CN105255894A - 靶向性沉默RhoB的shRNA序列、引物、应用、shRNA慢病毒载体及构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种靶向性沉默RhoB的shRNA序列、引物、应用、shRNA慢病毒载体及构建方法，本发明针对Rho激酶信号通路的关键因子RhoB设计了shRNA序列，并构建了相应的shRNA慢病毒沉默载体。所述shRNA序列包含序列5’-CGTGTTCAGTAAGGACGAGTT-3’。通过实验结果证实本发明的shRNA能够显著沉默RhoB的表达。鉴于RhoB作为一种潜在的肺动脉高压治疗靶点，因此本发明的提供的RhoB的shRNA及其相关生物试剂，可用于研究和制备治疗肺动脉高压的相关疾病的药物。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和生物医药领域，主要涉及一种靶向性沉默RhoB的shRNA序列、引物、应用、shRNA慢病毒载体及构建方法。
背景技术
RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是一种在进化上保守的基因防御机制，即一种序列特异性的转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)。近年来，RNAi技术的发展不仅大大推进了人类后基因组计划，还能应用于高通量筛选药物靶基因，促进基因治疗和新药开发，为治疗癌症、遗传病等疾病开辟新途径。在过去的几年时间里，RNAi技术作为一种新基因疗法，已被广泛用于疾病的基因治疗研究领域，例如老年视黄斑退化、肌肉萎缩性侧索硬化症、类风湿性关节炎等。另外，在帕金森病等神经系统疾病以及肿瘤疾病等方面的治疗研究，也已经取得了有效成果。相比其它治疗手段，RNAi技术对致病基因的靶向性更强，毒副作用更低，因此开发更多的针对癌症的RNA干扰片段具有十分重要的意义。
肺动脉高压(pulmonaryarteryhypertension,PAH)是由不同病因导致的以肺血管阻力和肺动脉压力升高为特征的致命性疾病，素有“心血管系统的恶性肿瘤”之称。目前可行的治疗方法有限、昂贵并伴有明显的副作用。临床数据根据表明，Rho激酶活性在肺动脉高压(pulmonaryarteryhypertension,PAH)患者中明显增高，且与PAH的严重性及持续时间相关。由此可见，Rho/Rho激酶信号通路在PAH形成中具有重要作用。研究发现，Rho/Rho激酶信号通路的异常活化，与血管痉挛、动脉硬化、心力衰竭、心肌梗死、高血压及心绞痛等心血管疾病的发生及发展关系密切，因此该信号通路可以作为心血管疾病治疗的突破口。动物及临床试验发现，使用通过抑制Rho/Rho激酶信号通路的关键因子，可以有效降低肺动脉压力，改善右心室肥厚指数，抑制PAH的发展。
目前只有盐酸法舒地尔作为Rho激酶抑制剂上市应用于临床，但临床应用Rho激酶抑制剂存在很多潜在的不良反应，原因主要有：Rho激酶在组织细胞中广泛分布，并且抑制不同组织细胞的Rho激酶会产生不同的生理作用；现有的Rho激酶抑制剂在抑制Rho激酶同时，对其他蛋白激酶也有抑制作用。
因此，现有技术还有待于改进和发展，需研发出效果更好的Rho激酶抑制剂，提高其对Rho激酶的专属性和对不同组织细胞的选择性。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种靶向性沉默RhoB的shRNA序列、引物、应用、shRNA慢病毒载体及构建方法，旨在解决现有Rho激酶抑制剂对Rho激酶的专属性和对不同组织细胞的选择性不够好的问题。
本发明的技术方案如下：
一种靶向性沉默RhoB的shRNA序列，其中，包含针对RhoB基因(GeneID：388)设计的siRNA，其对应的靶位点序列：5’-CGTGTTCAGTAAGGACGAGTT-3’。
一种用于制备如上所述的shRNA序列的引物，其中，引物序列如下：
上游引物序列shRhoB-P1：5'-ACCGCGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAACACG-3'；
下游引物序列shRhoB-P2：5'-AAAACGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAACACG-3'。
一种shRNA慢病毒载体，其中，所述shRNA慢病毒载体用于表达如上所述的shRNA序列，所述shRNA慢病毒载体包含沉默目的基因RhoB的靶位点序列5’-CGTGTTCAGTAAGGACGAGTT-3’。
所述的shRNA慢病毒载体，其中，所述shRNA慢病毒载体中包含采用以下引物退火合成得到的shRhoB序列；引物序列如下：
上游引物序列shRhoB-P1：5'-ACCGCGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAACACG-3'；
下游引物序列shRhoB-P2：5'-AAAACGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAACACG-3'。
一种如上所述的shRNA慢病毒载体的构建方法，其中，包括以下步骤：
采用引物退火合成shRNA序列；其中，上游引物序列shRhoB-P1：5'-ACCGCGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAACACG-3'；下游引物序列shRhoB-P2：5'-AAAACGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAACACG-3'；
将合成的shRNA序列连接到shRNA慢病毒载体上；
转入大肠杆菌感受态细胞stable3，涂LB-Amp平板培养过夜，随机挑取一个单克隆进行测序验证，构建得到用于表达靶向性沉默RhoB的shRNA序列的shRNA慢病毒载体。
所述的shRNA慢病毒载体的构建方法，其中，将合成的shRNA序列连接到shRNA慢病毒载体上的过程包括以下步骤：
以pCDF1-MCS2-EF1-copGFP载体为模板，PCR扩增得到EF1-copGFP片段，用MluI和AfeI双酶切PCR产物，插入到同样经过MluI和AfeI双酶切的慢病毒载体pLVX-Puro上，得到载体骨架pLVX-EF1-copGFP-PGK-Puro；
用ClaI和XhoI双酶切载体骨架pLVX-EF1-copGFP-PGK-Puro，去磷酸后电泳回收；用ClaI和XhoI双酶切U6启动子，与酶切后的载体pLVX-EF1-copGFP-Puro连接；
PCR扩增大肠杆菌ccdB致死基因，用XhoI和MluI双酶切后，与经过XhoI和MluI双酶切的pLVX-U6-EF1-copGFP-PGK-Puro载体连接，得到用于表达shRhoB的shRNA慢病毒载体pLVX-U6-ccdB-EF1-copGFP-PGK-Puro；
用BsmBI单酶切shRNA慢病毒载体pLVX-U6-ccdB-EF1-copGFP-PGK-Puro，将退火合成的shRhoB序列与pLVX-U6-EF1-copGFP-PGK-Puro载体骨架通过相应的酶切位点连接。
一种如上所述的靶向性沉默RhoB的shRNA序列的应用，其中，将所述shRNA序列用于制备抑制RhoB基因表达的生物制剂。
所述的靶向性沉默RhoB的shRNA序列的应用，其中，所述shRNA序列用于制备治疗肺动脉高压的药物。
有益效果：本发明针对Rho激酶信号通路的关键因子RhoB设计了shRNA序列，并构建了相应的shRNA慢病毒沉默载体。通过实验结果证实本发明的shRNA能够显著沉默RhoB的表达。鉴于RhoB作为一种潜在的肺动脉高压治疗靶点，因此本发明的提供的RhoB的shRNA及其相关生物试剂，可用于研究和制备治疗肺动脉高压的相关疾病的药物。同时，本发明证实抑制RhoB基因表达可抑制人肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的异常增殖和迁移，证明RhoB是一种潜在的治疗肺动脉高压的新型靶点，有利于进一步研究由Rho/Rho激酶信号通路异常激活所引起的疾病包括心血管疾病、神经系统疾病和肿瘤相关疾病发生发展机制。
附图说明
图1为本发明实施例4中shRhoB对PASMC中RhoB基因的沉默效果图。
图2A～2B为本发明实施例5的结果图，显示shRhoB能显著抑制PASMC的异常增殖。其中，图2A荧光显微镜下观察PASMC细胞增殖实验的结果图，图2B为根据荧光显微镜观察结果，对细胞计数后分析增殖的检测结果图。
图3为本发明实施例6的结果图，显示shRNA能明显降低PASMC的迁移率。图中显示了PASMC的经常氧和缺氧不同处理状态下的细胞迁移率比较，还显示了缺氧条件下shcontrol和shRhoB慢病毒载体后细胞迁移率的变化。
具体实施方式
本发明提供一种靶向性沉默RhoB的shRNA序列、引物、应用、shRNA慢病毒载体及构建方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明公开了一种靶向性沉默RhoB的shRNA序列，及其相应shRNA双链的引物、shRNA慢病毒载体及其构建方法。所述shRhoB慢病毒表达载体经过慢病毒包装后，感染目的细胞PASMC，能显著沉默RhoB的表达，抑制Rho信号通路活性，还能通过下调RhoB抑制缺氧引起的PASMC异常增殖，并降低缺氧条件下PASMC的迁移率。该shRhoB通过靶向性抑制Rho/Rho激酶信号通路的关键因子RhoB，能有效降低肺动脉平滑肌细胞的异常增殖和迁移，作为Rho激酶抑制剂的一种，可用于研究肺动脉高压的治疗和相关新药开发。
具体地，所述靶向性沉默RhoB的shRNA序列包含针对RhoB基因(GeneID：388)设计的siRNA的靶序列：5’-CGTGTTCAGTAAGGACGAGTT-3’(SEQIDNO:1)。
本发明中还提供制备所述靶向性沉默RhoB的shRNA序列的引物序列，引物序列如下：
上游引物序列shRhoB-P1：5'-ACCGCGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAACACG-3'(SEQIDNO:2)；
下游引物序列shRhoB-P2：5'-AAAACGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAACACG-3'(SEQIDNO:3)。
本发明中还提供表达所述靶向性沉默RhoB的shRNA序列的shRNA慢病毒载体。进一步地，所述shRNA慢病毒载体中包括采用上述引物序列退火合成得到的shRNA序列。
本发明中还提供所述靶向性沉默RhoB的shRNA慢病毒载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建载体骨架pLVX-EF1-copGFP-Puro：
以pCDF1-MCS2-EF1-copGFP(SBI公司)载体为模板，PCR扩增得到EF1-copGFP片段(引物序列见表1)，用MluI和AfeI双酶切PCR产物，插入到同样经过MluI和AfeI双酶切的慢病毒载体pLVX-Puro(Clontech公司)上，得到载体骨架pLVX-EF1-copGFP-PGK-Puro。
表1用于扩增EF1-copGFP的寡核苷酸引物
| 引物名称 | 引物序列 |
| EF1-copGFP-F | CGACGCGTCGAAGGATCTGCGATCGCTCCG |
| EF1-copGFP-R | AGCGCTTTAGCGAGATCCGGTGGAGCCGG |
(2)插入启动子U6：
用ClaI和XhoI双酶切步骤(1)得到的载体pLVX-EF1-copGFP-PGK-Puro，去磷酸后电泳回收；用ClaI和XhoI双酶切U6启动子的PCR产物后(引物序列见表2)，与载体pLVX-EF1-copGFP-Puro连接，转入大肠杆菌感受态细胞中，涂LB-Amp平板，培养过夜，鉴定后得到的载体为pLVX-U6-EF1-copGFP-PGK-Puro。
表2用于扩增U6启动子的寡核苷酸引物
| 引物名称 | 引物序列 |
| U6-ClaI-F | CCATCGATGGAAGGTCGGGCAGGAAGAGG |
| U6-XhoI-R | CCGCTCGAGCGGTCGTCCTTTCCACAA |
(3)插入ccdB序列得到shRNA慢病毒载体：
以pLenti6载体(Invitrogen公司)为模板，PCR扩增大肠杆菌ccdB致死基因的片段，在ccdB两端分别引入BsmBI酶切位点，将扩增的到的ccdB用XhoI和MluI双酶切后，与经过XhoI和MluI双酶切的pLVX-U6-EF1-copGFP-PGK-Puro载体连接，转入大肠杆菌感受态细胞中，涂LB-Amp-Chl平板，培养过夜，进行菌落PCR及酶切鉴定，得到用于表达shRhoB的shRNA慢病毒载体pLVX-U6-ccdB-EF1-copGFP-PGK-Puro。
(4)构建用于靶向性沉默shRhoB的shRNA慢病毒载体
采用引物退火合成所述shRNA序列；其中，上游引物序列shRhoB-P1：5'-ACCGCGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAACACG-3'；下游引物序列shRhoB-P2：5'-AAAACGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAACACG-3'。用BsmBI单酶切shRNA慢病毒载体pLVX-U6-ccdB-EF1-copGFP-PGK-Puro，得到pLVX-U6-EF1-copGFP-PGK-Puro载体骨架，将退火合成的shRhoB序列与pLVX-U6-EF1-copGFP-PGK-Puro载体骨架通过相应的酶切位点连接，转入大肠杆菌感受态细胞stable3，涂LB-Amp平板37℃培养过夜，挑取单克隆进行测序，构建得到用于靶向性沉默RhoB的shRNA慢病毒载体pLVX-U6-shRhoB-EF1-copGFP-PGK-Puro。
本发明中还提供所述靶向性沉默RhoB的shRNA序列的应用，将所述shRNA序列用于制备抑制RhoB基因表达的生物制剂。由于所述shRNA序列可通过抑制Rho/Rho激酶信号通路的异常活化，可用于制备肺动脉高压等疾病的药物。
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例中所用的实验材料来源见表3所示。
表3实验材料及来源
实施例1：构建用于表达shRNA的慢病毒骨架载体
(1)构建载体骨架pLVX-EF1-copGFP-Puro：
以pCDF1-MCS2-EF1-copGFP(SBI公司)载体为模板，PCR扩增得到EF1-copGFP片段(引物序列见表1)，用MluI和AfeI双酶切PCR产物，插入到同样经过MluI和AfeI双酶切的慢病毒载体pLVX-Puro(Clontech公司)上，得到载体骨架pLVX-EF1-copGFP-PGK-Puro。
(2)插入启动子U6：
用ClaI和XhoI双酶切步骤(1)得到的载体pLVX-EF1-copGFP-PGK-Puro，去磷酸后电泳回收；用ClaI和XhoI双酶切U6启动子的PCR产物后(引物序列见表2)，与载体pLVX-EF1-copGFP-Puro连接，转入大肠杆菌感受态细胞中，涂LB-Amp平板，培养过夜，鉴定后得到的载体为pLVX-U6-EF1-copGFP-PGK-Puro。
(3)插入ccdB序列得到shRNA慢病毒载体：
以pLenti6载体(Invitrogen公司)为模板，PCR扩增大肠杆菌ccdB致死基因，在ccdB两端分别引入BsmBI酶切位点，将扩增的到的ccdB用XhoI和MluI双酶切后，与经过XhoI和MluI双酶切的pLVX-U6-EF1-copGFP-PGK-Puro载体连接，转入大肠杆菌感受态细胞中，涂LB-Amp-Chl平板，培养过夜，进行菌落PCR及酶切鉴定，得到用于表达shRhoB的shRNA慢病毒载体pLVX-U6-ccdB-EF1-copGFP-PGK-Puro。
实施例2：针对RhoB基因设计siRNA和shRNA序列
本实施例首先针对基因RhoB(GeneID：338)设计siRNA序列，并合成相应的shRNA寡核苷酸引物，引物序列如表4所示。
表4用于退火合成shRhoB序列的寡核苷酸引物
按照表5的体系进行加样并混合，均匀混合后，置于沸水中，静置待其降至室温(4-6h)。
表5shRhoB引物形成双链的退火体系
| 试剂 | 用量(μL) |
| shRhoB-P1(10μM) | 5 |
| shRhoB-P2(10μM) | 5 |
| 1M NaCl | 3 |
| ddH2O | 7 |
| Total | 20 |
实施例3：构建靶向性沉默RhoB基因的shRNA慢病毒载体
用BsmBI单酶切实施例1中构建的shRNA慢病毒载体pLVX-U6-ccdB-EF1-copGFP-PGK-Puro，切胶回收后，将实施例1中退火合成的shRhoB双链与pLVX-U6-EF1-copGFP-PGK-Puro载体骨架通过相应的酶切位点连接，转入大肠杆菌感受态细胞stable3，涂LB-Amp平板37℃培养过夜，挑取单克隆进行测序，构建靶向性沉默RhoB基因的shRhoB慢病毒载体pLVX-U6-shRhoB-EF1-copGFP-PGK-Puro。
实施例4：shRhoB慢病毒表达载体对目的基因RhoB的沉默效果
使用实施例3制备的shRhoB慢病毒表达载体进行慢病毒包装，感染PASMC上，通过WesternBlot对目的基因RhoB进行沉默效果的验证，具体包括以下步骤：
1.shRhoB慢病毒干扰载体的慢病毒包装：
(1.1)使用无四环素的培养液培养293T细胞，转染细胞前一天接种293T细胞于100mm板(10mL无四环素DMEM)，培养12～24h。
(1.2)待细胞的密度达到80-90％，该转染体系每组需要的质粒混合液为17.1μg包装质粒(Addgene公司)和6.9μgpLVX-U6-shRhoB-EF1-copGFP-PGK-Puro的shRNA慢病毒重组质粒，将上述质粒充分混匀后，补加NaCl(150mM)使终体积为500μL；每组需要转染试剂63μLPEI+437μLNaCl(150mM)，终体积为500μL。实验以针对非靶基因序列的shcontrol慢病毒载体为对照。
(1.3)分别将转染试剂与质粒混合液充分混匀，室温静置10min。
(1.4)将体积为1mL的混合液逐滴缓缓滴加到100mm的培养皿中，37℃培养箱培养8-12h后，换新鲜的无四环素培养液；为了提高病毒的浓度，换液时可以改为8mL培养液。
(1.5)再培养48h后收集上清，换成新鲜的无四环素培养液于培养皿中。3500rpm离心10min，收集的上清液，即相应的病毒液。
(1.6)每管平均分装约700μL到1.5mL灭菌的EP管中。72h后同样方法处理，收集病毒上清液。
2.PASMC的细胞培养
细胞培养：PASMC(人肺动脉平滑肌原代细胞)均购自Lonza(Walkersville，MD)，于含有5％FBS的SmGM-2完全培养基(Lonza)中培养，收集生长状态良好的细胞，离心计数，以6×105每孔接种于60mm皿内，37℃，5％CO2培养24h。
3.shRhoB慢病毒感染PASMC：
(3.1)将PASMC种于6孔板，细胞密度为1.5×105个细胞/孔。
(3.2)培养12～24h后，分别用500μLDMEM+500μLshRhoB慢病毒液+0.5μLpolybrene(聚凝胺，终浓度为10μg/μL)的混合液感染PASMC。以针对非靶基因序列的shcontrol慢病毒表达载体及慢病毒，作为基因shRhoB慢病毒表达载体及慢病毒的对照，感染PASMC。
(3.3)感染病毒24h后换新鲜培养液。
(3.4)细胞感染病毒72h后，观察荧光，并加入终浓度为1μg/μL的嘌呤霉素(puromycin)培养液继续培养细胞，直至筛选出稳定感染shRhoB慢病毒的细胞系。
4.Westernblot检测蛋白质的表达水平：
(4.1)裂解稳定感染shRhoB、shcontrol慢病毒的PASMC，收集蛋白样品，进行蛋白质定量后，取40μg的蛋白质样品上样，在100v恒压进行SDS-PAGE电泳。
(4.2)转膜：200mA恒流1.5h，转膜后，将膜放置于5％脱脂奶粉封闭液中封闭1h，再用TBST将膜洗两遍。
(4.3)加入用3％脱脂奶粉配制的ID1一抗(1:1000稀释)，放置于摇床中，4℃过夜。
(4.4)第二天用TBST将膜洗三次，每次5min，加入用3％脱脂奶粉配制的二抗(1:5000稀释)，置室温杂交1h后进行显色(或化学发光自显影反应)。
结果如图1所示，与感染了shcontrol慢病毒的对照组相比，感染了shRhoB慢病毒的PASMC中的RhoB表达量均有明显的下调，说明使用本发明设计的shRNA引物制备得到的shRhoB及其慢病毒表达载体，对于PASMC的RhoB有明显的沉默作用。
实施例5：shRhoB能抑制PASMC的增殖
细胞增殖实验：由于缺氧条件会促进PASMC的增殖，而缺氧亦能使RhoB的表达水平较常氧相比发生明显上调。所以，为探讨下调RhoB表达对PASMC的调控作用，本实施例以PASMC作为实验组，在实施例3成功验证本发明设计的shRhoB对RhoB中有显著下调的基础上，在缺氧条件下分别转染实施例3中的shcontrol、shRhoB慢病毒表达载体，然后通过EdU细胞增殖检测法确定细胞的增殖水平。使用EdU细胞增殖检测试剂盒(锐博生物)进行EdU标记，根据试剂盒说明书进行实验操作。简略的说，接种约1×104个细胞于48孔板，培养24h后即进行转染实验，第二天缺氧或常氧下培养24h，然后加入20μMEdU继续培养24h。细胞取出后用4％多聚甲醛室温固定30min，0.5％TritonX-100透化10min，PBS清洗细胞，然后每孔细胞加入150μL1×Apollo染色反应液反应30min。DNA用1×Hochest33342(150μL每孔)染色5min，在荧光显微镜下拍照。结果表明，在缺氧条件下，与shcontrol组相比，转染shRhoB慢病毒表达载体后，使PASMC的增殖下降50％，如图2A～2B所示，其中，图2A荧光显微镜下观察的PASMC的结果图，图2B为根据荧光显微镜观察结果，对细胞计数后分析增殖的检测结果图。该实验结果证实，使用本发明设计的shRhoB及其慢病毒表达载体能显著下调PASMC中RhoB的表达水平，可以抑制缺氧引起的PASMC异常增殖。
实施例6：shRhoB能抑制PASMC的迁移
细胞迁移实验：为探讨通过shRhoB慢病毒载体下调RhoB的表达后，对PASMC迁移过程中的影响，本实施例采用侵袭小室(Transwell)方法对PASMC的迁移情况进行评估。侵袭小室(CorningLifeSciences，3422)的孔径是8μm。操作步骤，简要地说，首先将PASMC种于12孔板，细胞生长达到70％时进行转染，使用脂质体法将shcontrol和shRhoB慢病毒表达载体分别转入细胞，第二天收集细胞并计数；接种5×104个细胞于小室中，小室加入250μLSmGM-2完全培养基，底部加入750μLSmGM-2完全培养基，接种后的第二天将小室培养基更换成含0.5％FBS的SmGM-2培养基进行饥饿，常氧或缺氧培养24h，结晶紫染色观察迁移到小室底部的细胞，计数分析。实验结果显示，与常氧培养相比，缺氧刺激24h可使PASMC迁移率增加；而在缺氧刺激的条件下，与shcontrol相比，转染了shRhoB慢病毒表达载体的PASMC迁移率明显降低，如图3所示，图中显示了PASMC的经常氧和缺氧不同处理状态下的细胞迁移率比较，还显示了缺氧条件下shcontrol和shRhoB慢病毒载体后细胞迁移率的变化。
综上所述，本发明针对Rho激酶信号通路的关键因子RhoB设计了shRNA序列，并构建了相应的shRNA慢病毒沉默载体。通过实验结果证实本发明的shRNA能够显著沉默RhoB的表达。鉴于RhoB作为一种潜在的肺动脉高压治疗靶点，因此本发明的提供的RhoB的shRNA及其相关生物试剂，可用于研究和制备治疗肺动脉高压的相关疾病的药物。另外，本发明证实抑制RhoB基因表达可抑制人肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的异常增殖和迁移，证明RhoB是一种潜在的治疗肺动脉高压的新型靶点，有利于进一步研究由Rho/Rho激酶信号通路异常激活所引起的疾病包括心血管疾病、神经系统疾病和肿瘤相关疾病发生发展机制。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (8)
1.一种靶向性沉默RhoB的shRNA序列，其特征在于，其中包含用于沉默目的基因RhoB的靶位点序列5’-CGTGTTCAGTAAGGACGAGTT-3’。
2.一种用于制备如权利要求1所述的shRNA序列的引物，其特征在于，引物序列如下：
上游引物序列shRhoB-P1：5'-ACCGCGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAACACG-3'；
下游引物序列shRhoB-P2：5'-AAAACGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAACACG-3'。
3.一种shRNA慢病毒载体，其特征在于，所述shRNA慢病毒载体用于表达如权利要求1所述的shRNA序列，所述shRNA慢病毒载体中包含用于沉默目的基因RhoB的靶位点序列5’-CGTGTTCAGTAAGGACGAGTT-3’。
4.根据权利要求3所述的shRNA慢病毒载体，其特征在于，所述shRNA慢病毒载体中包含采用以下引物退火合成得到的shRNA序列；引物序列如下：
上游引物序列shRhoB-P1：5'-ACCGCGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAACACG-3'；
下游引物序列shRhoB-P2：5'-AAAACGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAACACG-3'。
5.一种如权利要求4所述的shRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用引物退火合成shRNA序列；其中，上游引物序列shRhoB-P1：5'-ACCGCGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAACACG-3'；下游引物序列shRhoB-P2：5'-AAAACGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAACACG-3'；
将合成的shRNA序列连接到shRNA慢病毒载体上；
转入大肠杆菌感受态细胞stable3，涂LB-Amp平板培养过夜，随机挑取一个单克隆进行测序验证，构建得到用于表达靶向性沉默RhoB的shRNA序列的shRNA慢病毒载体。
6.根据权利要求5所述的shRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，将合成的shRNA序列连接到shRNA慢病毒载体上的过程包括以下步骤：
以pCDF1-MCS2-EF1-copGFP载体为模板，PCR扩增得到EF1-copGFP片段，用MluI和AfeI双酶切PCR产物，插入到同样经过MluI和AfeI双酶切的慢病毒载体pLVX-Puro上，得到载体骨架pLVX-EF1-copGFP-PGK-Puro；
用ClaI和XhoI双酶切载体骨架pLVX-EF1-copGFP-PGK-Puro，去磷酸后电泳回收；用ClaI和XhoI双酶切U6启动子，与酶切后的载体pLVX-EF1-copGFP-Puro连接；
PCR扩增大肠杆菌ccdB致死基因，用XhoI和MluI双酶切后，与经过XhoI和MluI双酶切的pLVX-U6-EF1-copGFP-PGK-Puro载体连接，得到用于表达shRhoB的shRNA慢病毒载体pLVX-U6-ccdB-EF1-copGFP-PGK-Puro；
用BsmBI单酶切shRNA慢病毒载体pLVX-U6-ccdB-EF1-copGFP-PGK-Puro，将退火合成的shRhoB序列与pLVX-U6-EF1-copGFP-PGK-Puro载体骨架通过相应的酶切位点连接。
7.一种如权利要求1所述的靶向性沉默RhoB的shRNA序列的应用，其特征在于，将所述shRNA序列用于制备抑制RhoB基因表达的生物制剂。
8.根据权利要求7所述的靶向性沉默RhoB的shRNA序列的应用，其特征在于，所述shRNA序列用于制备治疗肺动脉高压的药物。
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