CN105309347B - 一种表面包裹高分子组织工程支架材料的珍珠核及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种表面包裹高分子组织工程支架材料的珍珠核及其制备方法，所述包裹高分子组织工程支架材料的珍珠核，包括珍珠核，其特点为在珍珠核表面覆盖有由生物可降解高分子材料组成的组织工程支架。在珍珠核外表面制造一个厚度基本均匀的适合细胞贴附、迁移、分裂生长的细胞外基质环境，接种外套膜细胞后，外套膜细胞能在珠核周围形成一个厚度基本均匀的珍珠囊，解决了传统外套膜细胞小片植入法存在的细胞在珠核周围迁移后分布不均匀导致异形珍珠的问题，可以大大提高了圆形优质珍珠的比例，也使得珍珠核与育珠蚌的相容性更好，不易吐核，从而提高珍珠养殖的经济效益。

Description

一种表面包裹高分子组织工程支架材料的珍珠核及其制备 方法

技术领域

本发明涉及一种珍珠核及其制作方法，具体的说涉及一种表面包裹有生物可降解高分子组织工程支架材料的珍珠核及其制备方法。

背景技术

组织工程支架是人工合成的具有多孔三维结构的框架，它模拟机体组织中细胞外基质的作用，使细胞能在这种三维结构上粘附、迁移、增殖，最终使组织得以重建。制备组织工程支架常用的材料有生物活性陶瓷、可降解高分子材料等。可降解的高分子材料又可分为天然高分子材料和人工合成高分子材料（参考文献1）。

目前有核珍珠的人工培养方法通常都是切取供体蚌的外套膜细胞小片与用贝壳制备的珍珠核一起植入育珠蚌的插核部位，然后放入养殖场所中养殖。在珍珠蚌体内，从外套膜细胞小片游离出来的外表皮细胞会逐渐迁移至珍珠核表面，结缔组织细胞等一些其他类型细胞则围绕在外表皮细胞周围，并与育珠蚌自身的结缔组织之间建立连接，围绕珍珠核形成珍珠囊，外表皮细胞（可能还有分泌细胞等其他细胞）分泌珍珠质形成珍珠。这种方法由于开始时细胞小片只贴于珍珠核的一侧，在细胞迁移过程中，外套膜细胞容易在珍珠核周围分布不均，很多时候细胞小片所在位置的细胞大量堆积，已经开始珍珠质，但珍珠核远离细胞小片的部位细胞尚未迁徙到，导致培育的珍珠形状、色泽不均匀，圆形珍珠数量少，大量存在尾巴珠、瑕疵珠等问题，优质珍珠生产率低。我国是珍珠养殖大国，珍珠产量占全世界95%，但价值只占8%不到，原因就是我国生产的高质量珍珠少，一、二、三等珠仅占20％左右，其中一等珠不足3％。

为解决这个问题，对比文献1“一种基于珍珠贝外套膜细胞培养生产珍珠的方法”（发明专利号：201310280635.7）公布了一种培养外套膜细胞后直接注入育珠蚌外套膜结缔组织部位培养珍珠的方法。但贝类生物的细胞体外大量和长期培养目前在技术上还存在很大困难（参考文献2，3），该技术描述的在体外培养细胞传代45代技术上目前很难实现。体外培养条件下通常细胞会随着分裂次数的增加而逐渐衰老直至凋亡。目前技术水平下，贝类生物的体细胞在体外培养条件下一般生存期不会超过30天左右。对比文献2“游离细胞植入法培育有核珍珠” （发明专利号：：200510110378.8）公布了一种通过将游离外套膜细胞与珍珠核共培养，使得外套膜细胞粘附在珍珠核的表面，然后将粘附了外套膜细胞的珍珠核插入育珠蚌的插核部位来培养珍珠。此方法存在以下4方面问题：⑴正常上皮细胞在人工培养的条件下只能贴壁生长成单层，细胞量过少。因此该发明通过在插核前后再另外滴入大量细胞液来解决细胞量不足和细胞种类单一的问题。⑵能贴附于珍珠核表面生长的细胞只有表皮上皮细胞，但珍珠囊的形成也需要来自外套膜的结缔组织细胞（参考文献4）。⑶该方法还存在细胞无法贴附到珍珠核与培养皿的接触面，因此珍珠核表面存在无细胞区域的问题。⑷球形珍珠核容易滚动，易于与其他珍珠核碰撞导致细胞损伤脱落（参考文献4），操作极不方便，特别是难以保证从实验室运至养殖场的过程中细胞不受损等问题。

参考文献

1.何进，郭云珠，曹慧玲，等。组织工程支架研究进展[ J]。材料导报，2012,26（2）73~79

2.刘万磊．水生无脊椎动物细胞培养［J］。 细胞生物学杂志，2006，28( 2) :173－178．

3.李倩，施志仪，李文娟. 三角帆蚌外套膜细胞体外培养优化及体内植入培养对细胞生长的影响［J］. 中国水产科学，2014，21(2): 225－234.

4.钱伟平，许梓荣，张明霞，等。注射法培育三角帆蚌有核珍珠的研究[ J]。浙江农业学报，2002，14(2):82～86。

发明内容

本发明的目的是提供一种表面包裹有生物可降解高分子聚合物构成的组织工程多孔支架的珍珠核及其制备方法，通过在珍珠核的表面包裹一层可降解组织工程多孔支架，在珍珠核表面造成一个可以容纳外套膜细胞在其中生长的三维网络空间。其能将游离的外套膜细胞接种到组织支架中后，外套膜细胞会沿着多孔的支架纤维表面贴壁生长、增殖和迁移，在珍珠核周围的支架中形成比较均匀的分布，可降解的高分子支架纤维在育珠蚌体内会逐渐降解，动物的表皮细胞都有贴壁生长形成单层细胞的性质，因此支架中的外表皮细胞会自发迁移至珍珠核表面形成单层细胞，结缔组织细胞会自发贴附于表皮细胞的外侧，与育珠蚌的结缔组织建立连接，这样就在珍珠核周围形成均匀的珍珠囊，分泌珍珠质，从而使得珍珠核周围新分泌形成的珍珠层厚度一致，达到生产圆形优质珍珠的目的。一般来说珍珠核外的组织支架层厚度应该大致均匀，珍珠核外厚度均匀的组织支架层对于形成均匀的珍珠囊是有利的，但由于活细胞在迁移时存在一定的自我调节能力，因此组织支架层并非一定需要厚度均匀才能达到使珍珠囊均匀的目的。本发明克服了传统珍珠生产采用的细胞小片植入法存在的外套膜细胞在珍珠核周围分布难以控制，导致培育的珍珠形状、色泽不均匀的问题，也克服了对比文献2存在的珍珠核周围细胞单层、单一，不能形成有效珍珠囊，操作不便的问题。

为了实现上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：本发明所述的一种表面包裹高分子组织工程支架材料的珍珠核，包括珍珠核，其特征在于，在珍珠核表面覆盖有由生物可降解高分子材料组成的组织工程支架。

所述珍珠核为由贝壳制成的珍珠核、由珍珠制成的珍珠核或人工合成的珍珠核，所述生物可降解高分子材料，包括生物可降解天然高分子材料及其与其他成分形成的复合物和生物可降解的合成高分子材料及其与其他成分形成的复合物。

所述的生物可降解天然高分子材料，包括胶原蛋白、明胶、海藻酸钠、纤维蛋白、琼脂糖、壳聚糖、透明质酸或它们与其他材料组成的复合物。

所述生物可降解的合成高分子材料，包括聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA)和聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA)、聚己内酯( PCL)、聚乙烯醇( PVA)或它们与其他材料组成的复合物。

本发明的表面包裹高分子组织工程支架材料的珍珠核的制备方法，包括以下步骤：

（1）将珍珠核表面处理成适合组织工程支架材料粘附的状态；

（2）配制组织工程支架液：组织工程支架材料采用生物可降解天然高分子材料或生物可降解的合成高分子材料，将组织工程支架材料溶于相应溶剂中，配成合适浓度的组织工程支架液，当需要加交联剂时添加入适量交联剂，混匀；

（3）在步骤（1）制得的珍珠核表面覆盖厚度为0.02~2mm的由步骤（2）制得的生物可降解高分子材料的组织工程支架液。

本发明还包括制备珍珠核支架层所用的模具：所述模具由下述的两种方法中的任一方法制备而成，1）其一制备方法为：模具由两个中空的半球构成，每个半球的内侧面有3根与半球平面垂直的细柱，彼此相隔120°，细柱的作用在于支撑珍珠核，目的在于使珍珠核周围的空间高度一样，从而使组织工程支架厚度均匀，与半球的平面垂直是便于制备好支架以后的脱模，细柱的长度在0.02~2mm，两半球合拢后一端球面留有一小孔用于灌注组织工程支架液；2）另一种制备方法是：模具有2种，模具Ⅰ由两个结构一样的中空半球构成，每个半球的内侧面有3条突起的棱，其中2条棱分别位于半球两侧边缘，另一条棱位于半球的中间，棱的长度为球体周长的1/2，3条棱的末端相应在球的南北极端相交，南极端相交处的棱切除部分形成凹口作为注胶孔，棱的高度为0.02~2mm，边缘棱宽度为中间棱的一半；棱的作用在于支撑珍珠核，使将珍珠核放入模具后珍珠核与半球内面之间的高度一致，棱的高度就是要填充的组织工程支架的厚度；使用时，先将珍珠核放入一个半球中，然后将另一半球合拢，两个半球的边缘棱在两半球合拢后其侧面拼接在一起合为一条宽度与中间棱宽度一样的棱，两个半球合拢成一个球体，棱一端的球面是封闭的，另一端的球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注组织工程支架液，此端对接处的棱切除部分，留出孔道使组织工程支架液能从此孔道同时灌注到模具中被棱隔开的4个空间中；模具Ⅰ用于完成珍珠核组织支架制备的第一步，得到有凹槽的组织支架珍珠核；模具Ⅱ由两个中空的半球组成，其内侧表面无突起，半球内径为珍珠核直径和模具Ⅰ棱高度的2倍之和，两半球合拢后留有一注胶孔用于灌注组织工程支架液，利用模具Ⅱ完成凹槽的填补，得到组织工程支架层厚度相同的球形组织工程支架珍珠核；

支架制备：先将步骤⑴处理过的珍珠核放置于模具Ⅰ中，将步骤（2）制备的组织工程支架液灌注入模具Ⅰ，振荡摇匀10~30分钟，室温下静置1~24小时使组织工程支架液交联，在珍珠核表面形成一个有凹槽的凝胶层，降温至4~10℃放置10~30分钟；然后打开模具取出珍珠核，再放置入模具Ⅱ中，使上述制得的球形组织工程支架珍珠核的凹口处对准注胶孔，再注入步骤（2）制备的组织工程支架液，以使第一次注胶时留下的凹槽填满组织工程支架液，室温下静置1~24小时使组织工程支架液交联；取出，将注胶孔处的表面磨平，在冻结温度下冷冻成型，然后放入冷冻干燥机中真空干燥；

当支架制备过程中有加入对细胞有毒的成分时，则需将有毒成分从支架中洗去；

将珍珠核无菌保存备用。

本发明所述的制备方法，具体如下：

（1）在珍珠核表面粘附一层多聚赖氨酸膜：将打磨好的普通珍珠核高压灭菌处理，放入0.01wt%~0.1wt%的多聚赖氨酸溶液中浸泡10~30分钟，取出，无菌条件下晾干；

（2）无菌条件下配制组织工程支架液：无菌条件下将胶原蛋白配制成浓度为1.0%~3.0 wt %的溶液，待胶原蛋白完全溶解后向其中加2.5vol%的戊二醛溶液作为交联剂，使戊二醛终浓度为0.01vol%~0.05vol%，搅拌均匀；

（3）支架制备：将晾干好的珍珠核放置于模具Ⅰ中，具体方法为，先将珍珠核放入一个半球中，然后将另一半球合拢，将步骤⑵制备的组织工程支架液灌注入模具，振荡摇匀10分钟，室温下静置6~24小时使组织工程支架液交联，降温至4~10℃处理10~30分钟使珍珠核脱模，然后打开模具取出珍珠核，得到有4道凹槽的组织工程支架珍珠核；再将其注胶孔处的支架材料挖去少量，形成一个连通4道凹槽的凹口，放置入模具Ⅱ中，使凹口处对准注胶孔，再注入步骤⑵制备的组织工程支架液，使第一次注胶时留下的凹槽填满组织工程支架液，室温下静置2~12小时使组织工程支架液交联；取出，将注胶孔处的表面打磨平，在-20℃条件下放置1~6小时冷冻成型，然后放入冷冻干燥机中真空干燥1~24小时，真空度为12~20 Pa，冻干温度为-20~-70℃；

（4）将珍珠核浸泡于蒸馏水中洗去残留的戊二醛，然后真空干燥将珍珠核去除水分后无菌包装备用。

所述制备珍珠核支架层所用的模具：模具Ⅰ由两个结构一样的中空半球构成，使用时将2个半球合拢即成为一个完整的球体；以球体的注胶孔所处位置为南极，其对侧为北极，每个半球的内侧面有3条南北极方向排列的条状突起的棱，其中的2条棱分别位于半球的两侧边缘，另一条棱位于半球中间， 3条棱的末端在球的南北极处相交，在南极端相交处的棱切除部分形成凹口作为注胶孔；棱的作用在于支撑珍珠核，使珍珠核放入模具后珍珠核外的空间的高度就是组织工程支架的厚度；两个半球合拢成一个球体，棱一端的球面是封闭的，另一端的球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注组织工程支架液；模具Ⅰ用于完成珍珠核组织支架制备的第一步，得到表面有凹槽的组织工程支架珍珠核；模具Ⅱ由两个中空的半球组成，其内侧表面无突起，半球内径为珍珠核直径和模具Ⅰ棱高度的2倍之和，两半球合拢后留有一注胶孔用于灌注组织工程支架液，利用模具Ⅱ完成凹槽的填补，最后得到支架层厚度相同的球形组织工程支架珍珠核。

所述的胶原蛋白采用来自于脊椎动物的胶原蛋白或来自于无脊椎动物的胶原蛋白或经过基因工程加工改造过的胶原蛋白。

具体地说，本发明将珍珠核表面处理成适合组织工程支架材料粘附的状态。优选的是在珍珠核表面粘附一层多聚赖氨酸膜，或胶原蛋白膜。此步骤非必须。

配制组织工程支架液：组织工程支架材料可采用生物可降解天然高分子材料，如胶原蛋白、明胶、纤维蛋白、琼脂糖、壳聚糖、透明质酸等或它们与其他材料组成的复合物；也可采用可降解的合成高分子材料，如聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA)、聚己内酯( PCL)、聚乙烯醇( PVA)等。对于珍珠的培育来说，组织工程支架不需要有很高的机械强度，但需要在体内较快降解，优选的支架材料是生物体内可较快降解的天然高分子材料，如胶原蛋白、明胶、透明质酸等及其与其他生物可降解高分子材料组成的复合物（例如胶原蛋白与壳聚糖的复合物）等，最优选的是胶原蛋白和明胶，其中优选的胶原蛋白和明胶浓度为1.0wt%~3.0wt%；以及生物体内易于降解的合成高分子材料，例如聚乙醇酸（PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA)等。为了维持组织工程支架在液体环境中的相对稳定性，有时需要对天然高分子材料进行交联处理，有必要时加入交联剂使支架材料交联。对于胶原蛋白、明胶及其复合物的交联来说，适宜的化学交联剂为戊二醛、原花青素、京尼平、碳化二亚胺等，优选的是戊二醛、原花青素，或采用紫外辐射、重度脱水等物理处理方法。对于以戊二醛为交联剂来说，浓度过低不利于交联，浓度过高会对细胞产生毒性，优选的戊二醛终浓度在0.01~0.2vol%之间。在无菌条件下将支架材料溶于相应溶剂中，加入交联剂，混匀。为了使细胞在支架中更好的生长分裂，也可在支架液中加入适量的有利于细胞生长分裂的细胞因子，或蚌血清，使这些成分交联在支架中。

制备组织工程支架：将组织工程支架材料包裹在步骤1处理好的珍珠核外面，优选的是将组织工程支架材料厚度均匀地包裹在步骤1处理好的珍珠核表面，使支架层各部位厚度基本一致；支架厚度一般为0.2~2.0mm，优选的是0.6~1.2 mm。包裹后静置一段时间使其呈凝胶状态，优选的静置时间为1~24小时。然后置于冻结温度下成型，对于以水作为溶剂的组织支架材料来说，优选的冻结温度在0~-20 ℃之间。再通过真空冷冻干燥处理脱去溶剂，形成表面具有多孔三维网络空间结构的组织工程支架珍珠核。

一种将组织工程支架材料包裹到珍珠核表面的方案是：

1. 制备一种模具，其制备和使用方法为：模具由两个结构相同的中半球构成，每个半球的内侧面伸出3根与半球平面垂直的细柱，彼此相隔120°，细柱的作用在于支撑珍珠核，目的在于使放入模具后的珍珠核周围的空间高度一样，从而使组织工程支架厚度尽量均匀，与半球的平面垂直可使脱模取出珍珠核时不损伤组织工程支架层。细柱的长度在0.02~2mm左右，优选的是0.8~1.2mm。两个半球合拢后在球面的一端留有一小孔用于灌注组织工程支架溶液。脱模时支架中会留下支撑柱造成的小孔，但由于支架材料在蚌体内会逐渐降解，细胞也会自动迁移，这些小孔不会影响将来植核后外套膜表皮细胞在珍珠核周围的均匀分布。

2. 将方法一处理过的普通珍珠核放置于模具中，将方法二制备的组织工程支架液灌注入模具，振荡摇匀10~30分钟，室温下静置1~24小时使组织工程支架材料交联，在珍珠核表面形成一个凝胶层，降温至4~10℃处理10分钟左右，使珍珠核脱模，取出珍珠核，在冻结温度下冷冻成型，然后放入冷冻干燥机中真空干燥去除溶剂。

一种优选的将组织工程支架材料厚度均匀地包裹到珍珠核表面的方案是：

制备珍珠核支架层所用的模具：模具Ⅰ由两个结构一样的中空半球构成，使用时将2个半球合拢即成为一个完整的球体。每个半球的内侧面有3条南北极（以注胶孔所处位置为南极，其对侧为北极）方向排列的条状突起（以下简称棱），其中的2条棱分别位于半球的两侧边缘，另一条棱位于半球中间，优选的是位于半球的正中间，棱的长度为球体周长的1/2，因此3条棱的末端在球的南北极处相交，南极端相交处的棱切除部分形成凹口作为注胶孔；棱的高度0.02~2mm左右，优选的是1mm左右，中间棱宽度2~4mm，边缘棱宽度为中间棱宽度的一半；棱的作用在于支撑珍珠核，使珍珠核放入模具后珍珠核外的空间高度一致，其高度就是组织工程支架的厚度。使用时，先将珍珠核放入一个半球中，然后将另一半球合拢，两个半球的边缘棱在两半球合拢后其侧面拼接在一起，合为一条宽度与中间棱宽度一样的棱，两个半球合拢成一个球体，棱一端的球面是封闭的，另一端球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注组织工程支架材料，此端的棱略短，留出孔道使支架材料能同时灌注到模具中被棱隔开的4个空间中。模具Ⅰ用于完成珍珠核组织支架制备的第一步，得到表面有凹槽的组织支架珍珠核。模具Ⅱ由两个中空的半球组成，其内侧表面无突起结构，半球内径为珍珠核直径和模具Ⅰ棱高度的2倍之和，两半球合拢后留有一注胶孔用于灌注组织工程支架材料，利用模具Ⅱ完成凹槽的填补，最后得到支架层厚度相同的球形组织工程支架珍珠核。

支架制备：先将方法一处理过的普通珍珠核放置于模具Ⅰ中，将方法二制备的组织工程支架液灌注入模具Ⅰ，振荡摇匀10~30分钟，室温下静置1~24小时使组织工程支架材料交联，在珍珠核表面形成一个有凹槽的凝胶层，降温至4~10℃10分钟左右使珍珠核脱模；然后打开模具取出珍珠核，将注胶口处的胶挖去少许形成一凹口，再放置入模具Ⅱ中，使组织支架的凹口处对准注胶孔，再注入步骤二制备的组织工程支架溶液，使第一次注胶时珍珠核表面留下的凹槽填满组织工程支架液，胶液灌注完之后在注胶孔塞上塞子，塞子的作用在于使凹口处胶液与其他部位厚度一致，不使凹口处的组织支架在成型后出现明显的凸起，室温下静置1~24小时使组织工程支架材料交联；脱模取出珍珠核，将注胶孔处的组织支架表面适当磨平，在冻结温度下冷冻成型，然后放入冷冻干燥机中真空干燥。

将制备好的珍珠核无菌处理，包装。

本发明的有益效果，采用本发明的珍珠核培育珍珠，可以在珍珠核外制造一个适合外套膜细胞贴附、迁移、分裂生长的细胞外基质环境，接种外套膜细胞后，外套膜细胞能在珍珠核周围形成一个厚度基本均匀的珍珠囊，解决了传统外套膜细胞小片植入法存在的因细胞在珍珠核周围迁移后分布不均匀，导致颜色不均匀珠、污株、尾巴珠、瑕疵珠等异形珠大量产生的问题，可以大大提高了圆形优质珍珠的比例，也使得珍珠核与育珠蚌的相容性更好，不易吐核，从而提高珍珠养殖的经济效益。

附图说明

图1是本发明实施例1所述的模具Ⅰ一个半球的内部结构图。

图2是实施例1所述的模具Ⅰ半球的横切面图（与注胶孔所在位置垂直的面），中间的圆表示将来放入的珍珠核。

图3是实施例1所述的模具Ⅰ两半球合拢后的俯视图（示注胶口）。

图4是实施例1所述的制备好的组织支架珍珠核的剖面图。

图5是实施例11所述模具的形态结构图。

图6是实施例11所述模具的俯视图。

图7是实施例1中用模具Ⅰ制备的有4个凹槽的组织支架珍珠核的横切面图。

具体实施方式

以下实施例结合附图用对本发明的技术方案做进一步说明，但并不因此而限定本发明的保护范围。下述的支架材料指“组织工程支架材料”。

实施例1

1. 将打磨好的普通珍珠核（直径8mm）高压灭菌处理，放入0.01wt%的多聚赖氨酸溶液中浸泡30分钟，取出，无菌条件下晾干。

2.制备珍珠核支架层模具：模具Ⅰ由两个结构一样的中空半球构成，使用时将2个半球合拢即成为一完整的球体。每个半球的内侧面有3条南北极（以注胶孔所处位置为南极，其对侧为北极）方向排列的条状突起（以下简称棱），其中2条棱分别位于半球两侧边缘（以下称边缘棱），另一条棱位于半球的正中间（以下称中间棱）（图1，图2），棱的长度为球体周长的1/2，因此3条棱的末端在球的南北极处相交，南极端相交处的棱切除部分形成凹口作为注胶孔；中间棱2的宽度3mm左右，高度H为1 mm即为组织工程支架材料厚度，边缘棱3宽度为中间棱的一半。模具Ⅱ由两个中空的半球组成，其内侧表面无突起，半球内径为珍珠核直径和模具Ⅰ棱高度的2倍之和，两半球合拢后留有一注胶孔1用于灌注组织工程支架材料（图3）。使用时，模具Ⅰ用于完成珍珠核组织支架制备的第一步，得到有4道凹槽9的组织工程支架10珍珠核（图7）；模具Ⅱ用于完成凹槽的填补，最后得到球形的组织工程支架珍珠核（图4）。

3.支架材料处理：无菌条件下用双蒸水将重组人胶原蛋白Ⅰ配制成浓度为1.5wt%的溶液，待胶原蛋白完全溶解后向其中加入2.5vol%的戊二醛溶液作为交联剂，使戊二醛终浓度为0.02vol%，搅拌均匀。

4.支架制备：将晾干好的珍珠核放置于模具Ⅰ中，具体方法为，先将珍珠核8放入一个半球中（图2），然后将另一半球合拢，两个半球的边缘棱在两半球合拢后侧面拼接在一起，合为一条宽度与中间棱宽度一样的棱，两个半球合拢成一个球体，棱一端的球面是封闭的，另一端球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注组织工程支架材料，两半球合拢后此端对接处的棱略短，留出孔道使支架材料能同时灌注到模具中被棱隔开的4个空间中。将步骤3制备的胶原蛋白液灌注入模具，振荡摇匀10分钟，室温下静置12小时使胶原蛋白交联，在珍珠核表面形成一个有凹槽的凝胶层，降温至4℃处理10分钟使珍珠核脱模，然后打开模具取出珍珠核，得到有4道凹槽的组织工程支架珍珠核；再将其注胶孔处的支架材料挖去少量，形成一个连通4道凹槽的凹口，放置入模具Ⅱ中，使凹口处对准注胶孔，再注入步骤3制备的液态胶原蛋白溶液，使第一次注胶时留下的凹槽填满组织工程支架液，胶液灌注完之后在注胶孔塞上塞子，塞子的作用在于使凹口处胶液与其他部位厚度一致，不使凹口处的组织支架在成型后出现明显的凸起，室温下静置12小时使胶原蛋白交联；脱模取出珍珠核，将注胶孔处的表面打磨平，在-20 ℃条件下放置1小时冷冻成型，然后放入冷冻干燥机中真空干燥6小时，真空度为12 Pa，冻干温度为-50℃。这样就在珍珠核5表面形成了一层均匀的厚约1mm具有多孔三维网络空间结构的胶原蛋白组织工程支架4。

5.将珍珠核浸泡于蒸馏水中洗去残留的戊二醛，换洗3次以充分洗尽戊二醛，保存于75vol%乙醇溶液中，或干燥后无菌包装备用。

实施例2

1.将打磨好的普通珍珠核高压灭菌处理，放入0.01wt%的多聚赖氨酸溶液中浸泡30分钟，取出，无菌条件下晾干。

2.制备珍珠核支架层模具：同实施例1。

3.支架材料处理：支架材料采用重组人胶原蛋白Ⅰ与壳聚糖的复合物。具体处理步骤如下：

⑴制备高脱乙酰度壳聚糖：采用常规的间接式浓碱法，称取50g原料壳聚糖放置于1000 mL圆底烧瓶中，加入10M NaOH 500mL，搅拌均匀，控制温度在110℃左右，水解约1小时，冷却至常温，然后用蒸馏水反复冲洗洗至中性，真空抽干，再转移至圆底烧瓶中。重复以上步骤两次。所得的白色沉淀反复用蒸馏水洗至中性后，再分别用无水乙醇和无水乙醚抽滤3次，60℃真空干燥24小时即可。

⑵取高脱乙酰度壳聚糖溶于0.5 mol/L的醋酸溶液中，配制成1 wt %壳聚糖溶液，抽滤除去不溶杂质。

⑶将重组人胶原蛋白Ⅲ充分溶解于0.5 mol/L的醋酸溶液中制成1 wt %的溶液。

⑷将壳聚糖溶液和胶原蛋白溶液按1:1的比例混合，加入2.5 vol%的戊二醛溶液作为交联剂，使戊二醛终浓度为0.02vol %，搅拌均匀。

4.支架制备：将晾干好的珍珠核放置于模具Ⅰ中，具体方法为，先将珍珠核放入一个半球中，然后将另一半球合拢，两个半球的边缘棱在两半球合拢后侧面拼接在一起，合为一条宽度与中间棱宽度一样的棱，两个半球合拢成一个球体，棱一端的球面是封闭的，另一端球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注组织工程支架材料，两半球合拢后此端对接处的棱略短，留出孔道使支架材料能同时灌注到模具中被棱隔开的4个空间中；将步骤3制备的复合胶原蛋白液灌注入模具，振荡摇匀10分钟，室温下静置24小时使胶原蛋白交联，降温至4℃处理10分钟使珍珠核脱模，然后打开模具取出珍珠核，得到有4道凹槽的组织工程支架珍珠核；再将其注胶孔处的支架材料挖去少量，形成一个连通4道凹槽的凹口，放置入模具Ⅱ中，使凹口处对准注胶孔，再注入步骤3制备的液态复合胶原蛋白溶液，以使第一次注胶时留下的凹槽填满复合胶原蛋白液，胶液灌注完之后在注胶孔塞上塞子，室温下静置24小时使复合胶原蛋白交联；取出，将注胶孔处的表面打磨平，在-20 ℃条件下放置2小时冷冻成型，然后放入冷冻干燥机中真空干燥6小时，真空度为12 Pa，冻干温度为-50℃。这样就在珍珠核表面形成了一层均匀的厚约1mm具有多孔三维网络空间结构的复合胶原蛋白组织工程支架。

5.将珍珠核浸泡于1 mol/L的NaOH溶液中以中和残留的醋酸，然后用蒸馏水反复冲洗去残留的戊二醛和NaOH，保存于75%乙醇溶液中，或晾干后无菌包装备用。

实施例3

1.将打磨好的普通珍珠核高压灭菌处理，放入0.1wt%的鼠源Ⅰ型胶原蛋白溶液中浸泡30分钟，取出，无菌条件下晾干。

2.制备珍珠核支架层模具：同实施例1。

3.支架材料处理：高分子支架材料采用明胶，用京尼平做交联剂。取600克明胶，180克京尼平，加入10 L双蒸水，37℃溶解。

4.支架制备：将晾干好的珍珠核放置于模具Ⅰ中，具体方法为，先将珍珠核放入一半球中，然后将另一半球合拢，两个半球的边缘棱在两半球合拢后侧面拼接在一起，合为一条宽度与中间棱宽度一样的棱，两个半球合拢成一个球体，一端的球面是封闭的，另一端球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注组织工程支架材料，两半球合拢后此端对接处的棱略短，留出孔道使支架材料能同时灌注到模具中被棱隔开的4个空间中；将步骤3制备的明胶液灌注入模具，振荡摇匀10分钟，室温下静置12小时使明胶交联，在珍珠核表面形成一个有凹槽的凝胶层，降温至10℃处理10分钟使珍珠核脱模，然后打开模具取出珍珠核，得到有4道凹槽的组织工程支架珍珠核；再将其注胶孔处的支架材料挖去少量，形成一个连通4道凹槽的凹口，放置入模具Ⅱ中，使凹口处对准注胶孔，再注入步骤3制备的明胶溶液，以使第一次注胶时留下的凹槽填满明胶液，胶液灌注完之后在注胶孔塞上塞子，室温下静置12小时使明胶交联；取出，将注胶孔处的表面打磨平，然后于-40℃预冻1 小时，-20℃冷冻干燥12小时，室温真空干燥12小时。

5.将处理好的珍珠核无菌包装备用。

实施例4

1.将打磨好的普通珍珠核高压灭菌处理，放入0.1wt%的鼠源Ⅰ型胶原蛋白溶液中浸泡30分钟，取出，无菌条件下晾干。

2.制备珍珠核支架层模具：同实施例1。

3.支架材料处理：支架材料采用PLGA（聚乳酸-聚乙醇酸共聚物），分子量约50,000，室温下将600克的PLGA 溶解于10 L 的二氧六环中。

4.支架制备：将晾干好的珍珠核放置于模具Ⅰ中，具体方法为，先将珍珠核放入一个半球中，然后将另一半球合拢，两个半球的边缘棱在两半球合拢后侧面拼接在一起，合为一条宽度与中间棱宽度一样的棱，两个半球合拢成一个球体，棱一端的球面是封闭的，另一端球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注组织工程支架材料，两半球合拢后此端对接处的棱略短，留出孔道使支架材料能同时灌注到模具中被棱隔开的4个空间中；将步骤3制备的PLGA液灌注入模具Ⅰ，振荡摇匀10分钟，降温至-20℃保持2小时冷冻成型，在珍珠核表面形成一个有凹槽的凝胶层，然后打开模具取出珍珠核，得到有4道凹槽的组织工程支架珍珠核；恢复常温后将其注胶孔处的支架材料挖去少量，形成一个连通4道凹槽的凹口，再放置入模具Ⅱ中，使组织支架的凹口处对准注胶孔，再注入步骤3制备的PLGA液，使第一次注胶时留下的凹槽填满PLGA液，胶液灌注完之后在注胶孔塞上塞子，降温至-20℃保持2小时冷冻成型，取出，将注胶孔处的表面打磨平，于-20℃条件下冷冻干燥12 小时，室温真空干燥12小时。

5.将处理好的珍珠核无菌包装备用。

实施例5

1.将打磨好的普通珍珠核高压灭菌处理，放入0.01wt%的多聚赖氨酸溶液中浸泡30分钟，取出，无菌条件下晾干。

2.制备珍珠核支架层模具：同实施例1。

3.支架材料：采用分子量约60,000的PGA（聚乙醇酸），用双蒸水溶解配制成1wt%的溶液。

4.支架制备：将晾干好的珍珠核放置于模具Ⅰ中，具体方法为，先将珍珠核放入一个半球中，然后将另一半球合拢，两个半球的边缘棱在两半球合拢后侧面拼接在一起，合为一条宽度与中间棱宽度一样的棱，两个半球合拢成一个球体，一端的球面是封闭的，另一端球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注组织工程支架材料，两半球合拢后此端对接处的棱略短，留出孔道使支架材料能同时灌注到模具中被棱隔开的4个空间中；将步骤3制备的PGA液灌注入模具，振荡摇匀10分钟，降温至-20℃保持3小时冷冻成型，在珍珠核表面形成一个有凹槽的凝胶层，然后打开模具取出珍珠核，得到有4道凹槽的组织工程支架珍珠核，恢复常温后将其注胶孔处的支架材料挖去少量，形成一个连通4道凹槽的凹口，放置入模具Ⅱ中，使组织支架的凹口处对准注胶孔，再注入步骤3制备的PGA液，胶液灌注完之后在注胶孔塞上塞子，降温至-20℃保持2小时冷冻成型，取出，将注胶孔处的表面打磨平，于-20℃条件下冷冻干燥12 小时，室温真空干燥12小时。

5.将处理好的珍珠核无菌包装备用。

实施例6

1.将打磨好的普通珍珠核高压灭菌处理，放入0.01wt%的多聚赖氨酸溶液中浸泡30分钟，取出，无菌条件下晾干。

2.制备珍珠核支架层模具：同实施例1。

3.支架材料处理：无菌条件下用双蒸水将重组鼠胶原蛋白Ⅰ配制成浓度为1.5wt%的溶液，待胶原蛋白完全溶解后向其中加入2.5wt%的戊二醛溶液作为交联剂，使戊二醛终浓度为0.05wt%，搅拌均匀。

4.支架制备：同实施例1。

5.将珍珠核浸泡于蒸馏水中洗去残留的戊二醛，换洗3次以充分洗尽戊二醛，保存于75%乙醇溶液中，或干燥后无菌包装备用。

实施例7

1.将打磨好的普通珍珠核高压灭菌处理，放入0.01wt%的多聚赖氨酸溶液中浸泡30分钟，取出，无菌条件下晾干。

2.制备珍珠核支架层模具：同实施例1。

3.支架材料处理：无菌条件下用双蒸水将鱼胶原蛋白（Ⅰ型）配制成浓度为1.5wt%的溶液，待胶原蛋白完全溶解后向其中加入2.5wt%的戊二醛溶液作为交联剂，使戊二醛终浓度为0.02wt%，搅拌均匀。

4.支架制备：同实施例1。

5.将珍珠核浸泡于蒸馏水中洗去残留的戊二醛，换洗3次以充分洗尽戊二醛，保存于75%乙醇溶液中，或干燥后无菌包装备用。

实施例8

1.将打磨好的普通珍珠核高压灭菌处理，放入0.1 wt %的多聚赖氨酸溶液中浸泡10分钟，取出，无菌条件下晾干。

2.制备珍珠核支架层模具：同实施例1。

3.支架材料处理：无菌条件下用双蒸水将章鱼胶原蛋白（Ⅰ型）配制成浓度为1.5wt%的溶液，待胶原蛋白完全溶解后向其中加入2.5wt%的戊二醛溶液作为交联剂，使戊二醛终浓度为0.01wt%，搅拌均匀。

4.支架制备：同实施例1。

5.将珍珠核浸泡于蒸馏水中洗去残留的戊二醛，换洗3次以充分洗尽戊二醛，保存于75%乙醇溶液中，或干燥后无菌包装备用。

实施例9

1.将打磨好的普通珍珠核高压灭菌处理，放入0.1wt%的多聚赖氨酸溶液中浸泡10分钟，取出，无菌条件下晾干。

2.制备珍珠核支架层模具：同实施例1。

3.支架材料处理：无菌条件下用双蒸水将鼠胶原蛋白（Ⅰ型）配制成浓度为2.5wt%的溶液。

4.支架制备：同实施例1。

5.将珍珠核保存于75%乙醇溶液中，或干燥后无菌包装备用。

实施例10

不加戊二醛作为交联剂，因而冻干后的珍珠核无需蒸馏水洗涤，其余同实施例1。

实施例11

1.将打磨好的普通珍珠核高压灭菌处理，放入0.01wt%的多聚赖氨酸溶液中浸泡30分钟，取出，无菌条件下晾干。

2.制备珍珠核支架层模具：模具由两个半球构成（图5，图6），每个半球的内侧面伸出3根与半球的平面垂直的细柱7，处于彼此相隔120°的位置，细柱的作用在于支撑珍珠核，目的在于使放入模具的珍珠核周围的空间高度一样，从而使支架厚度均匀，与半球的平面垂直是便于以后的脱模。细柱的长度在1.2mm左右，两半球合拢后球面留有一小孔6用于灌注支架材料溶液。

3.支架材料处理：4℃条件下，用0.5M 的醋酸将三角帆蚌胶原蛋白溶解，用盐酸调节pH值至4，配制成浓度为2.5mg/mL的溶液，用0.5M的NaOH调节pH至7.2左右。

4.支架制备：将晾干好的珍珠核放置于模具中，具体方法为，先将珍珠核放入一个半球中，然后将另一半球合拢，将冷的组织支架液从注胶孔灌注入模具中，室温或37°C放置30分钟左右使胶液凝结，打开模具取出珍珠核，将注胶孔处的表面打磨平，在-20 ℃条件下放置1小时冷冻成型，然后放入冷冻干燥机中真空干燥6小时，真空度为12 Pa，冻干温度为-50℃。

5.将珍珠核保存于75%乙醇溶液中，或干燥后无菌包装备用。

实施例12

实施例1中的组织工程支架的制备不经模具Ⅱ的步骤，即将从模具Ⅰ制备的有4个凹槽的组织支架珍珠核直接真空冷冻干燥脱水，制备组织工程支架珍珠核。

实施例13

分别采用实施例1，实施例11和实施例12制备的珍珠核，与分离自珍珠蚌的外套膜游离细胞在体外26℃下共培养3天后植入育珠蚌的内脏团植核位点，每蚌植核1粒，各组100个育珠蚌，养殖2年后采株，对照组采用未包裹组织工程支架的普通市售珍珠核，结果见表1。结果表明，采用在珍珠核表面包裹组织工程支架后，圆形珍珠的比例大幅度提高，

表1. 组织工程支架珍珠核培养珍珠的结果

上述实施例只是本发明的部分实施例， 并非对本发明做任何形式上的限制， 任何依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种表面包裹高分子组织工程支架材料的珍珠核，包括珍珠核，其特征在于，在珍珠核表面包裹高分子组织工程支架材料；包裹高分子组织工程支架材料的珍珠核由下述步骤制得：

（1）将珍珠核表面处理成适合组织工程支架材料粘附的状态；

（2）配制组织工程支架液：组织工程支架材料采用生物可降解天然高分子材料或生物可降解的合成高分子材料，将组织工程支架材料溶于相应溶剂中，配成合适浓度的组织工程支架液，当需要加交联剂时添加入适量交联剂，混匀；

（3）在步骤（1）制得的珍珠核表面覆盖厚度为0.02~2mm的由步骤（2）制得的生物可降解高分子材料的组织工程支架液。

2.根据权利要求1所述的珍珠核，其特征在于，所述珍珠核为由贝壳制成的珍珠核、由珍珠制成的珍珠核或人工合成的珍珠核。

3.根据权利要求1或2所述的珍珠核，其特征在于，所述的生物可降解天然高分子材料，包括胶原蛋白、明胶、海藻酸钠、纤维蛋白、琼脂糖、壳聚糖或透明质酸。

4.根据权利要求1或2所述的珍珠核，其特征在于，所述生物可降解的合成高分子材料，包括聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA)、聚己内酯( PCL)或聚乙烯醇( PVA)。

5.权利要求1-4任一所述的表面包裹高分子组织工程支架材料的珍珠核的制备方法，包括以下步骤：

（1）将珍珠核表面处理成适合组织工程支架材料粘附的状态；

（2）配制组织工程支架液：组织工程支架材料采用生物可降解天然高分子材料或生物可降解的合成高分子材料，将组织工程支架材料溶于相应溶剂中，配成合适浓度的组织工程支架液，当需要加交联剂时添加入适量交联剂，混匀；

（3）在步骤（1）制得的珍珠核表面覆盖厚度为0.02~2mm的由步骤（2）制得的生物可降解高分子材料的组织工程支架液。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括制备珍珠核支架层所用的模具：所述模具由下述的两种方法中的任一方法制备而成，1）其一制备方法为：模具由两个中空的半球构成，每个半球的内侧面有3根与半球平面垂直的细柱，彼此相隔120°，细柱的作用在于支撑珍珠核，目的在于使珍珠核周围的空间高度一样，从而使组织工程支架厚度均匀，与半球的平面垂直是便于制备好支架以后的脱模，细柱的长度在0.02~2mm，两半球合拢后一端球面留有一小孔用于灌注组织工程支架液；2）另一种制备方法是：模具有2种，模具Ⅰ由两个结构一样的中空半球构成，每个半球的内侧面有3条突起的棱，其中2条棱分别位于半球两侧边缘，另一条棱位于半球的中间，棱的长度为球体周长的1/2，3条棱的末端相应在球的南北极端相交，南极端相交处的棱切除部分形成凹口作为注胶孔，棱的高度为0.02~2mm，边缘棱宽度为中间棱的一半；棱的作用在于支撑珍珠核，使将珍珠核放入模具后珍珠核与半球内面之间的高度一致，棱的高度（H）就是要填充的组织工程支架的厚度；使用时，先将珍珠核放入一个半球中，然后将另一半球合拢，两个半球的边缘棱在两半球合拢后其侧面拼接在一起合为一条宽度与中间棱宽度一样的棱，两个半球合拢成一个球体，棱一端的球面是封闭的，另一端的球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注组织工程支架液，此端对接处的棱切除部分，留出孔道使组织工程支架液能从此孔道同时灌注到模具中被棱隔开的4个空间中；模具Ⅰ用于完成珍珠核组织支架制备的第一步，得到有凹槽的组织支架珍珠核；模具Ⅱ由两个中空的半球组成，其内侧表面无突起，半球内径为珍珠核直径和模具Ⅰ棱高度的2倍之和，两半球合拢后留有一注胶孔用于灌注组织工程支架液，利用模具Ⅱ完成凹槽的填补，得到组织工程支架层厚度相同的球形组织工程支架珍珠核；

支架制备：先将步骤（1）处理过的珍珠核放置于模具Ⅰ中，将步骤（2）制备的组织工程支架液灌注入模具Ⅰ，振荡摇匀10~30分钟，室温下静置1~24小时使组织工程支架液交联，在珍珠核表面形成一个有凹槽的凝胶层，降温至4~10℃放置10~30分钟；然后打开模具取出珍珠核，再放置入模具Ⅱ中，使上述制得的球形组织工程支架珍珠核的凹口处对准注胶孔，再注入步骤（2）制备的组织工程支架液，以使第一次注胶时留下的凹槽填满组织工程支架液，室温下静置1~24小时使组织工程支架液交联；取出，将注胶孔处的表面磨平，在冻结温度下冷冻成型，然后放入冷冻干燥机中真空干燥；

当支架制备过程中有加入对细胞有毒的成分时，则需将有毒成分从支架中洗去；

将珍珠核无菌保存备用。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，

（1）在珍珠核表面粘附一层多聚赖氨酸膜：将打磨好的普通珍珠核高压灭菌处理，放入0.01wt%~0.1wt%的多聚赖氨酸溶液中浸泡10~30分钟，取出，无菌条件下晾干；

（2）无菌条件下配制组织工程支架液：无菌条件下将胶原蛋白配制成浓度为1.0%~3.0wt %的溶液，待胶原蛋白完全溶解后向其中加2.5vol%的戊二醛溶液作为交联剂，使戊二醛终浓度为0.01vol%~0.05vol%，搅拌均匀；

（3）支架制备：将晾干好的珍珠核放置于模具Ⅰ中，具体方法为，先将珍珠核放入一个半球中，然后将另一半球合拢，将步骤⑵制备的组织工程支架液灌注入模具，振荡摇匀10分钟，室温下静置6~24小时使胶原蛋白交联，降温至4~10℃处理10~30分钟使珍珠核脱模，然后打开模具取出珍珠核，得到有4道凹槽的组织工程支架珍珠核；再将其注胶孔处的支架材料挖去少量，形成一个连通4道凹槽的凹口，放置入模具Ⅱ中，使凹口处对准注胶孔，再注入步骤⑵制备的组织工程支架液，使第一次注胶时留下的凹槽填满组织工程支架液，室温下静置2~12小时使胶原蛋白交联；取出，将注胶孔处的表面打磨平，在-20 ℃条件下放置1~6小时冷冻成型，然后放入冷冻干燥机中真空干燥1~24小时，真空度为12~20 Pa，冻干温度为-20~-70℃；

（4）将珍珠核浸泡于蒸馏水中洗去残留的戊二醛，然后真空干燥将珍珠核去除水分后无菌包装备用。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备珍珠核支架层所用的模具：模具Ⅰ由两个结构一样的中空半球构成，使用时将2个半球合拢即成为一个完整的球体；以球体的注胶孔所处位置为南极，其对侧为北极，每个半球的内侧面有3条南北极方向排列的条状突起的棱，其中的2条棱分别位于半球的两侧边缘，另一条棱位于半球中间， 3条棱的末端在球的南北极处相交，在南极端相交处的棱切除部分形成凹口作为注胶孔；棱的作用在于支撑珍珠核，使珍珠核放入模具后珍珠核外的空间的高度就是组织工程支架的厚度；两个半球合拢成一个球体，棱一端的球面是封闭的，另一端的球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注组织工程支架液；模具Ⅰ用于完成珍珠核组织支架制备的第一步，得到表面有凹槽的组织工程支架珍珠核；模具Ⅱ由两个中空的半球组成，其内侧表面无突起，半球内径为珍珠核直径和模具Ⅰ棱高度的2倍之和，两半球合拢后留有一注胶孔用于灌注组织工程支架液，利用模具Ⅱ完成凹槽的填补，最后得到支架层厚度相同的球形组织工程支架珍珠核。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的胶原蛋白采用来自于脊椎动物的胶原蛋白或来自于无脊椎动物的胶原蛋白或经过基因工程加工改造过的胶原蛋白。