CN105255798A - 尸毒梭菌菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

一种经分离的尸毒梭菌(Clostridium？cadaveris)菌株ITRI04005及其应用，该经分离的尸毒梭菌菌株ITRI04005寄存于德国国家菌种保藏中心(DSMZ)，寄存编号为DSM？32078。

Description

尸毒梭菌菌株及其应用

技术领域

本发明是关于一经分离的尸毒梭菌(Clostridiumcadaveris)菌株ITRI04005及其应用，尤其关于该尸毒梭菌菌株ITRI04005于进行发酵反应以生产有机化合物的应用，以及该尸毒梭菌菌株ITRI04005于基因改造的应用，包括：提供一可以表现或增强表现产醇路径酵素的基因的基因改造菌株、提供一减弱表现或不会表现参与乙酸合成的酵素的基因的基因改造菌株、以及提供一可以表现或增强表现热休克蛋白(heatshockprotein，HSP)的基因的基因改造菌株。

背景技术

以往关于梭菌属(Clostridiumsp.)细菌的研究，大多是集中在致病菌株的探讨。然而，近年来随着生质燃料(biofuel)的发展，有些适用于生产生质燃料的梭菌也逐渐受到重视，例如热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)具有强效的纤维素水解酶，其可直接利用纤维素产生乙醇与氢气。此可参见例如：Freier等人的文献(ApplEnvironMicrobiol.1988Jan；54(1):204-211)，该文献全文并于此处以供参考。又例如，将达梭菌(Clostridium.ljungdahlii)，其可以气体(例如一氧化碳或二氧化碳等碳氧化物加氢气)作为原料而产生乙醇。

尽管已有许多可用于生质燃料或化学品生产的菌株，但该等菌株一般是以发酵培养基中的醣类作为碳源，并以发酵培养基中的蛋白胨(peptone)作为氮源，在碳源及氮源缺一不可的情况下生产有机化合物，甚少菌株是可以利用不同类型的物质做为基质。此外，微生物经由发酵反应以代谢基质所产生的代谢产物通常为成分复杂的混合物，必须通过纯化分离程序以取得所欲的标的代谢物。例如，梭菌属(Clostridiumsp.)细菌通过丙酮-丁醇-乙醇(acetone-butanol-ethanol，ABE)发酵程序会产生丁醇、乙醇、及丙酮，并伴随少部分的有机酸(例如乙酸、丁酸)。另，微生物对于代谢产物的耐受性也是影响发酵反应的产率的重要因素。因此，业界仍需要可利用不同类型的基质且同时提供良好的目标产物产率的微生物，故致力于研究与开发可利用多元料源以生产化学品或生质燃料且具有高产物耐受性的菌株。

本发明即为针对上述需求所作的研究，本案发明人筛选得到一新颖的尸毒梭菌(Clostridiumcadaveris)菌株ITRI04005，此菌株除可利用醣类及/或胺基酸作为基质以生产有机化合物，其相较于其他已知的梭菌菌株更适合用于基因改造操作，以提供可利用醣类及/或胺基酸作为基质生产有机酸或醇、具有高产物专一性、及/或具有高产物耐受性的基因改造菌株，所获得的基因改造菌株可应用于利用多元料源以生产化学品或生质燃料，并提供良好的目标产物产率。

发明内容

本发明的一目的，在于提供一种经分离的尸毒梭菌(Clostridiumcadaveris)菌株ITRI04005，其寄存于德国国家菌种保藏中心(DSMZ)，寄存编号为DSM32078。该尸毒梭菌菌株ITRI04005具有如SEQIDNO:1所示的16S核糖体核糖核酸(16SrRNA)片段，或具有与SEQIDNO:1具至少95％相似度的16S核糖体核糖核酸(16SrRNA)片段。

本发明的另一目的，在于提供一种基因改造菌株，其是由尸毒梭菌菌株ITRI04005经基因改造而得。较佳地，该基因改造菌株具有如SEQIDNO:1所示的16S核糖体核糖核酸(16SrRNA)片段，或具有与SEQIDNO:1具至少95％相似度的16S核糖体核糖核酸(16SrRNA)片段。较佳地，该基因改造菌株符合以下的至少一条：

(1)可以表现或增强表现产醇路径酵素的基因；

(2)减弱表现或不会表现参与乙酸合成的酵素的基因；以及

(3)可以表现或增强表现热休克蛋白(heatshockprotein，HSP)的基因。

本发明的又一目的，在于提供一种生产有机酸的方法，其包含提供一基质，以及使上述的尸毒梭菌菌株ITRI04005及/或上述的基因改造菌株于厌氧氛围下利用该基质进行发酵反应以产生有机酸。

本发明的再一目的，在于提供一种生产醇的方法，其包含提供一基质，以及使上述的基因改造菌株于厌氧氛围下利用该基质进行发酵反应以产生醇。其中，该基因改造菌株可以表现或增强表现产醇路径酵素的基因。

本发明的详细技术内容及部分具体实施态样，将描述于以下内容中，以供本发明所属领域技术人员据以明了本发明的特征。

附图说明

图1是显示，于一厌氧氛围下，将尸毒梭菌菌株ITRI04005以及尸毒梭菌模式菌株(typestrain)BCRC14511培养于一葡萄糖浓度为5克/升的CGM培养基中，并于不同时间点所测得的OD₆₀₀数值的曲线图；

图2A及图2B是显示，于一厌氧氛围下，将尸毒梭菌菌株ITRI04005以及尸毒梭菌模式菌株BCRC14511培养于一培养基，进行发酵反应后，所测得的丁酸碳转化率的长条图，其中，图2A的培养基是一葡萄糖浓度为5克/升的CGM培养基，图2B的培养基是一葡萄糖浓度为3克/升且乳酸盐浓度为2克/升的CGM培养基；

图3所示为带有酒精去氢酶(alcoholdehydrogenase，adh)基因的pGE536重组质体；

图4所示为「pta-ack」基因片段经「catP」基因片段取代的pGE403转殖质体；

图5A及图5B所示分别为带有hsp18基因的pGE406重组质体以及带有「groESL」基因的pGE407重组质体；

图6是显示，于一厌氧氛围下，将尸毒梭菌菌株ITRI04005、ITRI05023、以及ITRI05025分别培养于一丁酸钠浓度为10克/升的CGM培养基中、或一不添加丁酸钠的CGM培养基中，进行发酵反应后，所测得的相对丁酸生成率的长条图；

图7A及图7B是显示，于一厌氧氛围下，将尸毒梭菌菌株ITRI04005以及ITRI05023培养于不同丁酸钠浓度的CGM培养基中，并于不同时间点所测得的OD₆₀₀数值的曲线图，其中，图7A的丁酸钠浓度为10克/升，图7B的丁酸钠浓度为15克/升。

具体实施方式

以下将描述根据本发明的部分具体实施态样；只是，在不背离本发明精神下，本发明尚可以多种不同形式的态样来实践，不应将本发明保护范围解释为限于说明书所陈述的。此外，除非文中有另外说明，于本说明书中(尤其是在权利要求书中)所使用的「一」、「该」及类似用语应理解为包含单数及复数形式。另，本文所使用的「约」、「大约」或「近乎」等词，实质上代表与所述的数值相差在20％以内，较佳在10％以内，且更佳在5％以内。

此外，于本发明中，所谓的「微生物」是指肉眼无法看见的生物体(例如：细菌、真菌)，其可包括于自然界中自然存在的野生型(wildtype)，以及因任何因素(天然或人为)所产生的突变型(mutant)。所谓「发酵反应」是指微生物代谢一或多种物质以产生有机化合物的过程。所谓「培养基」是指可提供微生物菌株生长、繁殖所需的养分与条件(如酸碱值、湿度等)的必要成分物质，通常是视所欲培养的微生物菌株而调整组成，例如可添加氯化氢、氢氧化钠、氢氧化铵(NH₄OH)、硫酸铵((NH₄)₂SO₄)、氯化铵(NH₄Cl)、乙酸铵、酸氢二钾(K₂HPO₄)、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)磷酸二氢钠(NaH₂PO₃)、磷酸氢二钠(Na₂HPO₃)、柠檬酸(citricacid)、含水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)、含水硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)、含水硫酸锰(MnSO₄·7H₂O)，以调整原料至一所欲的pH值(例如：pH5.5、pH6)，或调整其他物理、化学或生理性质。所谓「基质(substrate)」，是指能够在微生物发酵反应中作为原料，进入发酵反应的代谢路径而被转化为有机化合物的，本发明是使用含有例如醣类、胺基酸、或其组合的基质。

另，除非另外单独限定，否则于本说明书中所述的化学名称即指该化学名称的所有异构型式，举例来说，但不限于，镜像异构物(enantiomer)、非镜像异构物(diastereomer)及构形异构物(conformationalisomer)。举例来说，「乳酸」、「葡萄糖」、「木糖」、「半乳糖」等词即同时包括D型(Dform)及L型(Lform)异构物。当该醣类可同时存在开环及环状型式时，其椅型(chairform)的构形异构物及α、β异构物均包括在内。

于本说明书中，所谓「碳转化率」是指在发酵反应中，所生成的有机化合物的总碳数与所消耗碳源的总碳数的比值，以如下式1进行计算。

式1：

本案发明人自土壤样本中筛选出一种新颖的梭菌，经16S核糖体核糖核酸(16SrRNA)序列分析，依亲缘关系鉴定为Clostridiumcadaveris(中文名称为尸毒梭菌)，且经命名为ClostridiumcadaverisITRI04005(以下称为尸毒梭菌菌株ITRI04005)，其寄存于德国国家菌种保藏中心(DSMZ)，寄存编号为DSM32078。尸毒梭菌菌株ITRI04005具有如SEQIDNO:1所示的16S核糖体核糖核酸(16SrRNA)片段，或具有与SEQIDNO:1具至少95％相似度的16S核糖体核糖核酸(16SrRNA)片段。

经发现，本发明尸毒梭菌菌株ITRI04005相较于其他已知的梭菌菌株更适合用于基因改造操作。因此，本发明亦关于一种基因改造菌株，其是由尸毒梭菌菌株ITRI04005经基因改造而得。

于本发明中，所谓「基因改造」是指利用现代分子生物技术，以人为的方法修饰或改变一物种(例如：动物、植物、微生物、病毒)的遗传物质。可用于基因改造的手段包括，但不限于，基因剔除(knock-out)、基因删除(deletion)、基因静默(silencing)、基因减弱表现(attenuation)、基因过量表现(overexpression)等。

所谓「基因剔除」、「基因删除」、或「基因静默」是指经由例如突变、取代、删除、或加入一或多个核苷酸或整个基因片段等修饰方式，使一或多个内源性基因不会表现(即，阻断该一或多个内源性基因的表现)，而丧失该基因的功能。所谓「减弱表现」是指经由例如突变、取代、删除、或加入一或多个核苷酸或整个基因片段等修饰方式，使一或多个内源性基因的表现程度降低(即，阻断该一或多个内源性基因的部分表现或关键部分的表现)。所谓「基因过量表现」是指经由例如突变、取代、删除、或加入一或多个核苷酸或整个基因片段等修饰方式，使一或多个外源性基因可以表现，或使一或多个内源性基因的表现增强。

较佳地，根据本发明的经由基因改造尸毒梭菌菌株ITRI04005所得到的菌株符合以下的至少一条：(1)可以表现或增强表现产醇路径酵素的基因；(2)减弱表现或不会表现参与乙酸合成的酵素的基因；以及(3)可以表现或增强表现热休克蛋白(heatshockprotein，HSP)的基因。其中，该产醇路径酵素的基因的例子包括，但不限于，酒精去氢酶基因(alcoholdehydrogenase，adh)、乙醛去氢酶基因(aldehydedehydrogenase，ald)、乙醛/酒精去氢酶基因(aldehyde/alcoholdehydrogenase，aad)、及丁醇去氢酶基因(butanoldehydrogenase，bdh)；该参与乙酸合成的酵素的基因的例子包括，但不限于，磷酸乙酰转移酶基因(phosphateacetyltransferase，pta)、及乙酸激酶基因(acetatekinase，ack)；该热休克蛋白的基因的例子包括，但不限于，热休克蛋白18基因(heatshockprotein18，hsp18)、及groESL基因。

较佳地，本发明的基因改造菌株具有如SEQIDNO:1所示的16S核糖体核糖核酸(16SrRNA)片段，或具有与SEQIDNO:1具至少95％相似度的16S核糖体核糖核酸(16SrRNA)片段。

经发现，本发明的尸毒梭菌菌株ITRI04005以及符合(2)减弱表现或不会表现参与乙酸合成的酵素的基因及/或(3)可以表现或增强表现热休克蛋白(heatshockprotein，HSP)的基因的基因改造菌株，皆具有生产有机酸的能力。因此，本发明亦提供一种生产有机酸的方法，其包含：提供一基质；以及使该尸毒梭菌菌株ITRI04005及/或基因改造菌株，于厌氧氛围下利用该基质进行发酵反应，以产生有机酸。较佳地，该方法所生成的有机酸是C1-C4的有机酸，例如：乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、及其组合。于本发明一具体实施态样中，该有机酸主要是丁酸。

如后附实施例所示，若使一根据本发明的减弱表现或不会表现参与乙酸合成的酵素的基因的基因改造菌株，于厌氧氛围下利用一基质进行发酵反应，于所产生的有机酸中，该基因改造菌株相较于未经改造的野生型菌株，具有较高的丁酸与乙酸的比值(butyrate/acetateratio，B/Aratio)。具体来说，在该基因改造菌株所产生的有机酸中，丁酸与乙酸的比值大于10。

另一方面，亦经发现，根据本发明的表现或增强表现产醇路径酵素的基因的基因改造菌株，具有将有机酸进一步转化为醇的能力。因此，本发明尚提供一种生产醇的方法，其包含：提供一基质；以及使该表现或增强表现产醇路径酵素的基因的基因改造菌株，于厌氧氛围下利用该基质进行发酵反应，以产生醇。较佳地，该方法所生成的醇是乙醇、异丙醇、及/或丁醇。于本发明一具体实施态样中，该醇主要是丁醇。

于根据本发明的生产有机酸或生产醇的方法中，所涉的厌氧氛围是指氧气含量低于5ppm(partpermillion)，较佳低于0.5ppm，更佳低于0.1ppm的氛围。可采用任何合宜的手段以提供所欲的厌氧氛围。举例来说，但不以此为限，可于发酵反应进行之前，先于发酵反应容器中通入惰性的气体(例如：氮气或二氧化碳)且进行曝气，以排出存在于该反应容器中的空气，提供所欲的厌氧氛围；或者，于厌氧操作箱中进行发酵反应，厌氧操作箱是采用钯催化剂将密闭箱体内的氧气与厌氧混合气体中的氢气催化生成水，从而提供所欲的厌氧氛围。

此外，于根据本发明的生产有机酸或生产醇的方法中，所涉发酵反应的基质含有醣类、胺基酸、或其组合；较佳地，该基质至少含有胺基酸；更佳地，该基质同时含有醣类及胺基酸。

适用于本发明方法的基质的醣类的例子包括，但不限于，单醣(例如：葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、半乳糖(galactose)、甘露糖(mannose)、阿拉伯糖(arabinose)、来苏糖(lyxose)、核糖(ribose)、木糖(xylose)、核酮糖(ribulose)、木酮糖(xylulose)、阿洛糖(allose)、阿卓糖(altrose)、古洛糖(gulose)、艾杜糖(idose)、塔罗糖(talose)、阿洛酮糖(psicose)、山梨糖(sorbose)、塔格糖(tagatose))；双醣(例如：蔗糖(sucrose)、麦芽糖(maltose)、乳糖(lactose)、乳酮糖(lactulose)、海藻糖(trehalose)、纤维二糖(cellobiose))；寡糖(例如：水苏糖(stachyose)、麦芽三糖(maltotriose)、麦芽四糖(maltotetrose)、麦芽五糖(maltopentaose))；以及多醣(例如：淀粉、纤维素、肝糖、环糊精(cyclodextrin)、阿拉伯聚糖(arabinoxylans)、关华豆胶(guargum)、阿拉伯胶(gumarabic)、几丁质(chitin)、树胶(gum)、海藻酸盐(alginate)、果胶(pectin)、结冷胶(gellan))。于本发明一具体实施态样中，是使用含有葡萄糖的基质，以提供发酵反应所需的碳源。

在微生物生长、繁殖的过程中，胺基酸一般是作为蛋白质合成所需的氮源。然而，不同于前述用途，在根据本发明的生产有机酸或生产醇的方法中，是使用含有胺基酸的基质，作为发酵反应所需的碳源。举例来说，合宜的胺基酸来源包括酵母萃取物(yeastextract)、蛋白水解物、及蛋白胨(peptone)、玉米浆(cornsteepliquor)、乳清(whey)、豆粕、鱼粉、肉骨粉、酵母粉、豆粉，但不以为限。于本发明一具体实施态样中，是使用含有蛋白胨的基质，以提供发酵反应所需的碳源。

于本发明的生产有机酸或生产醇的方法中，基质与菌株的混合顺序并无特殊限制。可于发酵反应开始之前或发酵反应进行过程中，视需要一次性地或多次分批地添加基质，且可视需要补充菌株。例如，可于发酵反应进行前，即一次性地将基质与菌株混合；也可将基质分为等量或不等量的二或多批，于发酵反应开始之前或发酵反应进行过程中，分批加入发酵反应器中。

视需要地，可于进行本发明的生产有机酸或生产醇的方法之前，先对本发明的尸毒梭菌菌株ITRI04005及/或基因改造菌株进行前培养，以使菌株生长直到对数生长期(logphase)。再使用该经前培养的菌株以进行发酵反应，生产所欲的有机酸或醇。

兹以下列实施例进一步例示说明本发明。其中该等实施例仅提供作为说明，而非用以限制本发明的保护范围。本发明保护范围如权利要求书所示。

实施例

于以下实施例中，所使用物料的组成分别如下：

(a)CGM(ClostridialGrowthMedium)培养基(酵母萃取物：5克/升；蛋白胨：5克/升；硫酸铵((NH₄)₂SO₄)：3克/升；酸氢二钾(K₂HPO₄)：1.5克/升；含水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)：0.6克/升；含水硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)：0.03克/升；pH6.0)。

(b)RCM(ReinforcedClostridialMedium)培养基(肉类萃取物：10克/升；蛋白胨：10克/升；酵母萃取物：3克/升；D(+)葡萄糖：10克/升；氯化钠：5克/升；乙酸钠：3克/升；L-半胱胺酸盐酸盐(L-cysteinehydrochloride)：0.5克/升；淀粉：1克/升；琼脂：0.5克/升；pH6.8)。

(c)P2培养基(酵母萃取物：5克/升；乙酸铵：2.2克/升；含水硫酸锰(MnSO₄·7H₂O)：0.0.1克/升；氯化钠：1克/升；含水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)：0.2克/升；含水硫酸铁：0.01克/升；磷酸二氢钾(KH₂PO₄)：0.75克/升；磷酸氢二钾：0.75克/升；对胺苯甲酸(p-aminobenzoicacid，PABA)：0.001克/升；生物素：0.0001克/升；pH6.0)。

于以下实施例中，是以如下操作，于所使用的气密容器(例如气密瓶、离心管)中提供厌氧氛围。将气密容器与橡胶塞以铝箔包覆，并以高温高压(121℃，1.2大气压)灭菌，确保不会受其他微生物的干扰。于气密容器完成灭菌后，以烘箱去除外部残余水气，防止残余水气于操作时造成微生物污染。经由厌氧操作箱附属的传递箱，将烘干的气密容器送入厌氧操作箱内，稍微松开封口的铝箔后，以厌氧操作设备内附属的钯催化剂(购自Thermoscientific公司，产品编号：BR0042)，催化氧气与厌氧混合气体中的氢气生成水，从而将气密容器中的氧气去除，以提供厌氧氛围。

于以下实施例中，是以如下操作提供经除氧的培养基。将配置好的培养基，以高温高压(121℃，1.2大气压)灭菌，并于培养基尚未冷却至室温前，经由厌氧操作箱附属的传递箱将培养基送入厌氧操作箱内，稍微松开盛装培养基的容器的上盖，让水蒸气释出，并藉由厌氧操作设备内附属的钯催化剂，催化氧气与厌氧混合气体中的氢气生成水，从而提供经除氧的培养基。

实施例1：新颖菌株的筛选

(1-1)筛选方法

取一土壤样本，封存于装有50毫升无菌水的密闭血清瓶中，然后置于预热至70℃的水浴槽中加热历时10分钟。待冷却至室温后，于其中加入等量的两倍浓度且不含醣类碳源的CGM培养基，并添加经灭菌的L-半胱胺酸盐酸盐(L-cysteineHCl)溶液至浓度达0.005％(重量/体积)，以去除残余氧气、加速菌株的生长。

之后，将上述经除氧的样本置于37℃的厌氧培养箱中培养并观察，当样本开始产生气体时，以聚合酶连锁反应(PCR，polymerasechainreaction)搭配表1所示的特异性引子进行菌种侦测。其中，EuB968F/Univer1392R引子对可广泛性侦测该培养基中是否有细菌存在，Clo16S-degF1/Clo16S-deg-R1引子对则可侦测该培养基中是否有梭菌属(Clostirdiumsp.)细菌。

于确认样本中有侦测到梭菌属细菌后，将样本混合均匀，并以微量吸管进行序列稀释，然后取稀释倍率10,000倍、100,000倍、及1,000,000倍的稀释液分别涂抹于不含醣类碳源的CGM培养基琼脂平板上(CGM培养基添加琼脂：15克/升)，并置于37℃的厌氧培养箱中培养直到出现单一菌落(singlecolony)。接着，为确认所挑选的菌株的单一性，使用无菌接种环挑选不同型态的单一菌落，分别于RCM培养基琼脂平板(RCM培养基添加琼脂：15克/升)上进行四区画线，再置于37℃的厌氧培养箱中培养直到单一菌落出现。

经以上述不含醣类碳源的选择性培养基进行菌株筛选，可筛选到非利用醣类碳源可生长的梭菌，又，上述不含醣类碳源的选择性培养基的主要成分为蛋白水解物或胺基酸，故可筛选到可利用胺基酸作为碳源而生长的菌株。

表1

引子名称	引子的核苷酸序列	序列编号
			EuB 968F	5'-AACGCGAAGAACCTTAC-3'	SEQ ID NO:2
Univer 1392R	5'-ACGGGGGGTGTGTAC-3'	SEQ ID NO:3
			Clo16S-deg F1	5'-GCGGCGTGCYTAAYACATGC-3'	SEQ ID NO:4

Clo16S-deg-R1

5'-GGGTTGCGCTCGTTGCRGGA-3'

SEQ ID NO:5

(1-2)菌种鉴定

对上述(1-1)所获得的具单一性的菌株进行基因族谱分析(phylogeneticanalysis)，确认该标的菌株具有如SEQIDNO:1所示的16S核醣体核醣核酸(16SrRNA)片段。经NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)线上资料库比对，该SEQIDNO:1与尸毒梭菌(Clostridiumcadaveris)菌株的16S核醣体核醣核酸(16SrRNA)片段具有约99％的相似度，故依亲缘关系鉴定该标的菌株为尸毒梭菌，且命名为尸毒梭菌菌株ITRI04005。

以肉眼观察尸毒梭菌菌株ITRI04005的外观，其菌落外围平滑，且菌落具有光泽并呈土黄色。于显微镜下观察尸毒梭菌菌株ITRI04005的型态，其为长杆菌，具游动性，会产生内胞子，胞子位于两端呈纺锤状。

(1-3)分析尸毒梭菌菌株ITRI04005的生理特性

(1-3-1)生长速率

(A)前培养

取尸毒梭菌菌株ITRI04005以及尸毒梭菌模式菌株BCRC14511的单一菌落，分别接种于10毫升的经除氧的RCM培养基中，并置于37℃的厌氧培养箱中培养历时约12至14小时，以使菌株进入对数生长中期(mid-logphase)(即，OD₆₀₀(波长为600奈米时的吸光度值)为约1.0至1.2时)。

(B)测量生长曲线

混合葡萄糖与CGM培养基，以提供一葡萄糖浓度为5克/升的混合培养基(pH为6.0)，并对该混合培养基进行除氧。

于二气密瓶中分别注入100毫升前述经除氧的混合培养基，之后，分别于其中接种前述经前培养的尸毒梭菌菌株ITRI04005以及尸毒梭菌模式菌株BCRC14511，并调整培养的起始菌液浓度，使两者的OD₆₀₀均至约0.1后，置于37℃的厌氧培养箱中培养，且定时取样并测量OD₆₀₀。结果示于图1。

由图1可知，以葡萄糖浓度为5克/升的混合培养基进行培养，尸毒梭菌菌株ITRI04005与尸毒梭菌模式菌株BCRC14511的生长速率并不相同。此结果显示，尸毒梭菌菌株ITRI04005与尸毒梭菌模式菌株BCRC14511是不同的菌株。

(1-3-2)原料利用与产物

分别将CGM培养基与表2所示的不同碳源混合，以提供碳源浓度为5克/升的不同的混合培养基，并对该等混合培养基进行除氧，其后，分别于50毫升的离心管中注入40毫升经除氧的混合培养基，并于其中接种尸毒梭菌菌株ITRI04005，且于37℃的厌氧培养箱中培养历时24小时。取样并对样本进行离心(0℃，12,000g，5分钟，离心机购自KubotaCo.)，利用0.22微米的滤膜去除菌体后，以Agilent1100系列高效能液相层析(highperformanceliquidchromatography，HPLC)搭配AminexHPX-87H(300mmx7.8mm)管柱分析所得滤液中的成分，并定量丁酸及总产物的含量，结果皆示于表2。

由表2可知，在培养尸毒梭菌菌株ITRI04005的培养基中，即使只添加含有酵母萃取物与蛋白水解物的基质，仍可侦测到丁酸的产出。此结果显示，尸毒梭菌菌株ITRI04005可于没有醣类的条件下，以胺基酸作为基质进行发酵作用，将胺基酸转化为丁酸等产物。

表2

(1-4)尸毒梭菌菌株ITRI04005与尸毒梭菌模式菌株BCRC14511的比较

(1-4-1)碳转化率的比较

(A)前培养

取尸毒梭菌菌株ITRI04005以及尸毒梭菌模式菌株BCRC14511的单一菌落，分别接种于10毫升的经除氧的RCM培养基中，并置于37℃的厌氧培养箱中培养历时约12至14小时，以使菌株进入对数生长中期(即，OD₆₀₀为约1.0至1.2时)。

(B)进行发酵反应

混合葡萄糖与CGM培养基，以提供一葡萄糖浓度为5克/升的混合培养基(pH为6.0)，并以20毫莫耳浓度(mM)的MES缓冲液(购自Sigma-Aldrich)调控培养基的pH值，其后，对该混合培养基进行除氧。

于二50毫升的离心管中分别注入40毫升前述经除氧的混合培养基，之后，分别于其中以约5％的接种率接种经前述(A)前培养的尸毒梭菌菌株ITRI04005以及尸毒梭菌模式菌株BCRC14511，置于37℃的厌氧培养箱中培养。待该二菌株皆生长至OD₆₀₀为约1.4后，取样并以Agilent1100系列高效能液相层析仪搭配AminexHPX-87H(300mmx7.8mm)管柱分析并计算前述培养基中葡萄糖的消耗量及丁酸的产量，结果示于表3。另以式2计算其碳转化率，结果示于表3及图2A。

式2

表3

由表3及图2A可知，于含有葡萄糖的CGM培养基中，尸毒梭菌菌株ITRI04005所提供的丁酸碳转化率约70％，而尸毒梭菌模式菌株BCRC14511所提供的丁酸碳转化率约56％。前述结果显示，本发明尸毒梭菌菌株ITRI04005可提供较佳的碳转化率。

(1-4-2)基质代谢能力的比较

(A)前培养

取尸毒梭菌菌株ITRI04005以及尸毒梭菌模式菌株BCRC14511的单一菌落，分别接种于10毫升的经除氧的RCM培养基中，并置于37℃的厌氧培养箱中培养历时约12至14小时，以使菌株进入对数生长中期(即，OD₆₀₀为约1.0至1.2时)。

(B)进行发酵反应

混合葡萄糖、乳酸盐(lactate)、及CGM培养基，以提供一葡萄糖浓度为3克/升且乳酸盐浓度为2克/升的混合培养基(pH为6.0)，并以20毫莫耳浓度(mM)的MES缓冲液调控培养基的pH值，其后，对该混合培养基进行除氧。

于二50毫升的离心管中分别注入40毫升前述经除氧的混合培养基，之后，分别于其中以5％的接种率接种经前述(A)前培养的尸毒梭菌菌株ITRI04005以及尸毒梭菌模式菌株BCRC14511，置于37℃的厌氧培养箱中进行发酵反应，历时11小时，取样并以Agilent1100系列高效能液相层析仪搭配AminexHPX-87H(300mmx7.8mm)管柱分析并计算前述培养基中葡萄糖、乳酸的消耗量以及丁酸的产量，结果示于表4。另以式3计算其碳转化率，结果示于表4及图2B。

式3

表4

由表4及图2B可知，于相同的培养条件下，尸毒梭菌模式菌株BCRC14511仅可代谢约0.5克/升的乳酸，尸毒梭菌菌株ITRI04005则可代谢约1.1克/升的乳酸。另一方面，于含有葡萄糖及乳酸的情况下，尸毒梭菌菌株ITRI04005所提供的丁酸碳转化率约65％，而尸毒梭菌模式菌株BCRC14511所提供的丁酸碳转化率约55％。前述结果显示，相较于尸毒梭菌模式菌株BCRC14511，本发明的尸毒梭菌菌株ITRI04005具有较佳的乳酸代谢能力且可提供较佳的碳转化率。

实施例2：制备基因改造菌株

(2-1)「可以表现或增强表现产醇路径的基因」的基因改造菌株

(2-1-1)质体转殖与验证

以聚合酶连锁反应搭配表5所示的专一性引子扩增酒精去氢酶基因(alcoholdehydrogenase，adh)(基因来源为丙酮丁醇梭菌ATCC824，所用的专一性引子为#232及#233)，并选殖(clone)至梭菌的穿梭载体，以制备一带有酒精去氢酶基因(adh)的pGE536重组质体(如图3所示)，再以电穿孔基因转型技术(每一脉冲：电压(2.5kV)；电阻(600Ω)；电容(25μF))将该pGE536质体送入尸毒梭菌菌株ITRI04005，以获得一基因改造菌株。接着，以含有红霉素(erythromycin)的RCM培养基进行筛选，可存活于前述培养基的即可能带有pGE536重组质体的菌株。

以含有红霉素的RCM培养基培养上述筛选所得的菌株后，进行质体DNA萃取，再以聚合酶连锁反应搭配表5所示的专一性引子扩增质体DNA中红霉素抗性基因(ermb)的部分片段(所使用的专一性引子为#164及#165)以及酒精去氢酶基因(adh)的部分片段(所使用的专一性引子为#45及#284)，并进行琼脂胶体电泳，以确认是否有专一性的聚合酶连锁反应产物。

经上述的质体DNA萃取以及搭配专一性引子的聚合酶连锁反应，确认该筛选所得的菌株中带有pGE536质体，即，该基因改造菌株确实带有酒精去氢酶基因(adh)(即，可以表现或增强表现产醇路径的基因)，将其命名为尸毒梭菌菌株ITRI05007。

表5

(2-1-2)测试基因改造菌株于生产丁醇的效益

(A)前培养

混合红霉素、葡萄糖与RCM培养基，以提供一红霉素浓度为40微克/毫升及葡萄糖10克/升的混合培养基，并对该培养基进行除氧，其后，于二50毫升的离心管中分别注入20毫升经除氧的混合培养基，分别于其中接种尸毒梭菌菌株ITRI04005(作为「控制组」，其带有不含酒精去氢酶基因(adh)的载体)及ITRI05007(带有pGE536质体)，并置于37℃的厌氧培养箱中培养历时约16至18小时，使菌株生长直到对数生长期后期或迟滞期前期(即，OD₆₀₀为约1.6至2.0时)。

(B)混合培养基的制备

混合葡萄糖与P2培养基，以提供一葡萄糖浓度为10克/升的混合培养基，并对该混合培养基进行除氧。另外，混合葡萄糖、蛋白胨、P2培养基，以提供一葡萄糖浓度为10克/升且蛋白胨浓度为5克/升的混合培养基，并对该混合培养基进行除氧。

(C)原料利用与产物

于二气密瓶中分别注入50毫升的葡萄糖浓度为10克/升的混合培养基，分别于其中接种前述经前培养的尸毒梭菌菌株ITRI04005以及ITRI05007，并置于37℃的厌氧培养箱中培养。于培养的第0小时及第15小时进行取样，并对该样本进行离心(0℃，12,000g，5分钟，离心机购自KubotaCo.)，利用0.22微米的滤膜去除菌体后，以Agilent1100系列高效能液相层析搭配AminexHPX-87H(300mmx7.8mm)管柱分析所得滤液中的成分，并定量葡萄糖、乙酸、丁酸、及丁醇的含量。结果皆示于表6。重复前述步骤，但以葡萄糖浓度为10克/升且蛋白胨浓度为5克/升的混合培养基进行。结果示于表7。

由表6可知，于仅添加有葡萄糖的培养基中进行培养约15小时后，尸毒梭菌菌株ITRI04005的丁醇产量为0克/升，尸毒梭菌菌株ITRI05007的丁醇产量则为1.1克/升。前述结果显示，相较于尸毒梭菌菌株ITRI04005无法于发酵反应中以葡萄糖为基质生成丁醇，本发明尸毒梭菌菌株ITRI05007可有效利用葡萄糖进行发酵反应，生产丁醇。

另一方面，由表7可知，于同时添加有葡萄糖及蛋白胨的培养基中进行培养约15小时后，尸毒梭菌菌株ITRI05007的丁醇产量可提升至约2.5克/升。前述结果显示，除了以葡萄糖作为基质，尸毒梭菌菌株ITRI05007更可利用胺基酸作为基质进行发酵反应，生产更多的丁醇，具有优异的丁醇产率。

表6

表7

(2-2)「减弱表现或不会表现参与乙酸合成的酵素的基因」的基因改造菌株

(2-2-1)质体转殖与验证

以聚合酶链锁反应搭配表8所示的专一性引子(即，#338及#339)扩增尸毒梭菌菌株ITRI04005的基因体(genomic)DNA中由磷酸乙酰转移酶基因(phosphateacetyltransferase，pta)上游第1270个碱基对(basepair，bp)至乙酸激酶基因(acetatekinase，ack)下游第1263个碱基对的DNA片段(下简称「pta-ack」片段」)，并以琼脂胶体电泳纯化分离该「pta-ack」片段。另外，以聚合酶链锁反应搭配表8所示的XmaI切位的引子(即，#340；#211)扩增氯霉素(Chloramphenicol)抗性基因(catP)的DNA片段(下简称「catP」片段」)，并以琼脂胶体电泳纯化分离该「catP」片段。接着，将「pta-ack」片段及「catP」片段分别转殖(clone)至pCR2.1载体(vector)中，以获得pGE401及pGE402质体，再以限制酶(即，XmaI)进行基因片段的酶切(enzymedigestion)与连接(ligation)，获得pta-ack基因剔除用的自杀质体pGE403(如图4所示)。

再以电穿孔基因转型技术(每一脉冲：电压(2.5kV)；电阻(600Ω)；电容(25μF))将该pGE403质体送入尸毒梭菌菌株ITRI04005中，并经由同源基因重组(homologousrecombination)，将氯霉素抗性基因(catP)插入并取代尸毒梭菌菌株ITRI04005基因体上的pta-ack基因，以进行pta-ack基因的剔除。接着，以含5微克/毫升甲磺氯霉素(thiamphenicol)的RCM培养基筛选出具甲磺氯霉素抗性的菌株，并以南方墨点法(Southernhybridization)筛选并验证上述具甲磺氯霉素抗性的菌株，以确认其基因体中的pta-ack基因已被catP基因取代，即，已完成pta-ack基因的剔除。

经上述的南方墨点法(Southernhybridization)确认该菌株的基因体中的pta-ack基因已被catP基因取代，即该基因改造菌株确实已剔除pta及ack基因(即，减弱表现或不会表现参与乙酸合成的酵素的基因)，将其命名为尸毒梭菌菌株ITRI05027。

表8

引子名称	引子的核苷酸序列	序列编号
			#338	5'-TATGGCAGCACCTTTAGAGT-3'	SEQ ID NO:12
#339	5'-ATTATAGGGGCTAAAGCTGG-3'	SEQ ID NO:13
			#340	5'-CCCGGGTGATTGTTATGGATTATAAG-3'	SEQ ID NO:14
#211	5'-CCCGGGTTAACTATTTATCAATTCC-3'	SEQ ID NO:15

(2-2-2)测试基因改造菌株的发酵产物专一性

(A)前培养

混合甲磺氯霉素5微克/毫升与RCM培养基，以提供一RCM-Tm混合培养基，并对RCM培养基及RCM-Tm混合培养基进行除氧，其后，于二50毫升的离心管中分别注入30毫升经除氧的RCM培养基及RCM-Tm混合培养基。接着，分别于其中接种尸毒梭菌菌株ITRI04005及ITRI05027，并置于37℃的厌氧培养箱中进行培养历时约16至18小时，使菌株生长直到对数生长期后期或迟滞期前期(即，OD₆₀₀为约1.6至2.0时)。

(B)混合培养基的制备

混合葡萄糖与CGM培养基，以提供一葡萄糖浓度为10克/升的CGM混合培养基，另混合葡萄糖、甲磺氯霉素与CGM培养基，以提供一葡萄糖浓度为10克/升且甲磺氯霉素5微克/毫升的CGM-Tm混合培养基，并对该二混合培养基进行除氧。

(C)发酵产物专一性测试

于二50毫升的离心管中分别注入30毫升上述的CGM混合培养基及CGM-Tm混合培养基。接着，分别于其中接种前述经前培养的尸毒梭菌菌株ITRI04005及ITRI05027，并置于37℃的培养箱中进行培养历时约48小时。于无菌操作台内进行取样，且对该取样的样本进行离心(0℃，12,000g，5分钟，离心机购自KubotaCo.)，并利用0.22微米的滤膜去除菌体后，以Agilent1100系列高效能液相层析搭配AminexHPX-87H(300mmx7.8mm)管柱分析所得滤液中的成分，计量葡萄糖消耗量以及丁酸、乙酸的产量，并计算丁酸与乙酸的比值(butyricacid/acetateratio，B/Aratio)，结果均示于表9。

由表9可知，尸毒梭菌菌株ITRI05027于发酵反应进行后所得的丁酸与乙酸的比值高于尸毒梭菌菌株ITRI04005。前述结果显示，相较于尸毒梭菌菌株ITRI04005，尸毒梭菌菌株ITRI05027具有较佳的发酵产物专一性。

表9

(2-3)「可以表现或增强表现热休克蛋白(heatshockprotein，HSP)的基因」的基因改造菌株

(2-3-1)质体转殖与验证

以聚合酶链锁反应搭配表10所示的专一性引子(即，#354(带有AatII限制酶切位)；#355(带有AscI限制酶切位))，扩增尸毒梭菌菌株ITRI04005的基因体DNA中groESL基因的DNA片段，并以琼脂胶体电泳纯化分离该「groESL」片段。另外，以聚合酶链锁反应搭配表10所示的专一性引子(即，#356(带有AatII限制酶切位)；#357(带有AscI限制酶切位))，扩增尸毒梭菌菌株ITRI04005的基因体DNA中hsp18基因的DNA片段，并以琼脂胶体电泳纯化分离该「hsp18」片段。接着，将「groESL」片段及「hsp18」片段分别转殖至pCR2.1载体中。再以AatII及AscI限制酶将「hsp18」片段及「groESL」片段分别重组至穿梭载体(shuttlevector)，得到pGE406及pGE407重组质体(如图5A、图5B所示)。抽取重组质体并以电穿孔基因转型技术(每一脉冲：电压(2.5kV)；电阻(600Ω)；电容(25μF))将该pGE406重组质体以及pGE407重组质体分别送入尸毒梭菌菌株ITRI04005。

接着，利用含有红霉素(最终浓度为50微克/毫升)的RCM培养基进行筛选，可存活于前述培养基的即为可能带有前述pGE406重组质体或pGE407重组质体的基因改造菌株。

然后，以表10所示的专一性引子(扩增groESL基因片段的引子：#354、#355；扩增hsp18基因片段的引子：#356、#357)对上述二基因改造菌株进行菌落PCR(colonyPCR)，并进行琼脂胶体电泳，确认是否有专一性的聚合酶连锁反应产物。经由上述的专一性引子搭配聚合酶连锁反应，确认菌株中带有pGE406质体或pGE407质体，即，该二基因改造菌株确实带有hsp18基因或groESL基因(即，可以表现或增强表现热休克蛋白的基因)，将其分别命名为尸毒梭菌菌株ITRI05023(可以表现或增强表现hsp18基因)及尸毒梭菌菌株ITRI05025(可以表现或增强表现groESL基因)。

表10

引子名称	引子的核苷酸序列	序列编号
			#354	5'-GGGACGTCATGTTTGATTTAGTACCTTT-3'	SEQ ID NO:16
#355	5'-GGGCGCGCCCTAGTGGATATCTATAGA-3'	SEQ ID NO:17
			#356	5'-GGGACGTCATGAATATTAGACCACTTGG-3'	SEQ ID NO:18
#357	5'-GGGCGCGCCTTAGTACATTCCATCCATA-3'	SEQ ID NO:19

(2-3-2)测试基因改造菌株对发酵产物的耐受性

(A)前培养

混合红霉素、葡萄糖与RCM培养基，以提供一红霉素浓度为50微克/毫升且葡萄糖10克/升的混合培养基，并对该培养基进行除氧，其后，于三50毫升的离心管中分别注入20毫升前述经除氧的混合培养基，接着，分别于其中接种尸毒梭菌菌株ITRI04005(作为「控制组」，其带有不含欲转殖的基因的载体)、ITRI05023(带有pGE406质体)、以及ITRI05025(带有pGE407质体)，并置于37℃的厌氧培养箱中进行培养历时约14至16小时，使菌株生长直到对数生长中期(即，OD₆₀₀为约1.0至1.2时)

(B)混合培养基的制备

混合葡萄糖、红霉素、以及CGM培养基，以提供一葡萄糖浓度为10克/升且红霉素浓度为50微克/毫升的混合培养基，并对该混合培养基进行除氧，另混合葡萄糖、红霉素、以及CGM培养基，以提供一葡萄糖浓度为5克/升且红霉素浓度为50微克/毫升的混合培养基，并对该混合培养基进行除氧。

(C)发酵产物耐受性测试(1)

于三50毫升的离心管中分别注入25毫升的前述经除氧的混合培养基(葡萄糖浓度为10克/升)，接着，分别于其中接种上述经前培养的尸毒梭菌菌株ITRI04005、ITRI05023、以及ITRI05025，并置于37℃的厌氧培养箱中进行培养，历时约6小时。接着，分别于该三菌株的培养基中加入丁酸钠，使培养液中的丁酸钠浓度为10克/升(称为「加入丁酸钠」实验组)。于37℃的厌氧培养箱中进行发酵反应，历时约32小时。此外，以Agilent1100系列高效能液相层析仪搭配AminexHPX-87H(300mmx7.8mm)管柱分析前述培养基中的有机化合物的成分，并定量培养基中丁酸的含量，经计算并扣除所添加的丁酸的含量，获得所额外生成的丁酸含量。

重复前述实验，但未于培养基中加入丁酸钠，此为「未加入丁酸钠」的控制组。

将「未加入丁酸钠」控制组的丁酸生成率设为100％，以计算「加入丁酸钠」实验组的相对丁酸生成率(百分比)，结果示于图6。

由图6可知，相较于「未加入丁酸钠」控制组的尸毒梭菌菌株ITRI04005，「加入丁酸钠」实验组的尸毒梭菌菌株ITRI04005的丁酸生成率降低20％。然而，相较于「未加入丁酸钠」控制组的尸毒梭菌菌株ITRI05025，「加入丁酸钠」实验组的尸毒梭菌菌株ITRI05025的丁酸生成率则仅降低4％。此外，相较于「未加入丁酸钠」控制组的尸毒梭菌菌株ITRI05023，「加入丁酸钠」实验组的尸毒梭菌菌株ITRI05023的丁酸生成率不仅没有降低，甚至高出约10％。前述结果显示，相较于未经基因改造的菌株，基因改造后的尸毒梭菌菌株ITRI05023及ITRI05025皆具有较佳的发酵产物耐受性。

(C)发酵产物耐受性测试(2)

将前述经除氧的混合培养基(葡萄糖浓度为5克/升)以每孔1.5毫升的体积分注于24孔盘(24-wellplate)，另添加丁酸钠于该混合培养基中，浓度为10克/升，接着，以2％的接种比例分别于其中接种前述经前培养的尸毒梭菌菌株ITRI04005以及ITRI05023，并置于可控温(37℃)且可提供厌氧氛围的TECAN微量盘侦测仪中，以进行培养且每30分钟测量OD₆₀₀，以监测菌株的生长情形。结果示于图7A。重复前述实验，但使培养液中的丁酸钠浓度为15克/升，结果示于图7B。

由图7A及图7B可知，无论丁酸钠于培养液中的浓度为10克/升或15克/升，相较于尸毒梭菌菌株ITRI04005，尸毒梭菌菌株ITRI05023的生长速率皆明显较佳。前述结果再次说明，相较于未经基因改造的野生型菌株，本发明的「可以表现或增强表现热休克蛋白」的基因改造菌株具有较佳的发酵产物耐受性。

由以上实验结果可知，本发明的尸毒梭菌菌株ITRI04005可以醣类及/或胺基酸作为基质进行发酵反应，生成有机酸或醇等产物，为一可利用多元料源以生产化学品或生质燃料的菌株。此外，通过基因改造，可以由本发明尸毒梭菌菌株ITRI04005提供可利用醣类及/或胺基酸作为基质进行发酵反应而生产有机酸或醇、具有高发酵产物专一性、及/或具有高产物耐受性的基因改造菌株，有益于提供良好的目标产物产率。

以上仅为本发明的较佳实施例，不得以此限定本发明实施的保护范围，因此凡参考本发明的说明书内容所作的简单等效变化与修饰，仍属本发明的保护范围。

菌种保藏信息

保藏的生物材料：ITRI04005

保藏机构：德国国家菌种保藏中心DSMZ(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)

保藏编号：DSM32078

保藏日期：2015年6月26日

保藏机构地址：7B

38124Braunschweig

GERMANY。

Claims (16)

1.一种经分离的尸毒梭菌(Clostridiumcadaveris)菌株ITRI04005，其寄存于德国国家菌种保藏中心(DSMZ)，寄存编号为DSM32078。

2.一种基因改造菌株，其是由如权利要求1所述的尸毒梭菌菌株ITRI04005经基因改造而得。

3.如权利要求2所述的基因改造菌株，其特征在于，该基因改造菌株符合以下的至少一条：

(1)可以表现或增强表现产醇路径酵素的基因；

(2)减弱表现或不会表现参与乙酸合成的酵素的基因；以及

(3)可以表现或增强表现热休克蛋白(heatshockprotein，HSP)的基因。

4.如权利要求3所述的基因改造菌株，其特征在于，该产醇路径酵素的基因是以下的至少一种：酒精去氢酶基因(alcoholdehydrogenase，adh)、乙醛去氢酶基因(aldehydedehydrogenase，ald)、乙醛/酒精去氢酶基因(aldehyde/alcoholdehydrogenase，aad)、及丁醇去氢酶基因(butanoldehydrogenase，bdh)。

5.如权利要求3所述的基因改造菌株，其特征在于，该参与乙酸合成的酵素的基因是以下的至少一种：磷酸乙酰转移酶基因(phosphateacetyltransferase，pta)、及乙酸激酶基因(acetatekinase，ack)。

6.如权利要求3所述的基因改造菌株，其特征在于，该热休克蛋白的基因是以下的至少一种：热休克蛋白18基因(heatshockprotein18，hsp18)、及groESL基因。

7.如权利要求3所述的基因改造菌株，其特征在于，其可以表现或增强表现产醇路径酵素的基因。

8.如权利要求3所述的基因改造菌株，其特征在于，其减弱表现或不会表现参与乙酸合成的酵素的基因及/或可以表现或增强表现热休克蛋白(heatshockprotein，HSP)的基因。

9.如权利要求2所述的基因改造菌株，其特征在于，其具有如SEQIDNO:1所示的16S核糖体核糖核酸(16SrRNA)片段或与SEQIDNO:1具至少95％相似度的16S核糖体核糖核酸(16SrRNA)片段。

10.一种生产有机酸的方法，其特征在于，其包含:

提供一基质；以及

使如权利要求1的尸毒梭菌菌株ITRI04005及/或如权利要求8的基因改造菌株，于厌氧氛围下利用该基质进行发酵反应，以产生有机酸。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该有机酸是丁酸。

12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，当使如权利要求8的基因改造菌株，于厌氧氛围下利用该基质进行发酵反应，产生有机酸，且该基因改造菌株减弱表现或不会表现参与乙酸合成的酵素的基因，其中该有机酸中丁酸与乙酸的比值(butyrate/acetateratio，B/Aratio)大于10。

13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该基质含有醣类、胺基酸、及/或其组合。

14.一种生产醇的方法，其特征在于，其包含:

提供一基质；以及

使如权利要求7的基因改造菌株，于厌氧氛围下利用该基质进行发酵反应，以产生醇。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，该基质含有醣类、胺基酸、及/或其组合。

16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，该醇是丁醇。