CN111821470A - 包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种包载甲氨蝶呤的铁‑鞣酸配合物及其制备方法与应用。所述配合物中甲氨蝶呤与鞣酸通过共价偶联形成药物‑有机配体键合物，所述药物‑有机配体键合物与Fe3+配位形成包载甲氨蝶呤的铁‑鞣酸配合物，再通过静电作用将靶向配体与配合物结合形成靶向配合物，该配合物无需外加其他载体材料和有机溶剂等，制备过程简单可控、绿色安全，且在被动靶向和主动靶向的双重介导下将药物高效递送至炎性关节部位，用于治疗类风湿性关节炎。

Description

包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物及其制备方法与应用。
背景技术
类风湿性关节炎(RA)是一种关节组织慢性炎症性病变的自身免疫性疾病，主要侵犯全身四肢小关节，发病率达1％。其主要病理特征表现为血管翳与滑膜炎的形成，血管翳具有侵袭性，滑膜炎导致滑膜组织侵蚀性增生与炎症细胞与因子浸润，进而侵蚀周围软骨导致进展性软骨损伤，最终致使骨损伤、关节功能丧失并引发一系列并发症。药物治疗是目前临床治疗RA的首选方式。
甲氨蝶呤(MTX)具有免疫抑制及抗炎作用，是治疗RA的一线用药，其缓解风湿病进程疗效显著且价格低廉。目前临床上常采用口服或肠道外(肌肉注射、皮下注射)给药，但MTX的血浆半衰期短，需高剂量频繁给药，现有制剂因无法靶向炎症部位而产生多种不良反应，严重限制了其临床应用。
RA病变滑膜组织快速增生需消耗大量养分，导致大量血管新生；在炎性环境的刺激下血管内皮相互牵拉，在内皮细胞间产生较宽缝隙，具有类似于肿瘤高通透性与滞留效应(EPR)效应的“ELVIS”效应，有助于纳米药物在关节部位的滞留。此外，在RA的发生和发展中发挥重要作用的活化巨噬细胞，其表面高表达多种特异性受体，如叶酸受体、CD44受体和清道夫受体等，有助于药物的靶向递送。
以往研究较多的MTX纳米递药系统包括聚合物胶束、纳米脂质体等，普遍存在制备复杂、载体材料消耗量大、载药量低等缺点；此外制备时常使用大量有机溶剂，易导致安全性问题。
发明内容
针对现有技术中存在的MTX纳米递药系统制备复杂、载体材料消耗量大、载药量低等缺点，本发明提供了一种包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物，所述配合物中甲氨蝶呤与鞣酸通过共价偶联形成药物-有机配体键合物，所述药物-有机配体键合物与Fe3+配位形成包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物。
更进一步地，所述配合物还包括靶向配体，所述靶向配体与所述包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物通过静电作用结合形成包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸靶向配合物。
更进一步地，所述靶向配体包括透明质酸、叶酸、唾液酸。
本发明还提供了一种包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
S1：甲氨蝶呤与鞣酸发生酯化反应并纯化获得甲氨蝶呤-鞣酸键合物；
S2：将所述甲氨蝶呤-鞣酸键合物配制成溶液，并加入三价铁化合物搅拌反应获得包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物。
更进一步地，所述制备方法还包括：
将靶向配体配置成溶液，滴入至所述包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物中，搅拌反应获得包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸靶向配合物。
更进一步地，所述酯化反应过程中加入催化剂，所述催化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，所述甲氨蝶呤、鞣酸和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:2:2-1:20:20。
更进一步，所述甲氨蝶呤-鞣酸键合物与三价铁化合物的摩尔比为2:1-1:20。
本发明还提供了一种上述包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。
本发明还提供了一种上述包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物在制备靶向活化巨噬细胞的药物中的应用。
本发明还提供了一种上述包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物在构建甲氨蝶呤靶向递送系统中的应用。
有益效果：
1、本发明提供了一种包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物，甲氨蝶呤与鞣酸通过共价偶联形成药物-有机配体键合物，再与铁离子配位形成包载甲氨蝶呤的配合物。以往研究较多的甲氨蝶呤靶向递送系统包括聚合物胶束、纳米脂质体等，普遍存在制备复杂、载体材料消耗量大、载药量低等缺点；此外制备时常使用大量有机溶剂，易导致安全性问题。本发明的载药靶向配合物是由金属离子与药物-有机配体键合物配位交联形成，无需外加其他载体材料和有机溶剂等，制备过程简单可控、绿色安全。
2、本发明提供了一种包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物，并在其表面修饰靶向配体，该配合物具有纳米级粒径(～200nm)，可通过类似于实体瘤高通透性和滞留效应(EPR效应)的ELVIS效应被动靶向至炎性关节部位，增加药物在关节部位的蓄积，降低药物对正常组织的毒副作用。其次，靶向配体叶酸、唾液酸等可特异性识别活化巨噬细胞膜表面特异性高表达的受体，如CD44受体、叶酸受体、整合素受体等，增加活化巨噬细胞对该载药配合物的摄取。因此，本发明的载药配合物可在被动靶向和主动靶向的双重介导下将药物高效递送至炎性关节部位。
3、本发明提供了一种载药配合物在构建甲氨蝶呤靶向递送系统中的应用，该载药配合物可靶向富集于炎性关节病灶部位，选择性的作用于活化的巨噬细胞，降低炎症因子的水平，改善炎性关节的病理状态，同时在一定程度上降低甲氨蝶呤导致的肝损伤，实现类风湿性关节炎的高效低毒治疗，为甲氨蝶呤的靶向递送和类风湿性关节炎的精准治疗提供依据和思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实验例1检测获得的MTX、TA、MTX-TA的核磁共振氢谱图；
图2为本发明实验例2检测获得的MTX-TA的X射线光电子能谱图；
图3为本发明实验例3检测获得的中MTX-TA/Fe3+NPs、MTX-TA/Fe3+@HA NPs的粒径及电位变化图；
图4为本发明实验例4检测获得的MTX-TA/Fe3+@HA NPs的透射电镜图；
图5为本发明实验例5检测获得的MTX-TA、FeCl3、HA、MTX-TA/Fe3+NPs、MTX-TA/Fe3+@HA NPs的紫外吸收光谱图；
图6为本发明实验例6检测获得的MTX-TA/Fe3+@HA NPs在PBS、DMEM完全培养基中的粒径变化图；
图7为本发明实验例7检测获得的MTX-TA/Fe3+NPs、MTX-TA/Fe3+@HA NPs在10mMPBS(pH7.4)中的释放曲线图；
图8为本发明实验例8检测获得的中MTX-TA/Fe3+NPs、MTX-TA/Fe3+@HA NPs的溶血结果图；
图9为本发明实验例9检测获得的MTX-TA/Fe3+@HA NPs在不同条件下的细胞摄取荧光成像图；
图10为本发明实验例10检测获得的未活化/活化巨噬细胞与MTX、MTX-TA/Fe3+@HANPs孵育后的细胞存活率结果图；
图11为本发明实验例10检测获得的MTX、MTX-TA/Fe3+@HA NPs的IC50结果；
图12为本发明实验例11检测获得的小鼠的足掌外观和厚度变化图，图12A为各组小鼠给药前后的足掌外观图，图12B为各组小鼠在给药期间的足掌厚度变化图，图12C为给药结束后各组小鼠的足掌厚度；
图13为本发明实验例11检测获得的各组小鼠踝关节切片的H&E染色图；
图14为本发明实验例11检测获得的各组小鼠关节中TNF-α的表达情况；
图15为本发明实验例12检测获得的各组小鼠在给药期间的体重变化；
图16为本发明实验例12检测获得的各组小鼠的血清生化指标测定结果；
图17为本发明实验例12检测获得的各组小鼠肝、脾、肾切片的H&E染色图。
具体实施方式
为了更加清楚阐述本发明的技术内容，在此结合具体实施例予以详细说明，显然，所列举的实施例只是本技术方案的优选实施方案，本领域的技术人员可以根据所公开的技术内容显而易见地得出的其他技术方案仍属于本发明的保护范围。
实施例1
将284.0mg MTX、119.8mg EDC·HCl、85.1mgTA溶于10mL DMSO，于100mL圆底烧瓶中室温避光搅拌12h即得MTX-TA反应液；将MTX-TA反应液置于冰水浴，加入足量超纯水使析出沉淀，抽滤并收集滤渣，为棕红色固体。用适量PBS溶液混悬该固体，转移至透析袋内(MWCO＝1000)，置于PBS溶液(10mM，pH 7.4)中室温透析48h后，将透析袋转移至超纯水中透析24h。收集透析袋内液体，冷冻干燥后即得棕黄色固体MTX-TA。
取4mL浓度为0.5mM的MTX-TA溶液(溶于PBS)于20mL烧杯中，加入4mL浓度为8mM(或0.25mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM、10mM)的FeCl3溶液，室温搅拌15min即得载药配合物(MTX-TA/Fe3+NPs)。
实施例2
将531.6mgmg MTX、212.7mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl、53.2mgTA溶于10mL二甲亚砜DMSO，于100mL圆底烧瓶中室温避光搅拌12h获得甲氨蝶呤-鞣酸MTX-TA反应液，将MTX-TA反应液置于冰水浴，加入足量超纯水使析出沉淀，抽滤并收集滤渣，为棕红色固体。用适量PBS溶液混悬该固体，转移至透析袋内(MWCO＝1000)，置于PBS溶液(10mM，pH 7.4)中室温透析42h后，将透析袋转移至超纯水中透析28h。收集透析袋内液体，冷冻干燥后即得棕黄色固体MTX-TA。
取4mL浓度为0.5mM的MTX-TA溶液(溶于PBS)于20mL烧杯中，加入4mL浓度为8mM的Fe2(SO4)3溶液，室温搅拌15min即得甲氨蝶呤-鞣酸-铁配合物(MTX-TA/Fe3+NPs)。
实施例3
将284.0mg MTX、119.8mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、85.1mgTA溶于10mL二甲亚砜(DMSO)，于100mL圆底烧瓶中室温避光搅拌12h获得甲氨蝶呤-鞣酸(MTX-TA)反应液，将MTX-TA反应液置于冰水浴，加入足量超纯水使析出沉淀，抽滤并收集滤渣，为棕红色固体。用适量磷酸盐缓冲液(PBS溶液)混悬该固体，转移至透析袋内(MWCO＝1000)，置于PBS溶液(10mM，pH 7.4)中室温透析48h后，将透析袋转移至超纯水中透析24h。收集透析袋内液体，冷冻干燥后即得棕黄色固体MTX-TA。
取4mL浓度为0.5mM的MTX-TA溶液(溶于PBS)于20mL烧杯中，加入4mL浓度为8mM的FeCl3溶液，室温搅拌15min即得甲氨蝶呤-鞣酸-铁配合物(MTX-TA/Fe3+NPs)。
取4mL MTX-TA/Fe3+NPs于20mL烧杯中，在搅拌下加入4mL浓度为0.24mg/mL的HA水溶液，室温搅拌4h，并在速率为16000rpm条件下离心20min即得包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸靶向配合物(MTX-TA/Fe3+@HA NPs)。
实施例4
将531.6mgmg MTX、212.7mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl、53.2mgTA溶于10mL二甲亚砜DMSO，于100mL圆底烧瓶中室温避光搅拌12h获得甲氨蝶呤-鞣酸MTX-TA反应液，将MTX-TA反应液置于冰水浴，加入足量超纯水使析出沉淀，抽滤并收集滤渣，为棕红色固体。用适量PBS溶液混悬该固体，转移至透析袋内(MWCO＝1000)，置于PBS溶液(10mM，pH 7.4)中室温透析42h后，将透析袋转移至超纯水中透析28h。收集透析袋内液体，冷冻干燥后即得棕黄色固体MTX-TA。
取4mL浓度为0.5mM的MTX-TA溶液(溶于PBS)于20mL烧杯中，加入4mL浓度为8mM的Fe2(SO4)3溶液，室温搅拌15min即得甲氨蝶呤-鞣酸-铁配合物(MTX-TA/Fe3+NPs)。
取4mL MTX-TA/Fe3+NPs于20mL烧杯中，在搅拌下加入4mL浓度为0.24mg/mL的HA水溶液，室温搅拌4h，并在速率为16000rpm条件下离心20min即得包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸靶向配合物(MTX-TA/Fe3+@HA NPs)。
实施例5
将284.0mg MTX、119.8mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl、85.1mgTA溶于10mL二甲亚砜DMSO，于100mL圆底烧瓶中室温避光搅拌12h获得甲氨蝶呤-鞣酸MTX-TA反应液，将MTX-TA反应液置于冰水浴，加入足量超纯水使析出沉淀，抽滤并收集滤渣，为棕红色固体。用适量PBS溶液混悬该固体，转移至透析袋内(MWCO＝1000)，置于PBS溶液(10mM，pH 7.4)中室温透析46h后，将透析袋转移至超纯水中透析20h。收集透析袋内液体，冷冻干燥后即得棕黄色固体MTX-TA。
取4mL浓度为0.5mM的MTX-TA溶液(溶于PBS)于20mL烧杯中，加入4mL浓度为1mM的FeCl3溶液，室温搅拌15min即得甲氨蝶呤-鞣酸-铁配合物(MTX-TA/Fe3+NPs)。
取4mL MTX-TA/Fe3+NPs于20mL烧杯中，在搅拌下加入4mL浓度为0.12mg/mL的HA水溶液，室温搅拌4h，并在速率为16000rpm条件下离心25min即得包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸靶向配合物(MTX-TA/Fe3+@HA NPs)。
实施例6
将284.0mg MTX、119.8mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl、85.1mgTA溶于10mL二甲亚砜DMSO，于100mL圆底烧瓶中室温避光搅拌12h获得甲氨蝶呤-鞣酸MTX-TA反应液，将MTX-TA反应液置于冰水浴，加入足量超纯水使析出沉淀，抽滤并收集滤渣，为棕红色固体。用适量PBS溶液混悬该固体，转移至透析袋内(MWCO＝1000)，置于PBS溶液(10mM，pH 7.4)中室温透析48h后，将透析袋转移至超纯水中透析24h。收集透析袋内液体，冷冻干燥后即得棕黄色固体MTX-TA。
取4mL浓度为0.5mM的MTX-TA溶液(溶于PBS)于20mL烧杯中，加入4mL浓度为10mM的FeCl3溶液，室温搅拌15min即得甲氨蝶呤-鞣酸-铁配合物(MTX-TA/Fe3+NPs)。
取4mL MTX-TA/Fe3+NPs于20mL烧杯中，在搅拌下加入4mL浓度为0.48mg/mL的HA水溶液，室温搅拌4h，并在速率为16000rpm条件下离心18min即得包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸靶向配合物(MTX-TA/Fe3+@HA NPs)。
实验例
根据实施例1-6获得的配合物材料，检测其物理化学性质和药学特性，具体包括核磁共振氢谱、X射线光电子能谱、粒径和电位、微观形态、紫外光谱、稳定性检测、释放率检测、溶血性检测、靶向性能检测、对未活化/活化巨噬细胞的细胞毒性、体内抗RA活性和体内安全性，其中以实施例1和实施例3得到的相关材料做具体阐述。
实验例1
核磁共振氢谱：分别将MTX、TA、MTX-TA溶于氘代DMSO，以四甲基硅烷(TMS)为内标，采用核磁共振氢谱仪分析；其检测结果如图1所示。从图中可知：MTX-TA具有MTX和TA的全部特征峰，且由于发生酯化反应MTX-TA中TA的羟基信号减弱，证明MTX-TA的成功合成。
实验例2
X射线光电子能谱：对MTX-TA进行X射线光电子能谱扫描；其检测结果如图2所示。从图中可知，MTX-TA中C、N、O的原子数百分比分别为59.38％、9.61％、31.02％，由此计算出MTX-TA中MTX和TA的摩尔比为2:1。
实验例3
粒径和电位检测，MTX-TA/Fe3+NPs和MTX-TA/Fe3+@HA NPs的粒径和电位，测量方法为：取样品溶液置于Marlven Nano ZS仪器，采用动态光散射法检测粒径，测定池温度设定为25℃，每个样品平行操作3份，其结果如图3所示。从图的结果可知：载药配合物MTX-TA/Fe3+NPs的粒径为207.2nm，电位为+25.7mV，而包被透明质酸的载药配合物MTX-TA/Fe3+@HANPs的粒径增至222.8nm，电位降至-25.9mV。
实验例4
形态：观察MTX-TA/Fe3+@HA NPs的形态，形态的检测方法：样品滴加在覆盖碳膜的400目铜网上，置于干燥器中，待其自然干燥后置于透射电镜Titan G2-F20下观察，其结果如图4所示。从图中可知：本发明的MTX-TA/Fe3+@HA NPs彼此黏连但分布较为均匀，单一粒子呈球形，粒径约25nm。
实验例5
紫外光谱：分别对MTX-TA、FeCl3、HA、MTX-TA/Fe3+NPs和MTX-TA/Fe3+@HA NPs进行紫外光谱扫描，以蒸馏水为空白对照，其结果如图5所示。从图中可知：MTX-TA、FeCl3和HA在500-600nm处无明显吸收峰，MTX-TA/Fe3+NPs、MTX-TA/Fe3+@HA NPs在约550nm处出现TA/Fe3+配位的特征吸收峰，证明本发明的MTX-TA/Fe3+NPs通过MTX-TA和FeCl3的配位作用形成。
实验例6
稳定性检测：将MTX-TA/Fe3+@HA NPs分别置于PBS和含10％胎牛血清(FBS)的DMEM完全培养基中37℃孵育，在不同时间点测定二者的粒径，其结果如图6所示。从图中可知：MTX-TA/Fe3+@HA NPs在两种介质中粒径均无显著性变化，表明MTX-TA/Fe3+@HA NPs的稳定性良好。
实验例7
释放率检测：分别取0.2mL MTX-TA/Fe3+NPs、MTX-TA/Fe3+@HA NPs，与0.8mL释放介质(10mM PBS，pH 7.4)混合，置于恒温水浴振荡箱中振荡，分别于0、0.5、1、2、4、8、12、24h取样，20000rpm离心20min，采用高效液相色谱仪测定上清中MTX的浓度，计算MTX的累积释放率，其结果如图7所示。结果表明MTX-TA/Fe3+NPs、MTX-TA/Fe3+@HA NPs均具有一定的缓释特性；相较于MTX-TA/Fe3+NPs，MTX-TA/Fe3+@HA NPs释放速率更为缓慢，说明HA对MTX-TA/Fe3+NPs具有一定的稳定和保护作用。
实验例8
溶血性检测：分别将MTX-TA/Fe3+NPs、MTX-TA/Fe3+@HA NPs样品与2％红细胞悬液混合，生理盐水作为阴性对照，去离子水作为阳性对照，于37℃恒温水浴锅中孵育。3h后1500rpm离心15min，用酶标仪测定上清在576nm处的吸光度值，按以下公式计算溶血率：溶血率(％)＝(A样品-A阴性)/(A阳性-A阴性)×100％，其检测结果如图8所示。从图中可知，MTX-TA/Fe3+NPs和MTX-TA/Fe3+@HA NPs的溶血率均小于5％，符合注射剂用药安全的规定。
实验例9
考察MTX-TA/Fe3+@HA NPs对活化巨噬细胞的靶向作用，实验步骤如下：
(1)制备5-羧基荧光素(FAM)标记的载药配合物MTX-TA/Fe3+@FAM-HA NPs。具体步骤为：
1.1、将22.6mg FAM、23.0mgEDC·HCl、13.8mg NHS溶于30mL DMSO，室温剧烈搅拌4h后，加入4μL乙二胺(EDA)，继续搅拌24h，即得FAM-EDA反应液。将242.0mg HA、230.0mgEDC·HCl、138.1mg NHS溶于30mL DMSO，室温剧烈搅拌4h后，将上述FAM-EDA反应液加入该体系，反应24h后，将其转移至透析袋(MWCO＝3500)中，置于水中透析72h。收集透析袋内液体，冷冻干燥后即得FAM-HA。
1.2、按照实施例2中的方法得到载药配合物MTX-TA/Fe3+NPs。取4mL MTX-TA/Fe3+NPs于20mL烧杯中，在搅拌下加入4mL FAM-HA水溶液，室温搅拌4h，即得FAM标记的载药配合物MTX-TA/Fe3+@FAM-HA NPs。
(2)取对数生长的RAW264.7细胞(小鼠腹腔巨噬细胞，购自中南大学湘雅医学实验中心)，消化计数，用适量含10％FBS的DMEM完全培养基稀释为2×104个/mL的细胞悬液，每孔0.5mL接种于24孔板，总共接种3个孔。贴壁培养12h后吸弃培基，PBS润洗3次。
(3)其中2孔加入含10μg/mL LPS的完全培养基，剩余1孔加入不含LPS的完全培养基。孵育48h后吸弃培基，PBS润洗3次。
(4)在LPS活化孔的其中1孔加入含5mg/mL HA的完全培养基，其余孔加入完全培养基，孵育4h后吸弃培基，PBS润洗3次。
(5)每孔加入MTX-TA/Fe3+@FAM-HA NPs，37℃孵育4h后吸弃培养液，PBS润洗3次。
(6)每孔加入0.5mL多聚甲醛避光固定20min，吸弃上清，PBS洗涤3次。
(7)每孔加入0.5mL 2μg/mL DAPI，避光染核10min，吸弃上清，PBS洗涤3次，倒置荧光显微镜下观察各孔荧光强弱。
其检测结果如图9所示。图9为MTX-TA/Fe3+@HA NPs的细胞摄取荧光成像图。其中，MTX-TA/Fe3+@HA NPs分别与未活化和活化的巨噬细胞共孵育4h或HA预处理活化巨噬细胞4h后NPs再与细胞孵育4h，通过荧光显微镜观察。蓝色荧光为DAPI，代表细胞核，用于细胞定位；绿色荧光为FAM，代表MTX-TA/Fe3+@FAM-HA NPs；Merged为两个通道的叠加。标尺＝50μm。从图中可知：MTX-TA/Fe3+@HA NPs与未活化巨噬细胞孵育4h，荧光显微镜下可见细胞内基本无荧光，而当与活化的巨噬细胞孵育时，细胞内有明显的绿色荧光，表明纳米粒被细胞摄取。然而，经游离HA预处理4h后，其绿色荧光显著减弱。结果表明，HA修饰可增加活化巨噬细胞对载药配合物的摄取，该过程由活化巨噬细胞表面的CD44受体介导。
实验例10
考察MTX和MTX-TA/Fe3+@HA NPs对未活化/活化巨噬细胞的细胞毒性，实验步骤如下：
(1)取胰酶消化对数生长的RAW264.7细胞，用含10％FBS的DMEM培养基稀释成密度为5×104个/mL的细胞悬液，以每孔100μL接种于96孔培养板中。在二氧化碳培养箱内(37℃、5％CO2、饱和湿度)培养12h后移弃培养液。
(2)对于活化的巨噬细胞，每孔加入含10μg/mL LPS的完全培养基；未活化的巨噬细胞加入不含LPS的完全培养基。孵育48h后吸弃培基，PBS润洗3次。
(3)每孔加入100μL用培养基稀释至不同浓度的MTX或MTX-TA/Fe3+@HA NPs(浓度以MTX计，分别为0.022、0.055、0.110、0.220、0.550、1.100、2.200、4.400nM)，同一浓度做6个复孔，孵育48h后吸弃培养液，PBS润洗3次。
(4)每孔加入100μL MTT溶液(0.5mg/mL)，孵育4h后吸弃上清。
(5)每孔加入100μL DMSO，置摇床上低速振摇10min使结晶溶解完全，用酶标仪测定各孔在490nm波长处的吸光值(OD)。
其检测结果如图10和11所示，图10中，10A和10B分别为MTX、MTX-TA/Fe3+@HA NPs与未活化/活化巨噬细胞孵育48h后，用MTT法测定的细胞存活率结果。从图中可以看出，游离MTX和本发明的MTX-TA/Fe3+@HA NPs的细胞存活率均呈现剂量依赖性。图11为IC50结果。数据以均数±标准差表示；从IC50值可以看出，MTX-TA/Fe3+@HA NPs对活化巨噬细胞的细胞毒性是对未活化巨噬细胞的2倍，而游离MTX对两种巨噬细胞的毒性无差异。从毒性实验的结果可知：本发明实施例2的载药配合物可选择性的抑制活化巨噬细胞的增殖，并促进其凋亡，而对未活化的巨噬细胞毒性较小，这说明本发明的载药配合物具有一定的体外抗RA活性。
实验例11
考察MTX、MTX-TA/Fe3+NPs和MTX-TA/Fe3+@HA NPs的体内抗RA活性，具体步骤如下：
(1)CIA小鼠模型的构建：将牛Ⅱ型胶原(2mg/mL)与等体积的完全弗氏佐剂混合，充分乳化后，于小鼠尾根部皮下注射0.1mL进行初次免疫。21天后注射0.1mLⅡ型胶原和不完全弗氏佐剂的混合乳剂进行加强免疫。
(2)待关节评分达到8，将小鼠随机分为4组(n＝6)，分别尾静脉注射5％葡萄糖、MTX、MTX-TA/Fe3+NPs和MTX-TA/Fe3+@HA NPs，隔天给药，共5次。分别于第一次给药后0、2、4、6、8、10d用游标卡尺测定小鼠的足掌厚度。将正常小鼠作为对照。
(3)第一次给药后10天将小鼠处死，取其踝关节，用4％多聚甲醛固定24h后加入EDTA脱钙，然后用石蜡包埋切片，H&E染色。
(4)在踝关节中加入液氮，研磨至粉状，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取其中的总蛋白，通过BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，后通过Western Blot法检测其中TNF-α的表达水平。
其结果如图12、13和14所示。图12为分别在第0、2、4、6、8天尾静脉注射5％葡萄糖、MTX、MTX-TA/Fe3+NPs和MTX-TA/Fe3+@HA NPs后的小鼠和正常小鼠的足掌外观和厚度变化图。图12A为各组小鼠给药前后的足掌外观图；图12B为各组小鼠在给药期间的足掌厚度变化图；图12C为给药结束后各组小鼠的足掌厚度。从图中可见，MTX-TA/Fe3+@HA NPs组小鼠在给药后的足掌厚度与正常小鼠的最为接近，肿胀明显缓解。图13为各组踝关节切片的H&E染色图，标尺＝100μm。与5％葡萄糖组相比，MTX、MTX-TA/Fe3+NPs、MTX-TA/Fe3+@HA NPs组的血管翳形成、滑膜组织增生和骨侵蚀均有所缓解，但MTX-TA/Fe3+@HA NPs组最为有效，可显著改善RA关节部位的病理状态。图14为小鼠关节中TNF-α的表达情况。从图中可见，MTX-TA/Fe3+@HA NPs可显著降低小鼠关节中TNF-α的水平。
实验例12
考察MTX、MTX-TA/Fe3+NPs和MTX-TA/Fe3+@HA NPs的体内安全性，具体步骤如下：
按照实施例5的方法处理小鼠，在给药期间记录小鼠的体重变化；在给药第10天后，收集小鼠血清，用于生化指标分析；取小鼠的肝、脾、肾，用生理盐水洗涤，滤纸吸干水分，4％多聚甲醛固定24h后，将其石蜡包埋、切片、H&E染色，利用光学显微镜观察病理改变。
其结果如如15、16和17所示。图15为各组小鼠在给药期间的体重变化。从图中可见，各组小鼠的体重在给药期间无明显变化。图16为各组小鼠的血清生化指标分析结果。从图中可见，对于BUN和Cre，各组小鼠的指标值无明显差异；对于ALT和AST，MTX组小鼠的指标值明显升高，而MTX-TA/Fe3+NPs和MTX-TA/Fe3+@HA NPs组的指标值与正常小鼠无差异，证明本发明的载药配合物可有效避免MTX导致的肝毒性。图17为各组小鼠肝、脾、肾病理切片分析，标尺＝100μm。各组小鼠各器官均未见明显病理改变，表明载药配合物体内生物安全性良好。
以上所述实施例，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物，其特征在于，所述配合物中甲氨蝶呤与鞣酸通过共价偶联形成药物-有机配体键合物，所述药物-有机配体键合物与Fe3+配位形成包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物。
2.根据权利要求1所述的包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物，其特征在于，所述配合物还包括靶向配体，所述靶向配体与所述包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物通过静电作用结合形成包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸靶向配合物。
3.根据权利要求2所述的包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物，其特征在于，所述靶向配体包括透明质酸、叶酸、唾液酸。
4.一种包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：
S1：甲氨蝶呤与鞣酸发生酯化反应并纯化获得甲氨蝶呤-鞣酸键合物；
S2：将所述甲氨蝶呤-鞣酸键合物配制成溶液，并加入三价铁化合物搅拌反应获得包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物。
5.根据权利要4所述的包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：
将靶向配体配置成溶液，滴入至所述包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物中，搅拌反应获得包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸靶向配合物。
6.根据权利要求4所述的包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物的制备方法，其特征在于，所述酯化反应过程中加入催化剂，所述催化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，所述甲氨蝶呤、鞣酸和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:2:2-1:20:20。
7.根据权利要求4所述的包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物的制备方法，其特征在于，所述甲氨蝶呤-鞣酸键合物与三价铁化合物的摩尔比为2:1-1:20。
8.一种权利要求1-3任意所述的包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。
9.一种权利要求2或3所述的包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物在制备靶向活化巨噬细胞的药物中的应用。
10.一种权利要求2或3所述的包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物在构建甲氨蝶呤靶向递送系统中的应用。
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