CN102134315A - 聚天冬酰-l-丙氨酸及其制备方法和医药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了聚天冬酰-L-丙氨酸及其制备方法和医药用途。本发明把丙氨酸作为药效团，把聚天冬氨酸作为载药系统，通过酰胺键把它们键合构成的链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸。体内外溶血栓模型实验表明，本发明聚天冬酰-L-丙氨酸具有显著的溶血栓活性。
Description
技术领域
本发明涉及链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸，本发明还涉及该聚天冬酰-L-丙氨酸的制备方法以及该该聚天冬酰-L-丙氨酸作为溶栓剂的应用，属于聚氨基酸类化合物领域。
背景技术
聚氨基酸类化合物一般都显示低毒性、高生物相容性、易降解性和代谢产物可被机体吸收。这些优点使聚氨基酸类化合物作为高分子药用材料受到关注。例如，通过聚天冬氨酸羧基侧链的各种衍生化反应制备的药物释放体系，尤其是聚天冬氨酸与柔红酶素或氨甲喋呤共价结合的控制或靶向抗肿瘤药物因明显的低毒性而受到重视。本发明人曾把L-精氨酸共价键结合到聚天冬氨酸的羧基上，制备链长不确定的聚天冬酰-L-精氨酸抗血栓剂(彭师奇、赵明、王超、秦旸、刘江元，聚天冬酰甘氨酸、丙氨酸和赖氨酸及制备方法和医药用途，专利号：ZL 200310100421.3)。通过这个发明，一方面揭示聚天冬酰氨基酸具有明确的药用前景，另一方面表明一种包含不同链长的聚天冬酰氨基酸混合物不可能确定以克分子量为计量单位的剂量。换句话说，一种包含不同链长的聚天冬酰氨基酸混合物没有确切剂量。
在全球范围内，心脑血管疾病引发的血栓并发症仍然是造成死亡和病残的主要原因。全球每年新增的心脑血管病患者超过1300万。在心脑血管疾病中，血栓性疾病和血管堵塞性疾病(例如高血压、动脉粥样硬化基础上发生的心肌缺血、心肌梗塞(AMI)、脑血管意外和外周血管疾病等)占的比例最高。(血)栓块形成引起的血管闭塞，造成像心脏和脑一类重要靶器官供氧不足。这样一来，血栓性疾病和血管堵塞性疾病的致死和致残率便很高，例如急性心肌梗塞的死亡率可高达30％。血栓性疾病和血管堵塞性疾病的治疗目标是血管再通。临床常采用的手术再通血管和药物再通血管两种技术中，其中，药物再通血管适应最广泛的病人，所以发明新型溶栓药物具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种具有显著的溶血栓活性的聚氨基酸类化合物；
本发明的目的之二是提供一种制备上述具有显著的溶血栓活性的聚氨基酸类化合物的方法；
本发明的目的之三是将上述聚氨基酸类化合物制备成溶血栓药物；
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一种具有显著的溶血栓活性的聚天冬酰-L-丙氨酸，其结构式为式I所示：
血栓形成包含了大量纤维蛋白之间的非键相互作用，往血栓中引入另外的疏水性相互作用可以导致血栓溶解。有些氨基酸可以为血栓提供这种另外的疏水性相互作用。于是，合理组装丙氨酸为寻找溶栓剂提供了基础。按照这种思路，本发明把丙氨酸作为药效团，把聚天冬氨酸作为载药系统，通过酰胺键把它们键合构成的链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸，得到上述具有溶血栓活性的链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸。
本发明的第二个目的是提供一种制备上述式I化合物的方法；
一种制备上述式I化合物的方法，包括：
(1)将DL-天冬氨酸进行脱水缩合反应生成链长为59的聚丁二酰亚胺；
(2)将链长为59的聚丁二酰亚胺进一步与L-丙氨酸缩合，得到式I化合物。
其中，步骤(1)中所述的脱水缩合反应优选在100℃-300℃的温度条件下进行脱水缩合反应，更优选的，在150-220℃的温度条件下进行脱水缩合反应，为了达到更好的效果，特别优选的，在85％磷酸和蒸馏水的存在下，在150 200℃的温度条件下，将反应混合物进行加热减压反应；
此外，步骤(1)中所述的脱水缩合反应可以在以下条件下进行：将DL-天冬氨酸在惰性溶剂(例如四氢萘、四氢呋喃等)中在回流；步骤(1)中所述的脱水缩合反应还可以是将DL-天冬氨酸熔融，其中，所述的熔融温度优选为200℃；
步骤(1)所述的脱水缩合反应的时间可以为1-10小时，优选为2-5小时。
步骤(2)中，优选的，将等摩尔量的链长为59的聚丁二酰亚胺与L-丙氨酸及蒸馏水混合，搅拌，调节反应混合物的pH值为7.5；
具体的：将DL-天冬氨酸与85％磷酸及蒸馏水混合后，在180℃空气浴下减压2.5小时，可顺利地转化为链长为59的聚丁二酰亚胺，收率为93.4％；
将DL-天冬氨酸在四氢萘中回流100小时，可顺利地转化为链长为59的聚丁二酰亚胺，收率为44％；
将DL-天冬氨酸在200℃熔融反应3小时，可顺利地转化为链长为59的聚丁二酰亚胺，收率为16.7％。
在L-丙氨酸的存在下，按上述三种途径制得的聚丁二酰亚胺开环，转化为链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸，产率分别为50％、90％和70％。
本发明用Zeta Sizer(Nano-ZS90)型激光纳米粒度仪测得本发明式I化合物在蒸馏水中(浓度为64μM、6.4μM和64nM)的平均粒径为120-550nm。
本发明用透射电子显微镜(TEM，JEM-200 CX；JEOL，Tokyo，Japan)测得本发明式I化合物在水中(浓度为6.4×10-4nM)的形态为纳米颗粒(直径4-16nm)、纳米球(直径19 71nm)和纳米草莓直径(100 153nm)三种结构。
本发明用体外溶栓模型评价了本发明式I化合物的体外溶栓作用。试验结果显示，在本模型中，本发明式I化合物在16μM、8μM和4μM浓度下显示出的溶栓活性和空白对照水相比都有显著性差异。
本发明以大鼠溶栓模型评价了本发明式I化合物的体内溶栓作用。在本模型中，试验结果显示，本发明式I化合物在5μmol/kg、0.5μmol/kg和0.05μmol/kg剂量下显示出的溶栓活性和空白对照生理盐水相比都有显著性差异。
本发明式I化合物可以制成口服剂型或注射或输液剂型。
本发明式I化合物的剂量根据病人年龄、体重、病程、疾病的轻重等因素来决定。例如，作为参考，在口服剂型的情况下，本发明式I化合物的用量可以是0.05-5μmol/kg/天，在注射剂型的情况下，本发明的化合物用量可以为0.01-1μmol/kg/天。
附图说明
图1是本发明式I化合物的合成路线图。
图2是本发明式I化合物的6.4×10-4nM水溶液电镜图；a)纳米颗粒直径4-16nm；b)纳米球直径19-71nm；c，d)纳米草莓直径100-153nm；c∶d＝1∶1。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例。必须指出的是，这些实施例完全是例证性的。给出这些实施例的目的是为了充分明示本发明的意义和内容，决不对本发明造成任何形式的限制。
在以下实施例中，本发明按图1所示的操作路线，元素分析测得按三种条件制备得到的聚丁二酰亚胺C：48.70％，H：3.64％和N：14.22％，此结果相应于聚丁二酰亚胺分子量为11670。聚-α，β-DL-天冬氨酸和聚-α，β-DL-天冬酰-L-丙氨酸的聚合度为59，即链长为59。因此本发明式I化合物聚-α，β-DL-天冬酰-L-丙氨酸的分子量为15726。
实施例1 加热减压法制备链长为59的聚丁二酰亚胺
5g研细的DL-天冬氨酸、2ml磷酸(85％)和2ml蒸馏水于250ml圆底烧瓶中彻底混匀。反应混合物在180℃空气浴下减压反应2.5小时后趁热往里加20mlDMF，待溶液澄明后滴到100ml蒸馏水中。收集沉淀，用蒸馏水洗至中性，干燥，得到3.4g(93.4％)标题化合物。元素分析(C4H3NO2)n：C，46.76；H，3.35；N，13.64。
实施例2.共沸除水法制备链长为59的聚丁二酰亚胺
50g研细的DL-天冬氨酸与500ml四氢萘(化学醇)的悬浮液回流100小时，通过分水器除去生成的水。反应混合物冷至室温后过滤，滤渣先用乙醚洗，再用饱和NaHCO3水溶液洗(3×100ml)。滤饼再先后用水和稀盐酸(1％)反复洗，最后用蒸馏水反复洗至用AgNO3检测不到Cl-。滤饼干燥，得到16g(44％)标题化合物。元素分析(C4H3NO2)n：C，45.24；H，3.85；N，13.30。
实施例3.熔融法制备链长为59的聚丁二酰亚胺
30g研细的DL-天冬氨酸均匀铺在直径为30cm的器皿底部，200℃加热3小时，反应产物呈橙红色。反应物冷却后用饱和NaHCO3水溶液研磨(3×100ml)，得到的固体反复用蒸馏水洗，离心，沉淀烘干，得5g(17％)标题化合物。元素分析：(C4H3NO2)n：C，46.63；H，3.33；N，13.63。
实施例4 链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸(式I化合物)的制备
按丁二酰亚胺分子量计算，将等摩尔丙氨酸与聚丁二酰亚胺及适量蒸馏水的悬浮液室温搅拌，使反应液中有少量聚丁二酰亚胺悬浮反应混合物pH为7.5。过滤，滤液减压浓缩至干，得到标题化合物。L-丙氨酸与实施例1的聚丁二酰亚胺反应时产率为65％。氨基酸组成分析：Asp∶Ala＝1.00∶0.94
试验例1 链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸(式I化合物)的稳定性
①500μg链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸与1ml去离子水配成的溶液，室温放置，每隔20小时进样20μl，用HPLC法测定标题化合物的主峰面积。结果表明120小时内，峰面积无变化。
②500μg链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸与1ml生理盐水配制成的溶液室温放置，每隔20小时进样20μl，用HPLC法测定标题化合物的主峰面积。结果表明，120小时内峰面积无变化。
③5mg链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸与1ml盐酸(2N)配成的溶液室温放置，每隔20小时进样20μl，用HPLC法测定标题化合物的主峰面积。结果表明，120小时内峰面积无变化。
④5mg链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸与1ml NaOH(2N)溶液配成的溶液室温放置，每隔20小时进样20μl，用HPLC法测定标题化合物的峰面积。结果表明，在120小时内峰面积无变化。
试验例2 链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸(式I化合物)的急性毒性试验
实验动物：昆明种小鼠(17 22g，雄性，购自北京大学医学部实验动物部，许可证号，医学字第01-3056)。
试验方法及结果：20只昆明种小鼠一次灌胃给予链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸，剂量为5μmol/kg，2ml(水溶液)/只，连续观察8天。给药动物未见行为异常，未见死亡。处死后重要脏器也未见异常。
试验例3 链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸的体外溶栓作用
试验目的：应用体外溶栓模型对链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸(式I化合物)进行体外溶栓活性评价。
实验材料：
尿激酶(北京赛生药业有限公司生产，10万单位/支)、生理盐水(山东齐都药业有限公司)、蒸馏水。DZP-102振荡器(中国哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)。雄性SD大鼠，350-400g，北京大学医学部实验动物中心。
实验方法：
(1)血栓形成装置的制作：将内径4mm，外径5.5mm，长度18mm的一段玻璃管安放在一个塑料易拆卸底座上，玻璃管和塑料底座的接缝处用一段乳胶管密封。玻璃管中放置一不锈钢丝螺旋，螺旋直径1mm，长度20mm，包括一端的2mm长的挂钩，血液即凝固在不锈钢螺旋的周围，称重时可将血栓挂起，在孵育时可以将血栓挂在反应瓶的溶液中，不碰到四壁，以免损伤血栓。
(2)反应瓶的制作：用带橡胶塞的10ml西林瓶，在橡胶塞上穿一根不锈钢丝，在瓶中的一端弯成钩，血栓挂在钩上，悬浮于瓶内待测化合物溶液中，不锈钢丝可以在橡胶塞上上下移动，调节血栓在溶液中的高度，使其刚好浸在待测溶液中。体内环境的模拟：按照大鼠平均体重估计每只大鼠有13ml血液，如果是大鼠体内血栓模型，可能约8ml的血液可接触到血栓，故反应瓶中加入8ml待测溶液，在37℃恒温摇床孵育。
(3)血栓的制备：将350-400g雄性SD大鼠用20％乌拉坦(6ml/kg，i.p.)，麻醉，仰卧固定，分离右颈总动脉，动脉夹夹闭近心端，动脉夹上方插入30mm长聚乙烯管，每次放出约3-4ml血，大约可放2-3次，用硅烷化的5ml注射器立即将放出的血液逐个注入制备血栓用的玻璃管中，马上将不锈钢螺旋放入。静置40min使血栓形成，之后将玻璃管小心从底座上取下，用细针将血栓四周和玻璃管内壁分开，取出血栓挂在反应瓶的橡胶塞上，反应瓶中加入8ml蒸馏水，将血栓悬挂在水中静置1小时，除掉血栓表面浮血。1小时后，用滤纸吸去血栓表面的水分，逐个精确称重。
(4)测定化合物体外溶栓活性：在每个反应瓶中重新注入待测化合物的溶液，以生理盐水作为空白对照，尿激酶(100IU/ml)作为阳性对照，再将血栓悬挂于待测化合物的溶液中，37℃恒温摇床70rpm孵育2小时。孵育结束后，用滤纸吸取表面水再逐个精确称重，计算血栓在加入待测溶液前后的重量差，作为衡量链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸溶栓作用的指标，统计评价化合物体外溶栓活性。统计样品组和对照组溶栓前后的重量差并进行t检验。结果见表2.
表1.链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸的体外溶栓结果a
a)血栓减重表示为
n＝6，UK+聚天冬酰-L-丙氨酸组操作为：首先血栓在UK(100IU/mL)中孵育1小时，然后放入聚天冬酰-L-丙氨酸(16μM)中3小时；b)与生理盐水比较P＜0.01，与8μM组比较P＜0.05；c)与生理盐水比较P＜0.01，与4μM组比较P＜0.05；d)与生理盐水比较P＜0.05。
试验结果：链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸(式I化合物)在16μM、8μM和4μM浓度显示出的溶栓活性和空白对照水相比都有显著性差异。
试验例4 链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸(式I化合物)的体内溶栓试验
实验材料：
乌拉坦(上海天莲精细化工有限公司)、肝素钠(北京奥博星生物技术责任有限公司)、尿激酶(北京赛生药业)、生理盐水(山东齐都药业)。固定板、动脉夹、弯止血钳、直止血钳、弯眼科镊、直眼科镊、注射器、手术线、皮筋、1ml EP管、旁路插管、剪刀、血栓托、血栓螺丝、天平、硅油。雄性SD大鼠，200-220g，北京大学医学部实验动物中心。
实验方法：大鼠颈动静脉旁路插管模型
(1)制备血栓：将200-220g雄性SD大鼠用20％乌拉坦溶液(6ml/kg，i.p.)进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定，分离右颈总动脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，将远心端的手术线于皮毛用止血钳夹紧，在远心端插管，松开动脉夹，放出约1ml动脉血，装在1ml EP管中。往垂直固定的玻璃管(长15mm，内径2.5mm，外径5.0mm，管底用胶塞密封)中注入0.1ml大鼠动脉血液，往管内迅速插入一支不锈钢质料的血栓固定螺栓。该血栓固定螺旋用直径为0.2mm的不锈钢丝绕成，螺旋部分长12mm，含15个螺圈，螺圈的直径为1.0mm，托柄与螺旋相连，长7.0mm，呈问号型。血液凝固15min后，打开玻璃管底部的胶塞，用镊子固定血栓固定螺旋的托柄，从玻璃管中取出被血栓包裹的血栓固定螺旋，精确称重。
(2)制备旁路插管：旁路插管由3段构成，中段为聚乙烯胶管，长60mm，内径3.5mm，两端为相同的聚乙烯管，长100mm，内径1mm，外径2mm，该管的一端拉成尖管(用于插入大鼠颈动脉或静脉)，外径1mm，另一端的外部套一段长7mm，外径3.5mm的聚乙烯管(加粗，用于插入中段的聚乙烯胶管内)。3段管的内壁均硅烷化。将血栓包裹的血栓固定螺旋放入中段聚乙烯胶管内，胶管的两端分别与两根聚乙烯的加粗端相套。用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50IU/kg)，备用。
(3)进行插管：分离大鼠的左颈外静脉，近心端和远心端分别穿入手术线，在暴露的左颈外静脉上小心地剪一斜口，将上面制备好的旁路管道的尖管由斜口插入左颈外静脉开口的近心端，同时远离旁路管中段(含精确称重的血栓固定螺旋)内血栓固定螺旋的托柄。用注射器通过另一端的尖管推入准确量的肝素生理盐水(50IU/kg)，此时注射器不撤离聚乙烯管，用止血钳夹住注射器与聚乙烯管之间的软管。在右颈总动脉的近心端用动脉夹止血，在离动脉夹不远处将右颈总动脉小心地剪一斜口。从聚乙烯管的尖部拔出注射器，将聚乙烯管的尖部插入动脉斜口的近心端。旁路管道的两端都用4号手术缝线与动静脉固定。
(4)体循环：用头皮针将生理盐水(3ml/kg)，尿激酶的生理盐水溶液(20000IU/kg)或不同浓度化合物的生理盐水溶液通过旁路管的中段(含精确称重的血栓固定螺旋)，刺入远离血栓固定螺旋的近静脉处，打开动脉夹，使血流通过旁路管道从动脉流向静脉，此即大鼠动静脉旁路溶栓模型，缓慢将注射器中的液体注入到血液中(约6min)，使生理盐水(空白对照)，尿激酶(阳性对照)或链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸通过血液循环，按静脉-心脏-动脉的顺序作用到血栓上。从开始注射时计时，1h后从旁路管道中取出血栓固定螺旋，精确称重。计算每只大鼠旁路管道中血栓固定螺旋给药前后的质量差，统计并评价链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸(式I化合物)的体内溶栓活性。
实验结果：
采用大鼠颈动静脉旁路插管模型，以生理盐水为空白对照，UK(20000IU/kg)为阳性对照，评价聚天冬酰-L-丙氨酸(5μmol/kg、0.5μmol/kg和0.05μmol/kg)(式I化合物)的体内溶栓活性。数据如下：
表3 链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸的体内溶栓结果a
a)n＝12，血栓减重表示为
b)与生理盐水比较P＜0.05；c)与生理盐水和UK比较P＜0.01，与0.5μmol/kg组比较P＜0.05；d)与生理盐水比较P＜0.01，与0.05μmol/kg组比较P＜0.05；e)与生理盐水比较P＜0.01.
试验例5 链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸(式I化合物)的纳米粒的粒径表征
与链长不确切的聚天冬酰-L-丙氨酸不同，链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸(式I化合物)在生理盐水中可形成纳米粒。在蒸馏水、胃、血液和组织液的pH(pH 6.7、pH 1.2、pH 7.6和pH 7.4)下，本发明用纳米粒度仪测定了链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸的粒径。链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸的生理盐水溶液的浓度为64μM、6.4μM和64nM，测试温度为25℃、37℃和50℃。测定间隔为30秒，共测10次，每测定一次连续记录5分钟，记录平均粒径和半峰宽。采用英国Malvern公司Zeta Sizer(Nano-ZS90)型激光纳米粒度仪，操作软件为DTS(Nano)Program。数据数据见表4：
表4 链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸在水溶液中的粒径
链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸在水溶液中的粒径大小是呈现浓度和温度依赖性。例如，25℃和pH 6.7时64μM和64nM聚天冬酰-L-丙氨酸的粒子粒径分别为521和291nm。
试验例6 电镜表征链长为59的聚天冬酰-L-丙氨酸(式I化合物)的纳米结构
实验操作：
将式I化合物溶于水中配置成浓度为6.4×10-4nM溶液，滴在特制铜网上，室温自然挥发干，在透射电子显微镜(TEM，JEM-200CX；JEOL，Tokyo，Japan)下观察其形态及粒径并用照片记录。聚天冬酰-L-丙氨酸呈现纳米颗粒(直径4-16nm)、纳米球(直径19-71nm)和纳米草莓直径(100-153nm)三种结构。
Claims (10)
1.具有溶血栓活性的聚天冬酰-L-丙氨酸，其结构式为式I所示：
2.一种制备权利要求1所述式I化合物的方法，包括：
(1)将DL-天冬氨酸进行脱水缩合反应生成链长为59的聚丁二酰亚胺；
(2)将链长为59的聚丁二酰亚胺进一步与L-丙氨酸缩合，即得。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的脱水缩合反应在100℃-300℃的温度条件下进行脱水缩合反应，优选的，在150-220℃的温度条件下进行脱水缩合反应。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的脱水缩合反应是指在85％磷酸和蒸馏水的存在下，在150 200℃的温度条件下，将反应混合物进行加热减压反应；
5.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的脱水缩合反应在以下条件下进行：将DL-天冬氨酸在惰性溶剂中在回流；优选的，所述的惰性溶剂包括四氢萘或四氢呋喃。
6.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的脱水缩合反应将DL-天冬氨酸熔融。
7.按照权利要求2-6任何一项所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的脱水缩合反应的时间为1-10小时，优选为2-5小时。
8.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中将等摩尔量的链长为59的聚丁二酰亚胺与L-丙氨酸及蒸馏水混合，搅拌，调节反应混合物的pH值为7.5。
9.一种溶血栓的药物组合物，包括治疗上有效量的权利要求1所述的式I化合物和药学上可接受的载体或辅料。
10.权利要求1所述的式I化合物在制备溶血栓药物中的用途。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20110727 |