CN105309346A

CN105309346A - 一种用组织工程支架珠核培育珍珠的方法

Info

Publication number: CN105309346A
Application number: CN201510306482.8A
Authority: CN
Inventors: 林尧; 肖义军; 黄义德; 陈元仲; 王正朝; 肖宽诚
Original assignee: Fujian Normal University
Current assignee: Fujian Normal University
Priority date: 2015-06-07
Filing date: 2015-06-07
Publication date: 2016-02-10
Anticipated expiration: 2035-06-07
Also published as: CN105309346B

Abstract

本发明公开一种用组织工程支架珠核培育珍珠的方法，其特征是，在植入育珠蚌的珠核表面粘附有一层厚度均匀的可降解高分子聚合物作为组织工程支架，所述组织工程支架为一个可以容纳细胞生长的立体网络空间，将珍珠贝的外套膜组织用酶消化法分离成单个存在的游离的外套膜细胞，配制成一定细胞密度的外套膜细胞悬液，然后将珠核粘附外套膜细胞后与外套膜细胞悬液一起植入育珠蚌的插核位置来培育有核珍珠。本发明方法操作简便，无需体外培养细胞，避免了采用细胞培养方法对技术和设备要求高的问题，可将无菌包装好的珠核直接运至养殖现场操作，运输方便，对设备、操作人员的要求低，成本生产大幅降低，适于大规模生产应用。

Description

一种用组织工程支架珠核培育珍珠的方法

技术领域

本发明涉及一种有核珍珠的培养方法，具体的说，涉及一种表面粘附有组织工程支架的珠核在有核珍珠培育中的应用。

背景技术

组织工程支架是人工合成的具有三维结构的框架，它模拟机体组织中细胞外基质的作用，使细胞能在这种三维结构上黏附、迁移、增殖，最终使组织得以重建。制备组织工程支架常用的材料有生物活性陶瓷、可降解高分子材料等。可降解的高分子材料可分为天然高分子材料和人工合成高分子材料。

目前有核珍珠的培养通常都是将外套膜细胞小片与珍珠核一起植入育珠蚌的插核部位，然后放入养殖场所中养殖。在珍珠蚌体内，从外套膜细胞小片游离出来表皮细胞与结缔组织细胞围绕珠核形成珍珠囊，分泌珍珠质形成珍珠。这种珠核由于育珠蚌的排斥导致吐核率高，同时由于细胞小片只能贴于珠核的一侧，使得外套膜细胞在珠核周围分布不均，导致培育的珍珠大小、色泽不均匀，圆形珍珠数量少，存在污株、尾巴珠、瑕疵珠等问题，优质珍珠生产率低。我国是珍珠养殖大国，珍珠产量占全世界95%，但价值只占8%不到，原因就是我国生产的高质量珍珠少，一、二、三等珠仅占20％左右，其中一等珠不足3％。

为解决这个问题，对比文献1“一种基于珍珠贝外套膜细胞培养生产珍珠的方法”（发明专利号：201310280635.7）公布了一种培养外套膜细胞后直接注入育珠蚌外套膜结缔组织部位培养珍珠的方法。但贝类生物的细胞体外大量和长期培养目前在技术上还存在很大困难（参考文献1，2），该技术描述的在体外培养细胞传代45代技术上难以实现。通常细胞会随着分裂次数的增加而逐渐衰老直至凋亡。贝类生物的体细胞在体外培养条件下一般生存期不会超过30天左右。对比文献2“游离细胞植入法培育有核珍珠”（发明专利号：：200510110378.8）公布了一种通过将外套膜细胞与珍珠核共培养，使得外套膜细胞粘附在珍珠核的表面，然后将粘附了外套膜细胞的珍珠核插入育珠蚌的插核部位来培养珍珠。此方法存在以下3方面问题：⑴能贴附于珠核表面生长的细胞只有表皮上皮细胞，但珍珠囊的形成也需要来自外套膜的结缔组织细胞（参考文献3）；⑵正常上皮细胞在人工培养的条件下只能贴壁生长成单层，细胞量过少。因此该发明通过在插核前后再另外滴入大量细胞液来解决细胞量不足和细胞种类单一的问题。⑶该方法还存在细胞无法贴附到珠核与培养皿的接触面，因此珠核表面存在无细胞区域的问题；此外球形珠核容易滚动，易于与其他珠核碰撞导致细胞损伤脱落（参考文献3）等问题。

本发明通过用酶消化将珍珠贝外套膜细胞分离成单个游离存在的状态，配制成细胞悬液，将其与外表面覆盖有一层厚度一致的可降解组织工程支架的珍珠核一同植入育珠蚌，游离外套膜细胞在珍珠贝体内会粘附到组织工程支架纤维上，由于正常细胞有沿贴附面呈单层生长的特点，因此会在珍珠核周围厚度一样的组织工程支架中形成比较均匀的分布。随着组织工程支架纤维在体内逐渐降解，外套膜细胞在珠核周围形成均匀的珍珠囊，分泌珍珠质，从而使得珠核周围新形成的珍珠层厚度一致。克服了细胞小片植入法存在的外套膜细胞在珠核周围分布不均，导致培育的珍珠形状、色泽不均匀的问题，达到生产优质珍珠的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种表面粘附有可降解组织工程支架的珠核在培育有核珍珠中的应用方法。通过在珍珠核的表面先覆盖一层可降解高分子聚合物作为组织工程支架，在珠核表面造成一个可以容纳细胞在其中生长的立体网络空间。并在组织工程支架中吸附有血清成分（含细胞生长所需的各种生长因子），使得贴附在珠核周围组织工程支架上的细胞得以快速分裂增殖。采用酶消化法将珍珠蚌外套膜细胞分离成单个游离存在的细胞悬液。使用时，先将珠核浸泡在细胞悬液中。用经过消毒处理的通道针在育珠蚌外套膜上开口，并制造通道，先向通道中滴加部分外套膜细胞悬液，然后将珠核移植到育珠蚌体内，再在通道中补加细胞悬液，用生物胶粘合创口以防细胞流出。

为了实现上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：本发明所述的一种用组织工程支架珠核培育珍珠的方法，其特征是，在植入育珠蚌的珠核表面粘附有一层厚度均匀的可降解高分子聚合物作为组织工程支架，所述组织工程支架为一个可以容纳细胞生长的立体网络空间，将珍珠贝的外套膜组织用酶消化法分离成单个存在的游离的外套膜细胞，配制成一定细胞密度的外套膜细胞悬液，然后将珠核粘附外套膜细胞后与外套膜细胞悬液一起植入育珠蚌的插核位置来培育有核珍珠。

本发明所述的用组织工程支架珠核培育珍珠的方法，其包括以下步骤：

（1）珠核表面预处理：将珠核表面处理成适合组织工程支架材料粘附的状态；

（2）制备珠核组织工程支架层模具：所述模具由模具Ⅰ和模具Ⅱ组成，模具Ⅰ由两个结构一样的中空半球构成，每个半球的内侧面有3条突起的棱，其中2条棱分别位于半球两侧边缘，另一条棱位于半球的中间，棱的长度为球体周长的1/2，3条棱的末端在球的南北极端相交，南极端相交处的棱切除部分形成凹口作为注胶孔，棱的高度0.02~2mm，边缘棱宽度为中间棱的一半；棱的作用在于支撑珍珠核，使将珍珠核放入模具后珍珠核与半球内面之间的高度一致，棱的高度就是要填充的组织工程支架的厚度；使用时，先将珍珠核放入一个半球中，然后将另一半球合拢，两个半球的边缘棱在两半球合拢后其侧面拼接在一起合为一条宽度与中间棱宽度一样的棱，两个半球合拢成一个球体，棱一端的球面是封闭的，而位于棱另一端的球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注组织工程支架液，此端对接处的棱切除部分，留出孔道使组织工程支架液能从此孔道同时灌注到模具中被棱隔开的4个空间中；模具Ⅰ用于完成珍珠核组织工程支架制备的第一步，得到有凹槽的组织工程支架珍珠核；

模具Ⅱ由两个中空的半球组成，其内侧表面无突起结构，半球内径为珍珠核直径和模具Ⅰ棱高度的2倍之和，两半球合拢后留有一注胶孔用于灌注组织工程支架液，利用模具Ⅱ完成凹槽的填补，得到组织工程支架层厚度相同的球形组织工程支架珍珠核；

（3）配制组织工程支架液：无菌条件下将胶原蛋白配制成浓度为1.0wt%~3.0wt%的溶液，待胶原蛋白完全溶解后向其中加入2.5vol%的戊二醛溶液作为交联剂，使戊二醛终浓度为0.01vol%~0.05vol%，搅拌均匀；

先将步骤（1）处理好的珠核放置于模具Ⅰ中，将步骤⑶制备的胶原蛋白液灌注入模具，振荡摇匀，室温下静置6~24小时使胶原蛋白交联，降温至4℃、10分钟后使珠核脱模；然后打开模具Ⅰ取出珠核，再放置入模具Ⅱ中，使组织工程支架的凹槽的凹口处对准注胶孔，再注入步骤3）制备的液态胶原蛋白溶液，以使第一次注胶时留下的凹槽填满胶原蛋白液，室温下静置2~12小时使胶原蛋白交联；取出，将注胶孔处的表面磨平，在－20℃条件下放置1~6小时冷冻成型，然后放入冷冻干燥机中真空干燥2~24小时，真空度为12~20Pa，冻干温度为－20~－70℃。将珠核浸泡于蒸馏水中洗去残留的戊二醛，换洗多次以充分洗尽戊二醛；常温真空干燥抽去水分。将珠核浸泡于蚌血清或牛血清或马血清溶液中30分钟，在－20℃条件下冷冻2~4小时，然后放入冷冻干燥机真空干燥1~24小时，真空度为12~20Pa，冻干温度为－20~－70℃；

（4）外套膜游离细胞获取：清洗蚌壳，撕取珍珠蚌的外套膜组织，切除边缘色线部分，洗涤消毒后剪成约1mm²小块，采用胰酶消化法消化组织块，通常采用浓度为0.25wt%左右的胰酶溶液，在25~37℃范围内消化0.5~4小时，用200目绢网过滤去除残留的组织块，1000r/分钟离心分离出细胞，加入培养液吹散细胞沉淀，得到珍珠贝的外套膜组织游离细胞；

（5）珠核植核前预粘附细胞：将分离出的外套膜组织游离细胞用培养液或PBS稀释成每毫升1.0×10⁵~1.0×10⁷个细胞的细胞悬液，将处理过的珠核浸泡到细胞悬液中；

（6）用经过消毒处理的通道针在育珠蚌外套膜上开口，并制造通道，先向通道中滴加部分步骤（5）制备的细胞悬液，然后将珠核移植到育珠蚌体内，再在通道中补加细胞悬液，用生物胶粘合创口以防细胞流出；

（7）将经过步骤（6）手术插核处理的育珠蚌吊养于育珠水域,按常规的饲养管理规范进行操作。

其中所述的高分子聚合物指的是生物可降解天然高分子材料和生物可降解的合成高分子材料，所述的生物可降解天然高分子材料，包括胶原蛋白、明胶、海藻酸钠、纤维蛋白、琼脂糖、壳聚糖、透明质酸或它们与其他材料组成的复合物；所述生物可降解的合成高分子材料，包括聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA)和聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚乙烯醇(PVA)或它们与其他材料组成的复合物。

具体地说，本发明的一种用组织工程支架珠核培育珍珠的方法的具体步骤为：

1.将珠核表面处理成适合组织工程支架材料粘附的状态。优选的是在珠核表面粘附一层多聚赖氨酸膜，或胶原蛋白膜。

2.制备蚌血清：自珍珠贝血窦中抽取血液，2000r/分钟离心10分钟，取上清，置于56℃水浴锅中做灭活处理30分钟，得到的血清再经过0.2μm的滤膜过滤，4℃存储备用。

3.制备珠核组织工程支架层模具：模具有2种，模具Ⅰ由两个结构一样的中空半球构成，使用时将2个半球合拢即成为一个完整的球体。每个半球的内侧面有3条南北极（以注胶孔所处位置为南极，其对侧为北极）方向排列的条状突起（以下简称棱），其中的2条棱分别位于半球的两侧边缘，另一条棱位于半球中间，优选的是位于半球的正中间，棱的长度为球体周长的1/2，因此3条棱的末端在球的南北极处相交，南极端相交处的棱切除部分形成凹口作为注胶孔；棱的高度0.02~2mm左右，优选的是1mm左右，中间棱宽度2~4mm，边缘棱宽度为中间棱宽度的一半；棱的作用在于支撑珍珠核，使珍珠核放入模具后珍珠核外的空间高度一致，其高度就是组织工程支架的厚度。使用时，先将珍珠核放入一个半球中，然后将另一半球合拢，两个半球的边缘棱在两半球合拢后其侧面拼接在一起，合为一条宽度与中间棱宽度一样的棱，两个半球合拢成一个球体，棱一端的球面是封闭的，另一端球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注组织工程支架材料，此端的棱略短，留出孔道使组织工程支架材料能同时灌注到模具中被棱隔开的4个空间中。模具Ⅰ用于完成珍珠核组织工程支架制备的第一步，得到表面有凹槽的组织工程支架珍珠核。模具Ⅱ由两个中空的半球组成，其内侧表面无突起结构，半球内径为珍珠核直径和模具Ⅰ棱高度的2倍之和，两半球合拢后留有一注胶孔用于灌注组织工程支架材料，利用模具Ⅱ完成凹槽的填补，最后得到组织工程支架层厚度相同的球形组织工程支架珍珠核。

4.无菌条件下配制组织工程支架液：材料可采用生物可降解天然高分子材料，也可采用生物可降解的合成高分子材料。优选的是胶原蛋白，更优选的是无脊椎动物的胶原蛋白。无菌条件下用双蒸水将胶原蛋白配制成溶液，优选的浓度为1.0wt%~3.0wt%，待胶原蛋白完全溶解后向其中加入2.5vol%戊二醛溶液作为交联剂，使戊二醛终浓度为0.01vol%~0.05vol%，搅拌均匀。

5.组织工程支架制备：先将晾干好的珠核放置于模具Ⅰ中，将步骤4制备的胶原蛋白液灌注入模具，振荡摇匀，室温下静置1~12小时使胶原蛋白交联，在珍珠核表面形成一个有凹槽的凝胶层，降温至4℃10分钟使珠核脱模；然后打开模具取出珠核，将注胶口处的胶挖去少许形成一凹口，再放置入模具Ⅱ中，使组织工程支架的凹口处对准注胶孔，再注入步骤3制备的液态胶原蛋白溶液，使第一次注胶时留下的凹槽填满胶原蛋白液，胶液灌注完之后在注胶孔塞上塞子，塞子的作用在于使凹口处胶液与其他部位厚度一致，不使凹口处的组织工程支架在成型后出现明显的凸起，室温下静置2~12小时使胶原蛋白交联；取出，将注胶孔处的表面磨平，在－20℃条件下放置1~6小时冷冻成型，然后放入冷冻干燥机中真空干燥1~12小时，真空度为12~20Pa，冻干温度为－20~－70℃。将珠核浸泡于蒸馏水中洗去残留的戊二醛，换洗多次以充分洗尽戊二醛。常温真空干燥抽去水分。将珠核浸泡于蚌血清（也可以采用牛血清、马血清等其他动物血清）溶液中30分钟，在－20℃条件下冷冻2~4小时，然后放入冷冻干燥机真空干燥1~24小时，真空度为12~20Pa，冻干温度为－20~－70℃。这样就在珠核表面形成了一层含有多种细胞生长因子的、厚约1mm具有三维空间结构的胶原蛋白组织工程支架。

6.外套膜游离细胞获取：清洗蚌壳，撕取珍珠蚌的外套膜组织，切除边缘色线部分，洗涤消毒后剪成约1mm²小块，采用胰酶消化法消化组织块，通常采用含EDTA、浓度为0.25wt%左右的胰酶溶液，在25~37℃范围内消化0.5~4小时，用200目绢网过滤去除残留的组织块，1000r/分钟离心分离出细胞，加入培养液吹散细胞沉淀，得到珍珠贝的外套膜组织游离细胞，其中含有外套膜表皮细胞和结缔组织细胞等构建珍珠囊所需的各种细胞。

7.珠核植核前预粘附细胞：将分离出的细胞用培养液或PBS稀释成每毫升1×10⁵~1×10⁷个细胞的细胞悬液，将处理过的珠核浸泡到细胞悬液中。

8.用经过消毒处理的通道针在育珠蚌外套膜上开口，并制造通道，先向通道中滴加部分细

胞悬液，然后将珠核移植到育珠蚌体内，再在通道中补加细胞悬液，用生物胶粘合创口

以防细胞流出。

9.将经过手术插核处理的育珠蚌吊养于育珠水域,按常规的饲养管理规范进行操作。

本发明的有益效果

采用本发明的方法，解决了传统有核珍珠培养细胞小片植入法导致的外套膜细胞在珠核周围分布不均匀的问题。本发明方法操作简便，无需体外培养细胞，避免了采用细胞培养方法对技术和设备要求高的问题，可将无菌包装好的珠核直接运至养殖现场操作，运输方便，对设备、操作人员的要求低，成本生产大幅降低，适于大规模生产应用。

附图说明

图1是本发明实施例1所述的模具Ⅰ一个半球的结构图。

图2是模具Ⅰ半球的横切面图（与注胶孔所在位置垂直的面），中间的圆表示将来放入的珍珠核。

图3是模具Ⅰ两半球合拢后的俯视图。

图4是实施例1中用模具Ⅰ制备的有4个凹槽的组织工程支架珍珠核的横切面图。

具体实施方式

以下具体实施例对本发明做进一步说明，但并不因此而限制本发明的范围。

实施例1

1.将打磨好的珍珠核高压灭菌处理，放入0.01wt%的多聚赖氨酸溶液中振荡浸泡30分钟，取出，无菌条件下晾干。

2.制备蚌血清：自马氏珠母贝血窦中抽取血液，2000r/分钟离心10分钟，取上清，置于56℃水浴锅中做灭活处理30分钟，得到的血清再经过0.2μm的滤膜过滤，用PBS配制成10vol%浓度，4℃存储备用。

3.制备珠核组织工程支架层模具：模具Ⅰ由两个结构一样的中空半球构成，使用时将2个半球合拢即成为一个完整的球体。每个半球的内侧面有3条南北极（以注胶孔所处位置为南极，其对侧为北极）方向排列的条状突起（以下简称棱），其中2条棱分别位于半球两侧边缘（以下称边缘棱），另一条棱位于半球的正中间（以下称中间棱）（图1，图2），棱的长度为球体周长的1/2，因此3条棱的末端在球的南北极处相交，南极端相交处的棱切除部分形成凹口作为注胶孔；中间棱2的宽度3mm左右，高度1mm左右，边缘棱3宽度为中间棱的一半。模具Ⅱ由两个中空的半球组成，其内侧表面无突起结构，半球内径为珍珠核直径和模具Ⅰ棱高度的2倍之和，两半球合拢后留有一注胶孔1用于灌注组织工程支架材料（图3）。使用时，模具Ⅰ用于完成珍珠核组织工程支架制备的第一步，得到有4道凹槽5的组织工程支架珍珠核（图4）；模具Ⅱ用于完成凹槽的填补，最后得到球形的组织工程支架珍珠核。

4.无菌条件下用双蒸水将鱼胶原蛋白配制成浓度为1.5wt%的溶液，待胶原蛋白完全溶解后向其中加入2.5vol%的戊二醛溶液作为交联剂，使戊二醛终浓度为0.02vol%，搅拌均匀。

5.组织工程支架制备：先将晾干好的珠核放置于模具Ⅰ中，具体方法为，先将珍珠核4放入一个半球中（图2），然后将另一半球合拢，两个半球合拢成一个球体，棱一端的球面是封闭的，另一端球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注组织工程支架材料，两半球合拢后此端对接处的棱略短，留出孔道使组织工程支架材料能同时灌注到模具中被棱隔开的4个空间中。将步骤4制备的胶原蛋白液灌注入模具，振荡摇匀10分钟，室温下静置12小时使胶原蛋白交联，在珍珠核表面形成一个有凹槽的凝胶层6，降温至4℃10分钟使珠核脱模；然后打开模具取出珠核，再将其注胶孔处的组织工程支架材料挖去少量，形成一个连通4道凹槽的凹口，再放置入模具Ⅱ中，使组织工程支架的凹口处对准注胶孔，再注入步骤4制备的液态胶原蛋白溶液，以使第一次注胶时留下的凹槽填满胶原蛋白液，室温下静置12小时使胶原蛋白交联；取出，将注胶孔处的表面磨平，在－20℃条件下放置2小时冷冻成型，然后放入冷冻干燥机中真空干燥6小时，真空度为12Pa，冻干温度为－50℃。将珠核浸泡于蒸馏水中洗去残留的戊二醛，换洗3次以充分洗尽戊二醛。常温真空干燥抽去水分。将珠核浸泡于10vol%蚌血清溶液中30分钟，在－20℃条件下冷冻2小时，然后放入冷冻干燥机真空干燥6小时，真空度为12Pa，冻干温度为－20℃。

6.外套膜细胞分离：清洗蚌壳，割断闭壳肌，撕取外套膜组织，去除内表皮，先用PBS缓冲溶液清洗3遍，将组织置于含4000~5000U/mL抗生素（青霉素+链霉素）的PBS缓冲溶液中浸泡10分钟，再用PBS缓冲溶液浸泡清洗10分钟，切除边缘色线部分，将其余组织剪碎成约1mm²小片，加入约2倍量含EDTA、0.25wt%胰蛋白酶消化30分钟，然后加入胎牛血清终止酶消化反应，用200目绢网过滤去除残留的组织块，1000r/分钟离心5分钟，弃上清，加入1640培养液吹散沉淀。

7.珠核植核前预粘附细胞：将细胞密度调整为每毫升1×10⁶细胞。将表面粘附有胶原蛋白组织工程支架的珠核浸泡到细胞悬液中。

8.用经过消毒处理的通道针在育珠蚌外套膜上开口，并制造通道，深度为2cm，口径为

1cm，先向通道中滴加0.5mL细胞悬液，然后将珠核移植到育珠蚌体内，再在通道中补

加0.2mL细胞悬液，用生物胶粘合创口以防细胞流出。

10.采用本方法试验培育100只育珠蚌，养殖2年，5例死亡，无一例发生吐核，95粒珍珠全部为圆形或近圆形珍珠，一等珠达到100%，而对照组采用未含组织工程支架的普通珠核，100例死亡8例，13例发生吐核，圆形及近圆形珠仅有26粒。

实施例2

1.将打磨好的珍珠核高压灭菌处理，放入0.1wt%的多聚赖氨酸溶液中振荡浸泡10分钟，取出，无菌条件下晾干。

3.制备珠核组织工程支架层模具：模具Ⅰ由两个中空的半球构成，每个半球的内侧面有3条隆起的棱，棱的长度略短于半球的周长，其中2条棱位于半球的边缘，另一条棱位于半球的正中间位置，中间棱与边缘的棱平行排列，3条棱的末端相交在同一处；中间棱的宽度3mm左右，高度H为1mm，边缘棱宽度为中间棱的一半。模具Ⅱ由两个中空的半球组成，其内径为珠核直径和2倍棱高度之和，两半球合拢后留有一注胶孔用于灌注组织工程支架材料。使用时，模具Ⅰ用于完成珠核组织工程支架制备的第一步，得到有4道凹槽的组织工程支架珠核；模具Ⅱ用于完成凹槽的填补，最后得到球形的组织工程支架珠核。

4.无菌条件下用双蒸水将重组人胶原蛋白Ⅱ配制成浓度为1.5wt%的溶液，待胶原蛋白完全溶解后向其中加入2.5vol%的戊二醛溶液作为交联剂，使戊二醛终浓度为0.01vol%，搅拌均匀。

5.组织工程支架制备：先将晾干好的珠核放置于模具Ⅰ中，将步骤4制备的胶原蛋白液灌注入模具，振荡摇匀10分钟，室温下静置6小时使胶原蛋白交联，在珍珠核表面形成一个有凹槽的凝胶层，降温至4℃10分钟使珠核脱模；然后打开模具取出珠核，将其注胶孔处的组织工程支架材料挖去少量，形成一个连通4道凹槽的凹口，再放置入模具Ⅱ中，使组织工程支架的凹口处对准注胶孔，再注入步骤4制备的液态胶原蛋白溶液，使第一次注胶时留下的凹槽填满胶原蛋白液，室温下静置6小时使胶原蛋白交联；取出，将注胶孔处的表面磨平，在－20℃条件下放置2小时冷冻成型，然后放入冷冻干燥机中真空干燥6小时，真空度为12Pa，冻干温度为－50℃。将珠核浸泡于蒸馏水中洗去残留的戊二醛，换洗3次以充分洗尽戊二醛。常温真空干燥抽去水分。将珠核浸泡于10vol%蚌血清溶液中30分钟，在－20℃条件下冷冻2小时，然后放入冷冻干燥机真空干燥6小时，真空度为12Pa，冻干温度为－20℃。

6.外套膜细胞分离：清洗蚌壳，割断闭壳肌，撕取外套膜组织，先用PBS缓冲溶液清洗3遍，将组织置于含4000~5000U/mL抗生素（青霉素+链霉素）的PBS缓冲溶液中浸泡10分钟，再用PBS缓冲溶液浸泡清洗10分钟，切除边缘色线部分，将其余组织剪碎成约1mm²小片，加入约2倍量含EDTA、0.25wt%胰蛋白酶消化30分钟，然后加入胎牛血清终止酶消化反应，用200目绢网过滤去除残留的组织块，1000r/分钟离心5分钟，弃上清，加入1640培养液吹散沉淀。

加0.2mL细胞悬液，用生物胶粘合创口以防细胞流出。

10.采用本方法试验培育100只育珠蚌，养殖2年，12例死亡，无一例发生吐核，88粒珍珠全部为圆形或近圆形珍珠，一等珠达到100%，而对照组采用未含组织工程支架的普通珠核，100例死亡8例，13例发生吐核，圆形及近圆形珠仅有26粒。

实施例3

1.将打磨好的珍珠核高压灭菌处理，放入0.1wt%的鼠源Ⅰ型胶原蛋白溶液中振荡浸泡30分钟，取出，无菌条件下晾干。

3.制备珠核组织工程支架层模具：模具Ⅰ由两个中空的半球构成，每个半球的内侧面有3条隆起的棱，棱的长度略短于半球的周长，其中2条棱位于半球的边缘，另一条棱位于半球的正中间位置，中间棱与边缘的棱平行排列，3条棱的末端相交在同一处；中间棱的宽度3mm左右，高度1mm左右，边缘棱宽度为中间棱的一半。模具Ⅱ由两个中空的半球组成，其内径为珠核直径和2倍棱高度之和，两半球合拢后留有一注胶孔用于灌注组织工程支架材料。使用时，模具Ⅰ用于完成珠核组织工程支架制备的第一步，得到有4道凹槽的组织工程支架珠核；模具Ⅱ用于完成凹槽的填补，最后得到球形的组织工程支架珠核。

4.无菌条件下用双蒸水将重组鼠源胶原蛋白Ⅰ配制成浓度为1.5wt%的溶液，待胶原蛋白完全溶解后向其中加入2.5vol%的戊二醛溶液作为交联剂，使戊二醛终浓度为0.02vol%，搅拌均匀。

5.组织工程支架制备：先将晾干好的珠核放置于模具Ⅰ中，将步骤4制备的胶原蛋白液灌注入模具，振荡摇匀10分钟，室温下静置2小时使胶原蛋白交联，在珍珠核表面形成一个有凹槽的凝胶层，降温至4℃10分钟使珠核脱模；然后打开模具取出珠核，将其注胶孔处的组织工程支架材料挖去少量，形成一个连通4道凹槽的凹口，再放置入模具Ⅱ中，使组织工程支架的凹口处对准注胶孔，再注入步骤4制备的液态胶原蛋白溶液，以使第一次注胶时留下的凹槽填满胶原蛋白液，室温下静置2小时使胶原蛋白交联；取出，将注胶孔处的表面磨平，在－20℃条件下放置2小时冷冻成型，然后放入冷冻干燥机中真空干燥6小时，真空度为12Pa，冻干温度为－50℃。将珠核浸泡于蒸馏水中洗去残留的戊二醛，换洗3次以充分洗尽戊二醛。常温真空干燥抽去水分。将珠核浸泡于10vol%蚌血清溶液中30分钟，在－20℃条件下冷冻2小时，然后放入冷冻干燥机真空干燥6小时，真空度为12Pa，冻干温度为－20℃。

加0.2mL细胞悬液，用生物胶粘合创口以防细胞流出。

10.采用本方法试验培育100只育珠蚌，养殖2年，死亡5只，无1例发生吐核，收获的珍珠基本都是正圆形或近似正圆形，无尾巴珠，一等珠达到89%，而对照组采用未含组织工程支架的普通珠核，100例死亡8例，13例发生吐核，圆形及近圆形珠仅有26粒。

参考文献

1.刘万磊．水生无脊椎动物细胞培养［J］。细胞生物学杂志，2006，28(2):173－178．

2.李倩，施志仪，李文娟.三角帆蚌外套膜细胞体外培养优化及体内植入培养对细胞生长的影响［J］.中国水产科学，2014，21(2):225－234.

钱伟平，许梓荣，张明霞，等.注射法培育三角帆蚌有核珍珠的研究[J]。浙江农业学报，2002，14(2):82～86。

上述实施例只是本发明的部分实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，任何依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。

Claims

1.一种用组织工程支架珠核培育珍珠的方法，其特征是，在植入育珠蚌的珠核表面粘附有一层厚度均匀的可降解高分子聚合物作为组织工程支架，所述组织工程支架为一个可以容纳细胞生长的立体网络空间，将珍珠贝的外套膜组织用酶消化法分离成单个存在的游离的外套膜细胞，配制成一定细胞密度的外套膜细胞悬液，然后将珠核粘附外套膜细胞后与外套膜细胞悬液一起植入育珠蚌的插核位置来培育有核珍珠。

2.根据权利要求1所述的用组织工程支架珠核培育珍珠的方法，其特征是，其包括以下步骤：

（2）制备珠核组织工程支架层模具：所述模具由模具Ⅰ和模具Ⅱ组成，模具Ⅰ由两个结构一样的中空半球构成，每个半球的内侧面有3条突起的棱，其中2条棱分别位于半球两侧边缘，另一条棱位于半球的中间，棱的长度为球体周长的1/2，3条棱的末端在球的南北极端相交，南极端相交处的棱切除部分形成凹口作为注胶孔，棱的高度（H）为0.02~2mm，边缘棱宽度为中间棱的一半；棱的作用在于支撑珍珠核，使将珍珠核放入模具后珍珠核与半球内面之间的高度一致，棱的高度（H）就是要填充的组织工程支架的厚度；使用时，先将珍珠核放入一个半球中，然后将另一半球合拢，两个半球的边缘棱在两半球合拢后其侧面拼接在一起合为一条宽度与中间棱宽度一样的棱，两个半球合拢成一个球体，棱一端的球面是封闭的，而位于棱另一端的球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注组织工程支架液，此端对接处的棱切除部分，留出孔道使组织工程支架液能从此孔道同时灌注到模具中被棱隔开的4个空间中；模具Ⅰ用于完成珍珠核组织工程支架制备的第一步，得到有凹槽的组织工程支架珍珠核；

先将步骤（1）处理好的珠核放置于模具Ⅰ中，将步骤⑶制备的胶原蛋白液灌注入模具，振荡摇匀，室温下静置6~24小时使胶原蛋白交联，降温至4℃、10分钟后使珠核脱模；然后打开模具Ⅰ取出珠核，再放置入模具Ⅱ中，使组织工程支架的凹槽的凹口处对准注胶孔，再注入步骤3）制备的液态胶原蛋白溶液，以使第一次注胶时留下的凹槽填满胶原蛋白液，室温下静置2~12小时使胶原蛋白交联；取出，将注胶孔处的表面磨平，在－20℃条件下放置1~6小时冷冻成型，然后放入冷冻干燥机中真空干燥2~24小时，真空度为12~20Pa，冻干温度为－20~－70℃;将珠核浸泡于蒸馏水中洗去残留的戊二醛，换洗多次以充分洗尽戊二醛；常温真空干燥抽去水分;将珠核浸泡于蚌血清或牛血清或马血清溶液中30分钟，在－20℃条件下冷冻2~4小时，然后放入冷冻干燥机真空干燥1~24小时，真空度为12~20Pa，冻干温度为－20~－70℃；

3.根据权利要求1所述的用组织工程支架珠核培育珍珠的方法，其特征是，其中所述的高分子聚合物指的是生物可降解天然高分子材料和生物可降解的合成高分子材料，所述的生物可降解天然高分子材料，包括胶原蛋白、明胶、海藻酸钠、纤维蛋白、琼脂糖、壳聚糖、透明质酸或它们与其他材料组成的复合物；所述生物可降解的合成高分子材料，包括聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA)和聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚乙烯醇(PVA)或它们与其他材料组成的复合物。