CN105265353A

CN105265353A - 一种表面有含外套膜细胞水凝胶层的珍珠核及其制备方法

Info

Publication number: CN105265353A
Application number: CN201510443212.1A
Authority: CN
Inventors: 肖宽诚; 肖义军
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-06-07
Filing date: 2015-07-26
Publication date: 2016-01-27
Anticipated expiration: 2035-07-26
Also published as: CN105265353B

Abstract

本发明公开了一种表面覆盖有含外套膜细胞水凝胶层的珍珠核及其制备方法，属于人工养殖珍珠的生产领域。将珍珠蚌外套膜细胞酶解分离为单个游离细胞，预混在高分子水溶液中，然后使其在珍珠核表面凝胶，形成厚度基本均匀的含外套膜细胞的水凝胶，从而使外套膜细胞在珍珠核周围形成基本均匀分布，解决了传统外套膜细胞小片植入法存在的外套膜表皮细胞在珍珠核周围分布不均的问题。

Description

一种表面有含外套膜细胞水凝胶层的珍珠核及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种珍珠核及其制作方法，具体的说涉及一种表面覆盖包裹有其中含有贝类动物外套膜表皮细胞的、由生物可降解高分子材料交联形成的水凝胶层的珍珠核及其制备方法。

背景技术

目前有核珍珠的人工培养方法通常都是采用取自供体蚌的外套膜细胞小片与用贝壳制备的珍珠核一起植入育珠蚌的插核部位，然后放入养殖场所中养殖培育珍珠，养殖一段时间后杀蚌取珠。在育珠蚌体内，从外套膜细胞小片游离出来的外表皮细胞会逐渐迁移至珍珠核表面，结缔组织细胞等一些其他类型细胞则围绕在外表皮细胞周围，并与育珠蚌自身的结缔组织之间建立连接，围绕珍珠核形成珍珠囊，外表皮细胞(可能还有一些其他类型细胞)分泌珍珠质形成珍珠。这种方法由于植入时细胞小片只贴于珍珠核的一侧，在细胞迁移过程中，外套膜细胞容易在珍珠核周围分布不均，很多时候细胞小片所在位置的细胞大量堆积，已经开始分泌珍珠质，但珍珠核远离细胞小片的部位细胞尚未迁徙到，因此形成的珍珠囊厚薄不均，导致培育的珍珠形状、色泽不均匀，圆形珍珠数量少，存在尾巴珠、瑕疵珠等问题，优质珍珠生产率低。如果能使外套膜表皮细胞在珍珠核周围形成基本均匀的分布，则可形成厚薄均匀的珍珠囊，从而大大提高优质圆形珍珠的比例。

为解决这个问题，“游离细胞植入法培育有核珍珠”(中国发明专利号：200510110378.8)公布了一种通过将游离外套膜细胞与珍珠核共培养，使得外套膜细胞粘附在珍珠核的表面，然后将粘附了外套膜细胞的珍珠核插入育珠蚌的插核部位来培养珍珠的方法。此方法存在以下问题：⑴正常表皮细胞在人工培养的条件下只能贴壁生长成单层，细胞量过少，细胞种类单一。因此该发明通过在插核前后再另外滴入大量细胞液来解决细胞量不足和细胞种类单一的问题。⑵能贴附于珍珠核表面生长的细胞只有表皮上皮细胞，但珍珠囊的形成也需要来自外套膜的结缔组织细胞。⑶球形珍珠核容易滚动，容易因碰撞等导致细胞损伤脱落，在运输、植核等过程中难以保证不损伤细胞等问题。因而至今未能在生产实践上得到应用。

用胶原蛋白、海藻酸钠、明胶等高分子材料制备的水凝胶支架因含水量高、氧气、营养物质及代谢废物容易运输、液固方便转换、生物相容性好、可降解、制作工艺简单以及易于交联可溶性生长因子等优点而广泛应用于人体组织工程中。本发明利用高分子材料水凝胶的这些性质，将珍珠蚌游离外套膜细胞预混在生物可降解高分子材料的水溶液中，然后使高分子材料在珍珠核表面交联，形成厚度基本均匀的含外套膜细胞的水凝胶层，从而使得外套膜细胞在珍珠核周围形成基本均匀分布，植入到育珠蚌体内后，凝胶支架材料会逐渐降解，外套膜表皮细胞会逐渐迁移到珍珠核表面形成厚度基本均匀的珍珠囊，从而在珍珠核表面均匀分泌珍珠质。本发明解决了传统外套膜细胞小片植入法存在的外套膜表皮细胞在珍珠核周围分布不均的问题，可以大大提高优质珍珠的比例。

发明内容

本发明的目的是提供一种人工养殖珍珠所使用的珍珠核的处理方法，通过在珍珠核周围包裹一层厚度基本均匀的含珍珠蚌外套膜细胞的水凝胶层，使珍珠蚌的外套膜表皮细胞能基本均匀地分布到珍珠核的周围形成珍珠囊，从而提高优质珍珠的生产效率。

为实现上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：

一、本项目的技术线路：获取外套膜游离细胞→配制高分子材料水凝胶溶液→将外套膜表皮细胞与高分子材料水凝胶溶液混合均匀→将珍珠核放置于模具中，然后将混合液灌注入模具中，使混合液基本均匀分布在珍珠核周围，使高分子材料交联形成含有外套膜表皮细胞的水凝胶层。此即为本发明所说的含有外套膜细胞的水凝胶珍珠核。此外，也可以将珍珠核先与外套膜外表皮细胞共同培养，使珍珠核表面先贴附上单层外套膜外表皮细胞，然后再按上述技术路线将其表面覆盖上含外套膜细胞的水凝胶层。

二、模具的制作：模具的作用在于使水凝胶层厚度基本均匀，从而使外套膜细胞能在珍珠核周围形成较为均匀的分布，可以采取以下2种方法。

1.方法一：采用二次成型的方法。模具由模具Ⅰ和模具Ⅱ组成，模具Ⅰ由两个结构一样的中空半球构成，使用时将2个半球合拢即成为一个完整的中空球体；以球体的注胶孔所处位置为南极，其对侧为北极，每个半球的内侧面有3条南北极方向排列的条状突起(以下简称棱)，其中的2条棱分别位于半球的两侧边缘，另一条棱位于半球中间，优选的是位于半球的正中间位置，3条棱的末端在球的南北极处相交，在南极端相交处的棱切除部分形成凹口作为注胶孔；棱宽度不限，优选的是中间棱宽2～3mm左右，棱高度在0.02～2mm之间，优选的是0.8～1.2mm左右，边缘棱宽度为中间棱的一半；棱的作用在于支撑珍珠核，使将珍珠核放入模具后珍珠核外的空间高度(即将来水凝胶支架厚度)一致，其高度就是水凝胶层的厚度；使用时，先将珍珠核放入一个半球中，然后将另一半球合拢，两个半球合拢成一个球体，棱的一端球面是封闭的，另一端(即切除了部分棱的南极端)球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注水凝胶溶液，此端对接处的棱被切除了部分，留出孔道使高分子材料水凝胶溶液能同时灌注到模具中被棱隔开的4个空间中。模具Ⅰ用于完成珍珠核水凝胶层制备的第一步，得到表面有4道凹槽的水凝胶层珍珠核。模具Ⅱ由两个中空的半球组成，其内侧表面无突起，半球的内径长度为模具Ⅰ棱高度的2倍与珍珠核直径之和，两半球合拢后一端留有一个注胶孔用于灌注高分子材料水凝胶溶液，模具Ⅱ用来完成珍珠核外水凝胶层凹槽的填补，最后得到凝胶层厚度基本一致的球形水凝胶珍珠核。

2.方法二：采用一次成型的方法。模具由两个中空的半球构成，每个半球的内侧面有3根与半球平面垂直的细柱，彼此相隔120°，细柱的作用在于支撑珍珠核，目的在于使珍珠核周围的空间高度一样，从而使水凝胶层厚度均匀，与半球的平面垂直是便于凝胶以后脱模时不损伤水凝胶。细柱的长度在0.02～2mm左右，优选的是0.8～1.2mm。两半球合拢后一端球面留有一小孔用于灌注水凝胶溶液。当灌入的高分子材料和细胞凝结成凝胶后脱模。凝胶中会留下支撑柱造成的小孔，但由于凝胶在蚌体内会逐渐降解，细胞也会自动迁移粘附到珍珠核表面，这些小孔不会影响将来植核后外套膜表皮细胞在珍珠核周围的均匀分布。

三、外套膜表皮游离细胞的获取方法：清洗蚌壳，撕取珍珠蚌的外套膜组织，切除边缘色线部分，洗涤消毒后剪成约1mm²小块，采用酶消化法消化组织块，通常采用0.25wt％的胰酶，在25～37℃范围内消化0.5～4小时，用200目绢网过滤去除残留的组织块，1000r/分钟离心分离出细胞，加入培养液吹散细胞沉淀，使细胞悬液密度在1×10⁵～5×10⁷个细胞/mL之间，得到珍珠贝的外套膜组织游离细胞悬液，放置于冰浴状态下。由于珍珠质是由外套膜外表皮细胞分泌形成的，外套膜内表皮细胞不参与珍珠囊的形成，因此也可以在洗涤消毒后先刮去外套膜的内表皮，再酶解消化组织块，得到主要由外表皮细胞和结缔组织细胞组成的游离细胞悬液。得到的细胞悬液可进一步在体外培养增殖后使用；也可进一步在细胞中导入外源基因如SV40病毒、EB病毒、端粒酶基因等使外表皮细胞成为永生化细胞，经体外培养扩增后使用，以节约提供外套膜的珍珠贝资源。

四、采用的水凝胶高分子材料：可以作为本发明使用的高分子水凝胶的材料有天然的生物可降解高分子材料和人工合成的生物可降解高分子材料，天然可降解高分子材料可选择胶原蛋白、海藻酸钠、明胶、琼脂糖、壳聚糖和透明质酸等以及它们之间及它们与其他材料形成的复合物，人工合成生物可降解高分子材料可选择聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚乙烯醇(PVA)等以及它们之间及它们与其他材料形成的复合物。其中优选的是胶原蛋白。胶原蛋白是普遍存在于动物结缔组织中的一类纤维蛋白，有多种不同类型，常见的是Ⅰ型，为酸溶性胶原蛋白。胶原蛋白具有良好的生物相容性、极低的免疫原性、良好的生物可降解性和一定的机械强度，在人类组织工程中是一种良好的组织支架材料。目前商品化的胶原蛋白有各种来源，例如自各种陆生动物如鼠、牛、猪、羊、鸡等，或者水生脊椎动物草鱼等及无脊椎动物鱿鱼、海参等，大多用作保健品，少量用于组织支架工程研究。我们以目前最主要的淡水珍珠育珠贝——三角帆蚌进行试验，鼠源Ⅰ型胶原蛋白、牛肌腱胶原蛋白、鱼鳞胶原蛋白以及自三角帆蚌组织提取的胶原蛋白在三角帆蚌体内都可以很好地降解。

五、制备含外套膜表皮细胞高分子水凝胶的方法：将生物可降解高分子材料溶解于细胞培养液或PBS中配成合适的浓度，将外套膜细胞在其中混匀，使高分子材料在外套膜细胞可以生存的温度、pH范围内成胶。以本发明优选的高分子材料胶原蛋白为例，其基本方法为：将胶原蛋白溶于酸溶液中，然后与预冷至4℃左右的细胞培养液或PBS混匀，调节pH至7.0左右，再加入预冷的外套膜细胞悬液混匀，立即灌注入模具中，放置于20～37℃条件下30～60分钟左右即可成胶。胶原蛋白成胶终浓度一般配成终浓度1～2mg/mL。为使外套膜细胞更好生长，配制水凝胶时可加入一些蚌血清或细胞生长因子或牛血清。不同高分子材料成胶的方法不同，可通过改变溶液的pH值、盐浓度、温度及加入交联剂等方式来实现，这些技术是高分子材料研究领域人员熟知的技术，通过简单的试验即可实现等同替代。

六、将含水凝胶层的珍珠核脱模，无菌包装，4～10℃可保存7～10天，37℃可保存1～2天，以尽快使用为佳。

本发明的有益效果：

采用本发明的方法，解决了传统外套膜细胞小片植入法存在的因表皮细胞在珍珠核周围分布不均匀，导致异形珠大量产生的问题，采用本方法珍珠表面珍珠质均匀，基本都是正圆形优质珍珠。也使得珍珠核与育珠蚌的相容性提高，极少出现吐核。可以大大提高养殖的经济效益。直接将细胞混合在支架中，也方便了珍珠养殖场的使用。此外通过提取蚌肉中的胶原蛋白来作为高分子凝胶原料，也使传统珍珠生产中取珠后废弃的蚌肉有了新的用途，提高了珍珠养殖场的经济效益。

附图说明

图1是本发明实施例1所述的模具Ⅰ一个半球的结构图。

图2是模具Ⅰ半球的横切面图(与注胶孔所在位置垂直的面)，中间的虚线圆表示以后将放入的珍珠核。

图3是模具Ⅰ两半球合拢后的俯视图(示注胶孔)。

图4是制备好的水凝胶珍珠核的切面图。

图5是本发明实施例2所述模具半球结构图。

图6是实施例2所述模具半球内部结构的俯视图。

图7是实施例1中用模具Ⅰ制备的有4个凹槽的水凝胶珍珠核的横切面图。

具体实施方式

以下实施例结合附图用对本发明的技术方案做进一步说明，但并不因此而限定本发明的保护范围。

实施例1

1.将打磨好的普通珍珠核高压灭菌处理，放入0.01wt％的多聚赖氨酸溶液中浸泡30分钟，取出，无菌条件下晾干。

2.制备珍珠核水凝胶层模具：采用二次成型法。模具Ⅰ由两个结构一样的中空半球构成，使用时将2个半球合拢即成为一个完整的球体。每个半球的内侧面有3条南北极(以注胶孔所处位置为南极，其对侧为北极)方向排列的条状突起(以下简称棱)，其中2条棱分别位于半球两侧边缘(以下称边缘棱3)，另一条棱位于半球的正中间(以下称中间棱2)(图1，图2)，棱的长度为球体周长的1/2，因此3条棱的末端在球的南北极处相交，南极端相交处的棱切除部分形成凹口作为注胶孔；中间棱2的宽度3mm左右，高度1mm左右，边缘棱3宽度为中间棱的一半。模具Ⅱ由两个中空的半球组成，其内侧表面无突起，半球内径为2倍棱高度与珍珠核直径之和，两半球合拢后一端球面处留有一注胶孔1用于灌注水凝胶溶液(图3)。使用时，模具Ⅰ用于完成珍珠核水凝胶层制备的第一步，得到有4道凹槽9的含水凝胶层10的珍珠核(图7)；模具Ⅱ用于完成凹槽的填补，将用模具Ⅰ制备的有凹槽的水凝胶珍珠核放入模具Ⅱ，注入胶液，使凹槽被胶液填满，凝固后得到厚度基本均匀的球形水凝胶珍珠核。

3.获取游离外套膜细胞：清洗蚌壳，割断闭壳肌，取外套膜组织，去除或不去除内表皮，先用PBS缓冲溶液清洗3遍，将组织置于含4000～5000U/mL抗生素(青霉素+链霉素)的PBS缓冲溶液中浸泡10分钟，再PBS缓冲溶液(5分钟)→70vol％酒精溶液中迅速拉过→PBS缓冲溶液(10分钟)，放入培养皿，将组织剪碎成约1mm²小片，加入含EDTA的0.25wt％胰蛋白酶消化30分钟，然后加入含10vol％胎牛血清的RPM1640培养液，终止酶消化反应，用200目绢网过滤去除残留的组织块，1000r/分钟离心5分钟，弃上清，加入含10vol％胎牛血清的RPM1640培养液吹散沉淀，使细胞悬液密度在5×10⁷个细胞/mL左右，得到珍珠贝的外套膜组织游离细胞。置冰浴下备用。

4.珍珠核水凝胶层的制备：将鼠源I型胶原蛋白溶解于0.1M的乙酸溶液中，配成4.0mg/mL的浓度，将4体积鼠源I型胶原蛋白溶液与1体积5×RPM1640培养液在4℃下混合，用0.1M的NaOH调节pH至7.2左右，加入约5体积的冰浴预冷的细胞悬液，混匀，将珍珠核8置入模具Ⅰ中(图2)，具体方法为，先将珍珠核放入一个半球中，然后将另一半球合拢，两个半球合拢成一个球体，一端的球面是封闭的，另一端球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注水凝胶溶液，此端的棱略短，留出孔道使凝胶溶液能同时灌注到模具中被棱隔开的4个空间中。待胶液处于半凝固状态时迅速将细胞凝胶预混液灌注入模具Ⅰ中，室温或37℃放置30分钟左右即可完成凝胶过程。打开模具取出珍珠核，得到有4道凹槽的含水凝胶层珍珠核；再将其注胶孔处的凝胶挖去少量，形成一个连通4道凹槽的凹口，放置入模具Ⅱ中，使凹口处对准注胶孔，再灌注细胞凝胶预混液，室温或37℃放置30分钟左右使凹槽中的胶液凝胶，这样就在珍珠核5周围形成了均匀分布有外套膜细胞的水凝胶层4(图4)。将水凝胶珍珠核脱模，无菌包装，低温下(4～10℃)储存，迅速运至养殖场进行植核。

实施例2

1.将打磨好的珍珠核高压灭菌处理，放入0.01wt％的多聚赖氨酸溶液中振荡浸泡30分钟，取出，无菌条件下晾干。

2.制备珍珠核水凝胶层层模具：采用一次成型法。模具由两个半球构成(图5，图6)，每个半球的内侧面有3根与半球的平面垂直的细柱7，处于彼此相隔120°的位置，细柱的作用在于支撑珍珠核，目的在于使珍珠核周围的空间高度一样，从而使水凝胶层厚度均匀，与半球的平面垂直是便于脱模时不损伤水凝胶层。细柱的长度在1.2mm左右，两半球合拢后球面留有一小孔6用于灌注水凝胶溶液。当灌入的水凝胶细胞混悬液交联凝结成凝胶后脱模。由于移植到育珠蚌体内后，凝胶中的高分子材料在蚌体内会逐渐降解，细胞也会自动迁移，凝胶中支撑柱留下的小孔不会影响将来植核后外套膜表皮细胞在珍珠核周围的均匀分布。

3.游离外套膜细胞的获取：同实施例1。

4.珍珠核水凝胶层的制备：细胞凝胶混悬液的制备方法同实施例1。先将珍珠核放入一个半球中，然后将另一半球合拢，将预冷的细胞凝胶混悬液从注胶孔灌注入模具中，室温或37℃放置30分钟左右使胶液凝结，打开模具取出珍珠核，无菌包装，低温下(4～10℃)储存，迅速运至养殖场进行植核。

实施例3：以贝类动物的胶原蛋白作为高分子水凝胶原料。

1.制备三角帆蚌胶原蛋白：

⑴将取珠后的三角帆蚌去除内脏团，洗净，吸干水分，剪成小块，冻干；

⑵取冻干燥后的蚌肉加入0.1M的NaOH，比值为1:30(w/v)，用组织捣碎机捣碎，在4℃下捣碎搅拌24小时；

⑶将经NaOH处理后的蚌组织4℃下冷冻离心(12000r/分钟，30分钟)，取沉淀，用超纯水充分洗涤，直到上清液呈中性或微碱性，离心取沉淀；

⑷沉淀用10vol％的正丁醇浸泡24小时，体积比为1:30(v/v)；

⑸将正丁醇处理后的蚌组织4℃冷冻离心，取沉淀，冻干；

⑹用去离子水充分洗涤材料，然后浸泡在0.5M的醋酸溶液中，加入胃蛋白酶，4～8℃，24小时，不定时搅拌，使胶原蛋白充分溶解到醋酸溶液中；

⑺然后冷冻离心(12000g/分钟，4℃，20分钟)，取上清，向上清液中加入4M的NaCl溶液，至上清液中NaCl的最终浓度为0.9M，使胶原蛋白沉淀释出；

⑻冷冻离心取沉淀，将沉淀溶于0.5M的醋酸溶液中，在0.1M的醋酸溶液中透析24小时，蒸馏水中透析72小时即得三角帆蚌胶原蛋白；

2.三角帆蚌胶原蛋白4℃条件下在pH4时溶解度最高，因此溶解时用0.5M的醋酸，用盐酸调节pH值至4。其他同实施例1。

实施例4：以海藻酸钠作为高分子水凝胶原料。

1.外套膜细胞海藻酸钠水凝胶的制备方法：采用高G型(粘度800cps)海藻酸钠作为水凝胶的主要凝胶原料，碳酸钙作为胶凝剂，葡萄糖酸-δ-内酯控制钙离子的释放。将海藻酸钠、碳酸钙和葡萄糖酸-δ-内酯溶于RPM1640细胞培养液中，混合均匀，再加入前期准备好的外套膜细胞悬液混匀，室温放置，待胶液处于半凝固状态时迅速将细胞凝胶预混液灌注入模具中，恒温37℃使其迅速凝胶。胶液中各成分终浓度控制为每100mL胶液中海藻酸钠3克，碳酸钙0.75克，葡萄糖酸-δ-内酯1.65克。其他方法同实施例1或2。

实施例5

2.分离外套膜外表皮细胞：撕取珍珠蚌的外套膜，刮去内表皮层，留下的外表皮用胰蛋白酶处理将细胞消化成单个游离细胞，方法见实施例1。

3.在培养皿中铺一层厚度比珍珠核直径高2毫米左右的2wt％浓度的琼脂，待琼脂呈半凝固状态时将珍珠核放于琼脂上，轻压使珍珠核陷入到琼脂中，使琼脂表面没过珍珠核，用镊子夹住珍珠核左右略微晃动，使凹孔直径略大于珍珠核，此凹孔用于放置珍珠核。琼脂凝固后用镊子夹出珍珠核，在凹孔处滴入少量细胞悬液，再将珍珠核放入凹孔，然后再往珍珠核表面滴加细胞悬液，尽量使细胞均匀分布于珍珠核表面，使液面盖过珍珠核，2～4小时后细胞基本贴壁在珍珠核表面后，在培养皿中添加培养液，液面浸没琼脂表面，置于26℃条件下培养3～5天，使珍珠核表面粘附上单层外套膜外表皮细胞。

4.珍珍珠核水凝胶层的制备：同实施例1，细胞悬液中的细胞密度调整为5×10⁵个/mL左右。

实施例6

采用实施例1制备的珍珠核，植入育珠蚌的内脏团植核位点，每蚌植核1粒，共100个育珠蚌，养殖2年后采株，3例死亡，无一例发生吐核，5例裸珠，成珠的92粒珍珠全部为圆形或近圆形珍珠，对照组采用传统的细胞小片植入法，100例死亡8例，13例发生吐核，圆形及近圆形珠仅有26粒。

Claims

1.一种珍珠核，其特征在于，在珍珠核的表面包覆有一个用生物可降解高分子材料制备的水凝胶层，水凝胶中含有贝类动物的外套膜表皮细胞。

2.根据权利要求1所述的珍珠核，其特征在于，所述的水凝胶是指由溶解于水溶液中的生物可降解高分子材料交联成的凝胶。

3.根据权利要求1所述的珍珠核，其特征在于，所述珍珠核为由贝壳制成的珍珠核、由珍珠制成的珍珠核或人工合成的珍珠核，所述生物可降解高分子材料，包括生物可降解天然高分子材料及其与其他成分形成的复合物和生物可降解的合成高分子材料及其与其他成分形成的复合物。

4.根据权利要求3所述的珍珠核，其特征在于，所述的生物可降解天然高分子材料，包括胶原蛋白、明胶、海藻酸钠、纤维蛋白、琼脂糖、壳聚糖、透明质酸以及它们之间或它们与其他材料形成的复合物。

5.根据权利要求3所述的所述的珍珠核，其特征在于，所述生物可降解的合成高分子材料，包括聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)和聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚乙烯醇(PVA)以及它们之间或它们与其他材料形成的复合物。

6.根据权利要求1所述的珍珠核，其特征在于，所述的贝类动物外套膜表皮细胞，是指能分泌珍珠质的贝类动物的外套膜外表皮细胞。

7.根据权利要求1所述的一种表面包覆有含有贝类动物外套膜表皮细胞的水凝胶层的珍珠核，其制备方法是：

⑴将外套膜细胞分散成游离存在的单个细胞；

⑵配制高分子材料的水溶液；

⑶将外套膜游离细胞与高分子材料水溶液混匀；

⑷将普通珍珠核放入模具中，然后将上述含外套膜细胞的高分子材料水溶液注入模具，使高分子材料水溶液包覆在珍珠核表面；

⑸根据不同高分子材料的特性，通过采用改变温度、pH值或盐度等方法使高分子材料交联成凝胶状，在珍珠核外形成包含有外套膜细胞的水凝胶层；

⑹将珍珠核脱模，然后无菌条件下储存于在4～37℃。

8.根据权利要求7所述的一种表面包覆有含有贝类动物外套膜表皮细胞的水凝胶层的珍珠核的制备方法，其特征在于，所述的模具由模具Ⅰ和模具Ⅱ组成，模具Ⅰ由两个结构一样的中空半球构成，使用时将2个半球合拢即成为一个完整的球体；以球体的注胶孔所处位置为南极，其对侧为北极，每个半球的内侧面有3条南北极方向排列的条状突起的棱，其中的2条棱分别位于半球的两侧边缘，另一条棱位于半球中间，3条棱的末端在球的南北极处相交，在南极端相交处的棱切除部分形成凹口作为注胶孔；棱的作用在于支撑珍珠核，将珍珠核放入模具后珍珠核外的空间的高度就是水凝胶的厚度；两个半球合拢成一个球体后，棱一端的球面是封闭的，另一端球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注水凝胶溶液，此端对接处的棱切除部分，留出孔道使高分子材料水凝胶溶液液能同时灌注到模具中被棱隔开的4个空间中；模具Ⅰ用于完成珍珠核水凝胶层制备的第一步，得到表面有凹槽的水凝胶层珍珠核；模具Ⅱ由两个中空的半球组成，其内侧表面无突起，半球内径为模具Ⅰ棱高度的2倍与珍珠核直径之和，两半球合拢后留有一注胶孔用于灌注高分子材料水凝胶溶液，利用模具Ⅱ完成凹槽的填补，最后得到凝胶层厚度基本一致的球形水凝胶珠核。

9.根据权利要求7所述的模具，其特征在于，模具由两个中空的半球构成，每个半球的内侧面有3根与半球的平面垂直的细柱，处于彼此相隔120°的位置，细柱的作用在于支撑珠核，目的在于使珍珠核周围的空间高度一样，从而使水凝胶厚度均匀，与半球的平面垂直可使脱模取出珍珠核时不损伤水凝胶层，细柱的长度在0.02～2mm左右，两半球合拢后球面留有一小孔用于灌注高分子材料水凝胶溶液。