CN102212110A - β-内酰胺酶抑制肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的β-内酰胺酶抑制肽，该抑制肽具有较强的β-内酰胺酶抑制活性，且仅由10个氨基酸组成，分子量小、不易产生抗原性；可通过固相多肽合成法制备，简便易行、生产成本低，适合工业化大规模生产；可用于制备β-内酰胺酶抑制剂，与β-内酰胺类抗生素联用可提高其抗菌疗效，在细菌感染治疗领域具有良好的开发应用前景。

Description

β-内酰胺酶抑制肽及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种活性多肽，特别涉及一种具有β-内酰胺酶抑制活性的多肽，还涉及该多肽在制药方面的应用。

背景技术

细菌对β-内酰胺类抗生素耐药的机制有多种，其中β-内酰胺酶的产生是最重要和最常见的机制，其通过与β-内酰胺环上的羰基共价结合，水解酰胺键而使β-内酰胺类抗生素失活。近年来，随着超广谱β-内酰胺类抗生素的大量应用，β-内酰胺酶的种类、底物谱及耐药程度以惊人的速度发展，已经使细菌对氨曲南、绝大多数第三代头孢菌素甚至第四代头孢菌素耐药。解决上述问题的主要方法之一是开发β-内酰胺酶抑制剂。目前临床广泛应用的β-内酰胺酶抑制剂有克拉维酸、舒巴坦和三唑巴坦等，它们通过抑制β-内酰胺酶的活性而达到保护β-内酰胺类抗生素的目的。但随着这些β-内酰胺酶抑制剂的广泛应用，对这些β-内酰胺酶抑制剂耐药的产酶菌也逐渐增加。因此，开发新型、高效的其它β-内酰胺酶抑制剂很有必要。

β-内酰胺酶抑制蛋白（β-lactamase inhibitory protein，BLIP）是1990年从土壤棒状链霉菌培养液中分离得到的主要蛋白质。文献报道，BLIP的2个折叠区域能够插入β-内酰胺酶的活性位点中，阻止β-内酰胺酶与β-内酰胺类抗生素的接合。虽然BLIP由165个氨基酸组成，分子量较大，抗原性较强，不适合开发成为临床使用的药物，但其为β-内酰胺酶抑制肽的研究和开发提供了新的途径。申请号为200410084577.1的中国专利申请公开了一种能够抑制β-内酰胺酶的多肽。该多肽由24个氨基酸组成，推测分子量为2600道尔顿，虽然与BLIP相比在分子量、抗原性方面具有一定优势，但仍然存在分子量较大及潜在的抗原性等问题；同时该多肽采用大肠杆菌表达制备，工艺复杂，周期长，耗资大，不适合大规模生产。李勇湧等（β-内酰胺酶抑制肽的活性研究. 中国抗生素杂志, 2010, 35(4): 300-304）通过计算机分子三维模拟设计并合成了6个β-内酰胺酶抑制肽（各抑制肽的氨基酸序列未公开），但在鉴定活性的过程中发现，抑制肽②和⑤无法溶解，抑制肽④在保存过程中大部分已降解，剩下的3个抑制肽虽然具有β-内酰胺酶抑制活性，但活性均较弱。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种β-内酰胺酶抑制肽，具有较强的β-内酰胺酶抑制活性，且分子量小，不易产生抗原性，适合大规模生产。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：β-内酰胺酶抑制肽，其氨基酸序列如Thr-Thr-Trp-Ser-Glu-Tyr-Tyr-Pro-Ala-Tyr（TTWSEYYPAY，SEQ ID No.1）所示。

本发明通过生物信息学方法分析了BLIP与β-内酰胺酶接合位点的结构特征，综合考虑肽链长度、特定氨基酸残基的位置、等电点及亲水性等几方面，采用计算机分子模拟技术设计了一系列可能与β-内酰胺酶具有较好构效关系的短肽，通过固相多肽合成法制得了这些短肽并对其进行了β-内酰胺酶抑制活性鉴定。结果发现，在这些短肽中，氨基酸序列为TTWSEYYPAY的短肽具有较强的β-内酰胺酶抑制活性，能够明显抑制β-内酰胺酶降解氨苄西林的速率，明显提高头孢噻肟对产β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的抗菌活性，且分子量小、不易产生抗原性，可通过固相多肽合成法制备，简便易行、生产成本低，适合工业化大规模生产。

鉴于上述短肽具有较强的β-内酰胺酶抑制活性，本发明进一步提供如下技术方案：氨基酸序列为TTWSEYYPAY的β-内酰胺酶抑制肽在制备β-内酰胺酶抑制剂中的应用。

本发明的β-内酰胺酶抑制肽可以单独或与其它具有β-内酰胺酶抑制活性的分子组成复方，再辅以药学上可接受的载体，按照药学领域的常规方法制成β-内酰胺酶抑制剂，与β-内酰胺类抗生素联用，通过抑制β-内酰胺酶的活性来提高β-内酰胺类抗生素对产酶耐药致病菌株的疗效，降低β-内酰胺类抗生素的用量，减少毒副作用的发生。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种β-内酰胺酶抑制肽，具有较强的β-内酰胺酶抑制活性，且仅由10个氨基酸组成，分子量小、不易产生抗原性；可通过固相多肽合成法制备，简便易行、生产成本低，适合工业化大规模生产；可用于制备β-内酰胺酶抑制剂，与β-内酰胺类抗生素联用能提高β-内酰胺类抗生素的抗菌疗效，在细菌感染治疗领域具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1为采用固相多肽合成法制备的β-内酰胺酶抑制肽的高效液相色谱图。

图2为采用固相多肽合成法制备的β-内酰胺酶抑制肽的质谱图。

图3为β-内酰胺酶抑制肽对β-内酰胺酶的抑制活性鉴定结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。除另有说明外，优选实施例中使用的技术术语具有本发明所属技术领域的通用含义；优选实施例中使用的氨基酸、氨基酸保护基团及其它化合物的英文缩写为本发明所属技术领域的通用缩写。

一、固相多肽合成法制备β-内酰胺酶抑制肽

本实施例采用Fmoc（9-芴甲氧羰基）法固相合成氨基酸序列为TTWSEYYPAY的β-内酰胺酶抑制肽。

① 称取氨基酸树脂Fmoc-Tyr-Wang Resin 1.5mmol，置多肽合成反应器中，加入质量分数为20%的DBLK溶液（六氢吡啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液），充分搅拌反应5分钟，排空溶液，重复上述操作一次，脱除氨基酸的Fmoc保护基；再用DMF（二甲基甲酰胺）在氮气保护下搅拌洗涤氨基酸树脂5次，DCM（二氯甲烷）在氮气保护下搅拌洗涤氨基酸树脂2次；

② 称取保护氨基酸Fmoc-Ala-OH 1.5mmol、HBTU［2-(1H-苯并三唑)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐］1.5mmol和HOBT（1-羟基苯并三唑）1.5mmol，置活化器中，加入体积比为1:1的DMF/DCM混合液，搅拌反应，活化保护氨基酸的羧基；在步骤①所得氨基酸树脂中加入上述羧基活化的保护氨基酸，在氮气保护下搅拌反应2小时，排空溶液，用DMF在氮气保护下搅拌洗涤肽树脂3次，除去多余的保护氨基酸；再向肽树脂中加入质量分数为20%的DBLK溶液，充分搅拌反应5分钟，排空溶液，重复上述操作一次，脱除氨基酸的Fmoc保护基；再用DMF在氮气保护下搅拌洗涤肽树脂5次，DCM在氮气保护下搅拌洗涤肽树脂2次；

③ 参照步骤②，按照β-内酰胺酶抑制肽的氨基酸序列，依次用HBTU和HOBT活化各保护氨基酸的羧基，再将其偶联至肽树脂上，用质量分数为20%的DBLK溶液脱除氨基酸的Fmoc保护基，再用DMF和DCM洗涤肽树脂，使肽树脂上的肽链从β-内酰胺酶抑制肽的C-端逐个向N-端延伸，直至β-内酰胺酶抑制肽合成完毕；用甲醇搅拌洗涤肽树脂3次，排空溶液，真空干燥，获得β-内酰胺酶抑制肽树脂；

④ 称取β-内酰胺酶抑制肽树脂，置烧瓶中，按照10ml/g的用量加入裂解液（由三氟乙酸、三异丙基硅烷、水和酒石酸乙二胺按照体积比为91:3:3:3混合而成），搅拌反应2小时，将β-内酰胺酶抑制肽从树脂上裂解下来同时去除各氨基酸残基上的侧链保护基，将反应液用砂芯漏斗过滤，滤液加入10倍体积的冰乙醚沉淀多肽，离心分离，收集多肽，用冰乙醚洗涤2次，真空干燥，获得β-内酰胺酶抑制肽粗品；

⑤ 称取β-内酰胺酶抑制肽粗品，加入少量无热原纯化水，搅拌使充分溶解，用孔径为0.45μm的有机滤膜过滤，收集滤液，采用高效液相色谱法进行纯化（Waters 600E高效液相色谱仪，Kromasil 20×250mm C₁₈ 120A色谱柱，流动相由体积分数为0.1%的三氟乙酸和乙腈按照体积比为50:50混合而成），即得β-内酰胺酶抑制肽纯品，经高效液相色谱法（图1）鉴定，其纯度大于98%；经质谱法（图2）鉴定，其分子量与理论分子量一致。

二、β-内酰胺酶粗提液的制备及活性鉴定

挑取临床分离并经Nitrocefin（β-内酰胺酶特异性鉴定试剂）鉴定的产β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌单菌落，接种于5ml新鲜肉汤中，37℃孵育24小时，再吸取该培养液2ml加入200ml新鲜肉汤中，37℃振荡孵育24小时，4℃、5000×g离心30分钟，收集菌体，用0.05M、pH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤菌体2次，再用该缓冲液5ml重悬菌体，冰水浴条件下超声破碎菌体，4℃、20000×g离心1小时，收集上清液，即得β-内酰胺酶粗提液，经蛋白定量后置-70℃冰箱中保存。

向终浓度为10^-4M的头孢噻啶溶液3ml中加入β-内酰胺酶粗提液30μl，37℃混匀，立即用紫外分光光度计观察单位时间内波长260nm处的吸收度（OD值）变化，从OD值开始下降起，每隔一段时间记录一次OD值，直至OD值不再变化或变化幅度明显减小；以OD值为纵座标，时间为横座标，计算时间-OD值回归方程，选取相关系数γ≥0.90的点，计算ΔOD即两个相邻时间的OD值之差的均值，再按照下式计算β-内酰胺酶的活性：β-内酰胺酶活性(U)=ΔOD×10×1分钟内记录OD值的次数×1000/水解前的OD值×蛋白定量(mg/ml)。结果显示，本实施例制得的β-内酰胺酶粗提液中含有465U的β-内酰胺酶。

三、β-内酰胺酶抑制肽对β-内酰胺酶的抑制活性测定

试验分为3组：①氨苄西林+酶组：向浓度为0.4mg/ml的氨苄西林溶液2ml中加入β-内酰胺酶粗提液40μl和水8ml；②氨苄西林+酶+抑制肽组：向浓度为0.4mg/ml的氨苄西林溶液2ml中加入β-内酰胺酶粗提液40μl和浓度为0.1mg/ml的β-内酰胺酶抑制肽溶液8ml；③氨苄西林组：向浓度为0.4mg/ml的氨苄西林溶液2ml中加入0.05M、pH7.0的磷酸盐缓冲液40μl和水8ml；各组于37℃混匀，立即用紫外分光光度计观察单位时间内波长235nm处的OD值变化，通过氨苄西林降解速率的快慢，考察β-内酰胺酶以及β-内酰胺酶抑制肽对氨苄西林降解的影响。结果如图3所示，可见③组的吸收度在400秒内几乎没有变化；①组的吸收度下降最快，表明β-内酰胺酶能够催化降解氨苄西林；②组的吸收度下降速率较①组明显减慢，表明β-内酰胺酶抑制肽能够明显抑制β-内酰胺酶对氨苄西林的降解作用。

四、β-内酰胺酶抑制肽对β-内酰胺酶的抑制方式和抑制常数测定

将终浓度为1μM的克拉维酸或β-内酰胺酶抑制肽分别与终浓度为50μM、100μM的头孢噻啶在pH7.0、37℃条件下平衡后，加入β-内酰胺酶粗提液30μl，在波长260nm处测定酶反应的初速度，采用Lineweaver-Burk(L-B)作图法求出抑制剂（克拉维酸或β-内酰胺酶抑制肽）加入前后酶水解头孢噻啶的米氏常数和最大反应速度，判断抑制剂的抑酶方式。

将终浓度为0、0.1、1.0、10μM的克拉维酸或β-内酰胺酶抑制肽分别与终浓度为50μM、100μM的头孢噻啶在pH7.0、37℃条件下平衡后，加入一定量的β-内酰胺酶粗提液，在波长260 nm处测定酶反应的初速度，采用Dixon作图法求取抑制剂（克拉维酸或β-内酰胺酶抑制肽）对酶水解头孢噻啶的抑制常数Ki，Ki值越大说明抑制效率越低。

结果如表1所示，可见克拉维酸或β-内酰胺酶抑制肽加入前后，酶水解头孢噻啶的最大反应速度没有明显变化，符合竞争性抑制剂的动力学特点，说明克拉维酸和β-内酰胺酶抑制肽均为竞争性抑制剂；β-内酰胺酶抑制肽的Ki为0.01，克拉维酸的Ki为0.19，说明β-内酰胺酶抑制肽比克拉维酸具有更强的β-内酰胺酶抑制活性。

表1  β-内酰胺酶抑制肽对β-内酰胺酶的抑制动力学参数

五、β-内酰胺酶抑制肽对头孢噻肟抗菌活性的影响

试验分为4组：①头孢噻肟组，②β-内酰胺酶抑制肽组，③头孢噻肟+β-内酰胺酶抑制肽（质量比为1:1）组，④头孢噻肟+克拉维酸（质量比为1:1）组。挑取临床分离并经Nitrocefin鉴定的产β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌，采用试管稀释法检测上述各组的最低抑菌浓度（MIC），由此考察β-内酰胺酶抑制肽有无抑菌活性及其对头孢噻肟抗菌活性的影响。

结果如表2所示，①组和②组的MIC均大于128μg/ml，说明头孢噻肟与β-内酰胺酶抑制肽对产β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌几乎无抗菌活性；③组的肺炎克雷伯菌MIC为32μg/ml，大肠埃希菌MIC为64μg/ml，均低于④组相应菌株的MIC，说明β-内酰胺酶抑制肽可以通过抑制β-内酰胺酶的活性明显提高头孢噻肟对产β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的抗菌活性，且β-内酰胺酶抑制肽较克拉维酸具有更强的β-内酰胺酶抑制活性。

表2  β-内酰胺酶抑制肽对产β-内酰胺酶细菌的MIC

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110>  中国人民解放军第三军医大学第一附属医院

<120>  β-内酰胺酶抑制肽及其应用

<160>  1

<210>  1

<211>  10

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  β-内酰胺酶抑制肽

<400>  1

Thr Thr Trp Ser Glu Tyr Tyr Pro Ala Tyr

1                          5                        10

Claims (2)

1.β-内酰胺酶抑制肽，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的β-内酰胺酶抑制肽在制备β-内酰胺酶抑制剂中的应用。

Images