CN105254711A

CN105254711A - 一种kpc碳青霉烯酶抑制肽及其应用

Info

Publication number: CN105254711A
Application number: CN201510689211.5A
Authority: CN
Inventors: 沈秉正; 高翔; 祝成亮; 宋金春; 曾智; 彭燕
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2015-10-22
Filing date: 2015-10-22
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2035-10-22
Also published as: CN105254711B

Abstract

本发明公开了一种KPC碳青霉烯酶抑制肽及其应用，属于生物医药领域。本发明的KPC碳青霉烯酶抑制肽的氨基酸序列为Pro-Asn-Gln-Trp，通过固相合成法可制备得到，其对KPC碳青霉烯酶具有明显的抑制作用。本发明的抑制肽与β-内酰胺类抗生素联合使用可避免抗生素被酶水解破坏而失效，可用于制备预防和/或治疗耐药菌感染疾病的药物和/或抗菌药物。本发明的KPC碳青霉烯酶抑制肽具有较强的酶抑制活性，溶血活性低，人工合成便捷，适合产业化，为开发新的抗菌药物及复方制剂提供了新的选择，在治疗耐药菌感染领域具有良好的开发前景。

Description

一种KPC碳青霉烯酶抑制肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种KPC碳青霉烯酶抑制肽及其应用。

背景技术

2013年美国疾病预防与控制中心宣布优先研发用于治疗耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(Carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE)的抗菌药物。其原因在于产KPC碳青霉烯酶(KlebsiellapneumoniaeCarbapenemase，KPC)的CRE菌的出现及扩散，严重降低了β-内酰胺类抗菌药物(包括碳青霉烯类抗生素)的临床疗效，使得临床上治疗耐药菌感染面临严峻考验。CREs往往对于大多数抗生素均耐药，令医务人员头疼的是这一类耐药菌有时仅对毒性较大的抗菌剂多黏菌素敏感。

在CREs中，产KPC-2酶的克雷伯菌属(Klebsiellaspp.)最为普遍，且在希腊曾出现过爆发性流行(MaltezouHC,GiakkoupiP,MaragosA,etal.OutbreakofinfectionsduetoKPC-2-producingKlebsiellapneumoniaeinahospitalinCrete(Greece)[J].JournalofInfection,2009,58(3):213-219)。KPC-1碳青霉烯酶于1996年在美国北卡罗来纳州分离得到的K.peneumoniae中首次被发现。编码KPC-2的基因存在于可转移质粒的Tn3家族转座子内。到目前为止已经发现了十余种KPC酶的亚型，如表1(纪明宇,耿大影,裴凤艳,等.KPC碳青霉烯酶研究概况及进展[J].临床检验杂志,2013,31(4):282-285)。KPC碳青霉烯酶不仅能水解包括青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、单环类等所有类型的β-内酰胺类抗生素，而且同时能够灭活克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦等β-内酰胺酶抑制剂。

表1KPC酶种类、发现时间和地点

目前临床上使用的β-内酰胺酶抑制剂(克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦)，对于不断出现的新β-内酰胺酶的抑制效果越来越不明显，因此迫切需要一种可以用于治疗因产KPC碳青霉烯酶而耐药的病原菌引起的细菌感染的KPC碳青霉烯酶抑制剂。临床分离获得的产碳青霉烯酶的耐药菌株中，以产KPC-2酶的多药耐药菌株最为常见。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种KPC碳青霉烯酶抑制肽。

本发明的另一目的在于提供上述KPC碳青霉烯酶抑制肽的应用。将本发明的KPC碳青霉烯酶抑制肽与β内酰胺类抗生素合用，可显著提高β内酰胺类抗生素的抗菌活性。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种KPC碳青霉烯酶抑制肽，为4个氨基酸组成的线性小肽，其氨基酸序列为Pro-Asn-Gln-Trp，理论分子量591.58，化学结构式如图1所示。

上述KPC碳青霉烯酶抑制肽可通过固相合成法制备，方法简单，技术成熟、产物质量容易控制，能满足大规模工业化生产的需要。

上述KPC碳青霉烯酶抑制肽在抑制KPC碳青霉烯酶中的应用。

上述KPC碳青霉烯酶抑制肽在制备预防和/或治疗耐药菌感染相关疾病的药物和/或抗菌药物中的应用。所述的耐药菌为因产KPC碳青霉烯酶而获得耐药性的细菌，所述的抗菌为抗因产KPC碳青霉烯酶而获得耐药性的细菌。

一种抗菌药物组合物，包含所述的KPC碳青霉烯酶抑制肽，还包含该抑制肽药学上可接受的盐和/或药学上可接受的载体。

所述的KPC碳青霉烯酶抑制肽与β-内酰胺类抗生素具有良好的协同作用，能明显抑制耐药菌生长并且大幅度降低β-内酰胺类抗生素的最小抑菌浓度(MIC)。该抑制肽通过抑制KPC碳青霉烯酶活性从而保护β-内酰胺类抗生素的药效结构——β内酰胺环免于被该类酶水解从而发挥抗生素的抗菌活性。

一种抗菌药物组合物，包含所述的KPC碳青霉烯酶抑制肽和β-内酰胺类抗生素，还包含该抑制肽和β-内酰胺类抗生素药学上可接受的盐和/或药学上可接受的载体。将本发明的抑制肽与β内酰胺类抗生素合用能更有效的抑制耐药菌的生长。

所述的β-内酰胺类抗生素优选为氨苄西林、阿莫西林、哌拉西林、替卡西林、氟氧头孢、头孢替唑、头孢噻肟、头孢曲松钠、头孢他啶、头孢吡肟、头孢洛林、亚胺培南、美罗培南、比阿培南、多尼培南、厄他培南、氨曲南中的一种或多种。更优选的，所述的β-内酰胺类抗生素为美罗培南。

通过溶血实验表明，所述的KPC碳青霉烯酶抑制肽在浓度高达7.5mg/mL时未发生明显的溶血反应，其安全性高。

上述抗菌药物组合物可以根据药学领域的常规制剂方法制备成注射剂、片剂、注射用无菌粉末、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂等多种剂型。该抗菌药物组合物可以通过注射、口服、滴鼻、滴眼、物理或化学介导的方法导入肌肉、内皮、皮下、静脉或粘膜组织，或是被其他物质混合或包裹后导入肌体。

本发明具有如下优点与效果：本发明的KPC碳青霉烯酶抑制肽具有良好的KPC碳青霉烯酶抑制活性，且安全性高；其人工合成方便，生产成本低，适合工业化大规模生产；将该抑制肽与β-内酰胺类抗生素联合使用可避免抗生素被酶水解破坏而失效，在治疗耐药菌感染领域具有良好的开发前景；本发明的KPC碳青霉烯酶抑制肽为开发新的抗菌药物及复方制剂提供了新的选择。

附图说明

图1是KPC碳青霉烯酶抑制肽Pro-Asn-Gln-Trp的化学结构式图。

图2是制备的KPC碳青霉烯酶抑制肽Pro-Asn-Gln-Trp的质谱结果图。

图3是KPC碳青霉烯酶抑制肽Pro-Asn-Gln-Trp对KPC-2碳青霉烯酶抑制活性的测定结果图；图中，KPC-2酶：KPC-2碳青霉烯酶，抑制肽：KPC碳青霉烯酶抑制肽。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。其中

下属实施例中表达KPC-2碳青霉烯酶的工程菌E.coliRosetta(DE3)/pET28a-KPC-2的构建及该酶的表达纯化方法如下：

根据GenBank中编码KPC-2碳青霉烯酶的基因(bla_KPC-2基因)全序列(GenBankID:KJ151293.1)，用PrimerPremier5设计PCR引物，上下游引物序列分别为：KPC-2-F：5'-CGCGGATCCATGTCACTGTATCGCC-3'(下划线部分为BamHⅠ酶切位点)；KPC-2-R：5'-CCAAGCTTTTTACTGCCCGTTGACGC-3'(下划线部分为HindⅢ酶切位点)。bla_KPC-2DNA模板由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

通过PCR扩增bla_KPC-2基因，PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性0.5min，54℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃再延伸10min。PCR扩增产物经电泳鉴定后测序。

将经PCR扩增产物及pET28a空质粒分别经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，用核酸凝胶回收试剂盒回收bla_KPC-2基因片段和质粒片段。用T4DNALigase将bla_KPC-2基因与pET28a质粒片段于16℃连接12h。连接产物转化至E.coliRosetta(DE3)感受态细胞中。

挑取测序正确的阳性单克隆菌株E.coliRosetta(DE3)/pET28a-KPC-2，接种于新配的灭菌LB液体培养基中(含50mg/mLKanamycin)，以E.coliRosetta(DE3)/pET28a作为阴性对照，37℃、200r/min培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入终浓度为0.2mmol/LIPTG诱导表达，28℃继续培养6h。取1mL菌液于EP管中，8000r/min离心2min，弃去上清，收集菌体沉淀，SDS-PAGE检测。

将500mL诱导表达的菌液于4℃、10000r/min冷冻离心20min，弃去培养基，收集菌体，以每克湿菌加入10mL缓冲液(30mmol/LNaH₂PO₄，100mmol/LNaCl，pH7.5)的比例重悬菌体。冰浴超声将菌体破坏后于4℃、10000r/min离心20min，弃去破碎的菌体沉淀，保留上清液。将5mL上清液加入Ni²⁺-NTA层析柱中，先加入25mL洗涤缓冲液(30mmol/LTris-HCl，100mmol/LNaCl，30mmol/L咪唑，pH7.5)，然后加入10mL洗脱缓冲液(30mmol/LTris-HCl，100mmol/LNaCl，100mmol/L咪唑，pH7.5)获得KPC-2重组蛋白(KPC-2碳青霉烯酶)。

实施例1KPC碳青霉烯酶抑制肽的制备

KPC碳青霉烯酶抑制肽的氨基酸序列为Pro-Asn-Gln-Trp，化学结构式如图1所示。

以9-芴甲氧羰基(FMOC)为N端保护基团，采用固相合成法合成KPC碳青霉烯酶抑制肽。用92％三氟乙酸、5％水和3％三异丙甲硅烷(TIA)的混合液(92％、5％、3％均为质量百分比)将其从MBHA树脂上裂解。乙醚多次沉淀后，经制备型反相高效液相色谱法(RP-HPLC)纯化。使用C18反相制备柱(20mm×250mm，5μm)；流动相：0.06％三氟乙酸，0％-80％(0.06％、0％-80％为体积百分比)乙腈为流动相，1.5mL/min的流速进行梯度洗脱。经RP-HPLC检测，其纯度>98％，冻干备用。经ESI-QTOF-MS鉴定，其分子量与相应肽的理论分子量一致，m/z592.71[M+H]⁺，质谱结果见图2。

实施例2KPC碳青霉烯酶抑制肽对KPC-2碳青霉烯酶抑制活性的测定

以美罗培南为报告底物，实验分为3组，保持温度为37±1℃：

(1)美罗培南+KPC-2碳青霉烯酶组：向5μL浓度为2mmol/L的美罗培南与90μL浓度为30mmol/L的HEPES缓冲液(pH7.4)的混合溶液中加入5μL浓度为1μmol/L的KPC-2碳青霉烯酶，总体积为100μL。

(2)美罗培南+KPC-2碳青霉烯酶+酶抑制肽组：向5μL浓度为2mmol/L的美罗培南与80μL浓度为30mmol/L的HEPES缓冲液(pH7.4)的混合溶液中加入5μL浓度为1μmol/L的KPC-2碳青霉烯酶与10μL浓度为1μmol/L的KPC碳青霉烯酶抑制肽，总体积为100μL。

(3)美罗培南组：向5μL浓度为2mmol/L的美罗培南中加入95μL浓度为30mmol/L的HEPES缓冲液(pH7.4)，总体积为100μL。

由于报告底物美罗培南被酶水解后其吸光度下降，因而通过测定波长为300nm的吸光度的变化可以反应出底物的水解程度。结果如图3所示：(1)组吸光度在500秒内下降最快，说明KPC-2碳青霉烯酶能高效地催化底物美罗培南的水解；(2)组吸光度虽然也有一定程度的降低，但相对于(1)组，其下降的程度及速率要缓慢得多，说明本发明的KPC碳青霉烯酶抑制肽对KPC-2碳青霉烯酶具有明显的抑制作用；(3)组为阴性对照，吸光在整个过程中基本无变化，说明底物美罗培南的水解是由KPC-2碳青霉烯酶催化水解，与酶促反应体系中缓冲液等物质无关。

实施例3KPC碳青霉烯酶抑制肽与β内酰胺类抗生素协同抗菌作用测定

为了能够安全进行协同抗菌实验，使用相对安全的基因工程菌E.coliRosetta(DE3)/pET28a-KPC-2菌株作为耐药菌株，将E.coliRosetta(DE3)菌株作为阴性对照。采用二倍稀释法测定最小抑菌浓度(MinimumInhibitoryConcentration,MIC)，通过MIC值的变化反应本发明的KPC碳青霉烯酶抑制肽与β内酰胺类抗生素的协同抗菌作用。

具体方法如下：

将-80℃超低温冰箱中保存的能表达KPC-2碳青霉烯酶的工程菌菌株E.coliRosetta(DE3)/pET28a-KPC-2(耐药工程菌)以及对照菌株E.coliRosetta(DE3)分别接种于灭菌的Luria-Bertani(LB)固体培养基中，于37℃恒温培养箱中倒置培养16小时。用接种环挑取单菌落分别转接到灭菌的液体LB培养基中，于37℃、180rpm条件下在震荡培养至对数生长期。用紫外分光光度计测定600nm波长处菌液的吸光度值(OD₆₀₀)，根据1OD＝1×10⁹CFU/mL的换算关系，分别将表达KPC-2碳青霉烯酶的工程菌菌株以及对照菌株用灭菌的LB培养基稀释至2×10⁵CFU/mL。

实验组均使用能表达KPC-2碳青霉烯酶的工程菌E.coliRosetta(DE3)/pET28a-KPC-2。

实验组(1)：首先在无菌96孔板中先加入灭菌的LB培养基100μL；接下来将经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的浓度为1024μg/mL的β-内酰胺类抗生素溶液(β-内酰胺类抗生素溶液用灭菌的LB培养基稀释得到)100μL加入到第1孔中，混合均匀后取100μL加入第2孔中，依次倍比稀释，从第12孔吸出100μL弃去；最后向各孔中加入稀释好的菌液(上述2×10⁵CFU/mL的菌液)100μL，混合均匀。

实验组(2)：首先在无菌96孔板中先加入灭菌的LB培养基100μL；接下来将经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的浓度为1024μg/mL的β-内酰胺类抗生素溶液100μL加入到第1孔中，混合均匀后取100μL加入第2孔中，依次倍比稀释，从第12孔吸出100μL弃去；最后向各孔中加入稀释好的含有经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的浓度为40μmol/LKPC碳青霉烯酶抑制肽的菌液(含有40μmol/LKPC碳青霉烯酶抑制肽的上述2×10⁵CFU/mL的菌液)100μL，混合均匀，各孔中抑制肽的终浓度为20μmol/L。

实验组(3)：首先在无菌96孔板中先加入灭菌的LB培养基100μL；接下来向孔中加入稀释好的含有经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的浓度为40μmol/LKPC碳青霉烯酶抑制肽的菌液100μL，混合均匀，孔中抑制肽的终浓度为20μmol/L。

对照组使用不含表达KPC-2碳青霉烯酶质粒的空菌E.coliRosetta(DE3)。

对照组：首先在无菌96孔板中先加入100μL灭菌的LB培养基；接下来将经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的浓度为1024μg/mL的β-内酰胺类抗生素溶液100μL加入到第1孔中，混合均匀后取100μL加入第2孔中，依次倍比稀释，从第12孔吸出100μL弃去；最后向各孔中加入稀释好的菌液100μL，混合均匀。

以上各组于37±1℃震荡培养18小时，测定波长为600nm处的吸光度值。最小抑菌浓度(MIC)取检测不到细菌生长(OD₆₀₀≤0.01)的孔中各β内酰胺类抗生素的终浓度的最低值，结果如表2。

表2KPC碳青霉烯酶抑制肽与β内酰胺类抗生素协同抗菌作用结果(MIC/(μg/mL))

由表2结果可知，对照组中各β-内酰胺类抗生素对不耐药的菌株E.coliRosetta(DE3)具有良好的抑制作用(MIC≤0.5μg/mL)，说明不含表达耐药酶KPC-2碳青霉烯酶质粒的空菌对各抗生素均敏感。实验组(1)使用的菌株为表达KPC-2耐药酶的工程菌，除单环β-内酰胺类抗生素氨曲南外，其余各抗生素对该工程菌的MIC＞512μg/mL，说明该工程菌因表达KPC-2碳青霉烯酶而具有多药耐药性。实验组(3)实验结果——菌株E.coliRosetta(DE3)/pET28a-KPC-2在仅含有20μmol/L抑制肽的LB培养基中培养18小时后菌液十分浑浊，在600nm处的吸光度OD₆₀₀＞4，仍正常生长，表明KPC碳青霉烯酶抑制肽本身并无抑菌活性。实验组(2)与实验组(1)相比各抗生素的MIC大幅度降低，表明各β-内酰胺类抗生素与KPC碳青霉烯酶抑制肽合用后，由于抑制肽抑制了KPC-2碳青霉烯酶水解底物β-内酰胺类抗生素的活性，使得各β-内酰胺类抗生素不被酶水解破坏而发挥其抗菌活性。

从实验组的MIC可以看出，当KPC碳青霉烯酶抑制肽与各β-内酰胺类抗生素联合使用时，通过协同作用能明显提高各β-内酰胺类抗生素的抗菌活性，特别是实验组(2)当KPC碳青霉烯酶抑制肽浓度C_肽＝20μmol/L时，美罗培南的抗菌活性(MIC值)提高了至少1024倍(512μg/mL÷0.5μg/mL＝1024)。

实施例4KPC碳青霉烯酶抑制肽溶血活性(HC₅₀)的测定

采集人静脉血，将所采集的血液与阿氏液(AlseverSolution，葡萄糖20.5g、柠檬酸钠8.0g、柠檬酸0.5g、氯化钠4.2g，加蒸馏水至1000mL，混合后加热溶化，115℃灭菌10分钟，4℃保存)按1:1(体积比)比例混合置于离心管中，1000rpm离心6分钟，用灭菌生理盐水洗涤至上清液无色。将上述洗涤好的红细胞悬浮于pH值为7.4的0.01MPBS缓冲液中，制备红细胞悬浮液(5％，v/v)。将KPC碳青霉烯酶抑制肽溶解于pH值为7.4的0.01MPBS缓冲液中，配成浓度为15mg/mL的储备液，取10支1mL灭菌的Eppendorf管并编号，首先在2-10管中加入0.5mLPBS缓冲液，第1管、第2管加入0.5mL抑制肽储备液；然后将第2管中的溶液混匀后吸取0.5mL至第3管中并混匀，依次倍比稀释；最后从第10管中吸出0.5mL弃去。补加0.5mL配好的5％人血红细胞悬浮液至终体积为1mL，轻轻混匀，于37±1℃恒温培养箱中保温60分钟，3000rpm离心12分钟，取上清液在415nm波长处测定吸光度，进行比色。以红细胞悬浮于PBS缓冲液中为阴性对照，以红细胞悬浮于1％TritonX-100中为阳性对照。HC₅₀为用溶血百分率为50％时的KPC碳青霉烯酶抑制肽浓度，即HC₅₀为半数溶血量。

溶血百分率用以下公式计算：

样品的吸光度＝抑制肽处理组吸光度值—阴性对照组吸光度值，

溶血样品吸光度＝阳性对照组吸光度值—阴性对照组吸光度值。

结果表明，本发明的KPC碳青霉烯酶抑制肽在本实验所达到的最高浓度7.5mg/mL时未见溶血(溶血百分率＜1％)。

实施例5

取本发明的KPC碳青霉烯酶抑制肽(Pro-Asn-Gln-Trp)0.1g、淀粉2g、糊精2g混合，质量浓度为30％的药用级聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为粘合剂，制粒，压片，既得片剂。

实施例6

取的KPC碳青霉烯酶抑制肽(Pro-Asn-Gln-Trp)1.0g、甘露醇15g，置于容器中，加适量磷酸盐缓冲液(0.05mol/LpH7.8)溶解，加注射用水至200mL，摇匀，加2～4g针用活性炭，室温搅拌45～90分钟，粗滤，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装，每瓶1mL，采用速冻的方法，每分钟降温5～15℃，降温至-45℃，维持2.5小时，抽真空，在真空状态下缓慢升温，升温速度每小时0.5～10℃，温度升至30℃时停止升温，待温度降至室温后取出，加盖密封，既得冻干粉针剂。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCELISTING

<110>武汉大学

<120>一种KPC碳青霉烯酶抑制肽及其应用

<130>1

<160>3

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>4

<212>PRT

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>KPC碳青霉烯酶抑制肽

<400>1

ProAsnGlnTrp

1

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>KPC-2-F

<400>2

cgcggatccatgtcactgtatcgcc25

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>KPC-2-R

<400>3

ccaagctttttactgcccgttgacgc26

Claims

1.一种KPC碳青霉烯酶抑制肽，其特征在于：所述的KPC碳青霉烯酶抑制肽的氨基酸序列为Pro-Asn-Gln-Trp。

2.权利要求1所述的KPC碳青霉烯酶抑制肽的制备方法，其特征在于：所述的方法为固相合成法。

3.权利要求1所述的KPC碳青霉烯酶抑制肽在抑制KPC碳青霉烯酶中的应用。

4.权利要求1所述的KPC碳青霉烯酶抑制肽在制备预防和/或治疗耐药菌感染疾病的药物和/或抗菌药物中的应用；所述的耐药菌为因产KPC碳青霉烯酶而获得耐药性的细菌，所述的抗菌为抗所述耐药菌。

5.一种抗菌药物组合物，其特征在于：包含权利要求1所述的KPC碳青霉烯酶抑制肽。

6.根据权利要求5所述的抗菌药物组合物，其特征在于：还包含所述的KPC碳青霉烯酶抑制肽在药学上可接受的盐和/或药学上可接受的载体。

7.一种抗菌药物组合物，其特征在于：包含权利要求1所述的KPC碳青霉烯酶抑制肽和β-内酰胺类抗生素。

8.根据权利要求7所述的抗菌药物组合物，其特征在于：所述的β-内酰胺类抗生素为氨苄西林、阿莫西林、哌拉西林、替卡西林、氟氧头孢、头孢替唑、头孢噻肟、头孢曲松钠、头孢他啶、头孢吡肟、头孢洛林、亚胺培南、美罗培南、比阿培南、多尼培南、厄他培南、氨曲南中的一种或多种。

9.根据权利要求7所述的抗菌药物组合物，其特征在于：还包含所述的KPC碳青霉烯酶抑制肽和β-内酰胺类抗生素药学上可接受的盐和/或药学上可接受的载体。

10.根据权利要求5-9任一项所述的抗菌药物组合物，其特征在于：所述的抗菌药物为注射剂、片剂、注射用无菌粉末、注射用无菌粉末、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂或霜剂；所述的抗菌药物通过注射、口服、滴鼻、滴眼、物理或化学介导的方法导入肌肉、内皮、皮下、静脉或粘膜组织，或是被其他物质混合或包裹后导入肌体。