDV孔先加96μL PRP血浆和10μL RGDS的生理盐水溶液(终浓度25mM)，37℃孵育5分钟，再加2μL AA的生理盐水溶液(终浓度7.5mg/mL)，37℃温育3分钟，后加40μL试剂盒的样本稀释液。空白孔孔先加96μL PRP血浆和10μL生理盐水，37℃孵育5分钟，再加2μL AA的生理盐水溶液(终浓度7.5mg/mL)，37℃温育3分钟，再加40μL试剂盒的样本稀释液，后加100μL试剂盒的辣根过氧化物酶标记的检测抗体。96孔板用封板膜封孔，37℃孵育60分钟。每个孔重复3次。

3)洗板/显色和测定

各孔弃去溶液后在吸水纸上拍干，加满试剂盒的洗涤液，静置1分钟。甩去洗涤液后在吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。各孔加入50μL试剂盒的底物A和50μL试剂盒的底物B，37℃避光孵育15分钟。向各孔加50μL试剂盒的终止液，15分钟内在450nm波长处测定各孔的OD值。根据标准曲线计算GPIIb/IIIa的量，结果见表2。

表2聚天冬酰-RGDS对GPIIb/IIIa抑制作用*

*聚天冬酰-RGDS的浓度为50nM，RGDS的浓度为25mM，n＝3.a)与生理盐水比p＜0.05，与RGDS比p＞0.05.

表2的数据说明，将RGDS连接到聚天冬氨酸上，大大提高了RGDS抑制GPIIb/IIIa的活性。与RGDS相比聚天冬酰-RGDS抑制AA活化的血小板上GPIIb/IIIa的活性是RGDS的50万倍。

实施例7测定聚天冬酰-RGDS的抗血栓活性

1)给药

雄性SD大鼠(220～230g)分别口服生理盐水(3ml/kg)，阿斯匹林的生理盐水溶液(167μmol/kg)，聚天冬酰-RGDS的生理盐水溶液(1nmol/kg)，RGDS的生理盐水溶液(剂量为5μmol/kg)，以及聚天冬氨酸(1nmol/kg)和RGDS(1nmol/kg)的混合物的生理盐水溶液。各10只大鼠，30分钟之后进行下面的手术。

2)大鼠手术与插管

雄性SD大鼠(220～230g)按1200mg/kg剂量腹腔注射乌拉坦溶液进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定，分离右颈总动脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，将远心端的手术线于皮毛用止血钳夹紧，准备在远心端插管。

插管为硅烷化过的聚乙烯胶管，分三段。中段为聚乙烯胶管，长6cm，内径3.5mm。另外两段聚乙烯管，长10cm，内径1.0mm，外径2.0mm。它们的一端拉成外径为1.0mm的尖管(用于插入大鼠颈动脉或静脉)。将编好号的干净青霉素小瓶中分别装入6cm长的硅烷化黑色手术线，称重，放入中段插管中。

打开大鼠右侧动脉夹，用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50IU/kg)，然后将插管的动脉端插入大鼠右侧颈总动脉，将计算量的肝素缓缓注入大鼠体内。夹闭右侧颈动脉夹，将插管的静脉端插入分离好的大鼠左侧颈静脉，打开动脉夹，使血液开始循环。并同时开始计时15分钟。

3)血栓称重

15分钟后，剪断动静脉插管，停止循环，用眼科镊小心取出丝线，在滤纸上轻轻蘸掉血滴，放入事先称重好的青霉素小瓶中，精确称重并记录，计算的血栓湿重代表活性，结果见表3。

表3聚天冬酰-RGDS对在大鼠血栓形成的影响*

*n＝10；a)与生理盐水比P＜0.01，与阿司匹林比p＞0.05；b)与生理盐水比p＞0.05.

表3的数据说明，聚天冬酰-RGDS可有效地抑制大鼠形成血栓。与阿司匹林比聚天冬酰-RGDS的活性是阿司匹林的167000倍。可见将RGDS连接到聚天冬氨酸上，大大提高了RGDS对大鼠形成血栓的抑制活性。

实施例7测定聚天冬酰-RGDS的血栓靶向作用

收集实施例6中接受聚天冬酰-RGDS治疗的大鼠的500mg血液加1mL枸橼酸钠的水溶液(3.8％)抗凝，4℃和3000g离心10分钟，上清液与2mL甲醇充分混合，于4℃和12000g离心10分钟，取10μL进样测定FT-MS。在血液提取物的质谱图中没有发现任何与聚天冬酰-RGDS相关的峰(图2上)。测定结果说明，聚天冬酰-RGDS快速从血液向血栓形成部位转移，在血液中不释放RGDS、不代谢。

收集实施例6中接受聚天冬酰-RGDS治疗的大鼠插管中的50mg血栓先用2mL高纯水洗，然后用2mL高纯水制备匀浆。得到的匀浆于4℃和3000g离心10分钟，上清液与2mL甲醇充分混合，于4℃和12000g离心10分钟，取10μL进样测定FT-MS。在血栓提取物的质谱图中看到RGDS的片段，带3个正电荷的RG加K的峰(732.15743，图2下)。测定结果说明，聚天冬酰-RGDS进入血栓之后，释放RGDS，抑制大鼠血栓形成。在血栓中RGDS降解为RG片段。可见，聚天冬酰-RGDS具有血栓靶向作用。

Claims

1.血栓靶向释放RGDS的抗血栓剂聚天冬氨酰-RGDS，其特征在于RGDS与Asp的侧链羧基以酰胺键相连接形成Asp(RGDS),聚天冬氨酸的数均聚合度为173，即聚天冬氨酰-RGDS的数均聚合度为173。

2.权利要求1的血栓靶向释放RGDS的抗血栓剂聚天冬氨酰-RGDS的制备方法，该方法包括下面四个步骤：

(1)采用液相合成方法，逐步接肽合成HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl；

(2)制备数均聚合度为173的聚天冬氨酸；

(3)把HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl连接到数均聚合度为173的聚天冬氨酸的侧链羧基上，制备聚天冬氨酰-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl；

(4)脱去聚天冬氨酰-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl的保护基。

3.权利要求1的血栓靶向释放RGDS的聚天冬氨酰-RGDS在制备抗血栓药物中的用途。