CN105801610B

CN105801610B - 新型广谱β-内酰胺酶抑制剂

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Publication number: CN105801610B
Application number: CN201610243093.XA
Authority: CN
Inventors: 伍世平; 徐洪雨; 胡向东
Original assignee: Wuhan Vision Pharmaceutical Technology Co Ltd
Current assignee: Wuhan Vision Pharmaceutical Technology Co Ltd
Priority date: 2016-04-19
Filing date: 2016-04-19
Publication date: 2018-05-18
Anticipated expiration: 2036-04-19
Also published as: EP3447058A1; EP3447058B1; US20190048027A1; EP3447058A4; US10479805B2; WO2017181897A1; CN105801610A

Abstract

本发明公开了一种新的广谱的β‑内酰胺酶抑制剂，化合物结构如下式Ⅰ所示，通过本发明化合物对四类六种β‑内酰胺酶活性的研究，发现该化合物不仅能抑制多种β‑内酰胺酶的活性，而且当它们与β‑内酰胺抗生素组合时对产生各种β‑内酰胺酶的细菌均具有很强的生长抑制活性，可以预期发展成为可以恢复β‑内酰胺抗生素抗菌活性从而治疗和预防动物包括人的细菌引起的感染的药物，具有很大的社会和经济效益。

Description

新型广谱β-内酰胺酶抑制剂

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地指一种新型广谱β-内酰胺酶抑制剂。

背景技术

抗生素尤其是β-内酰胺抗生素(例如，青霉素，头孢菌素，和碳青霉烯类)一直是治疗细菌感染性疾病的最有效的工具之一。所有这类药物在其核心分子结构中都具有β-内酰胺，且通常通过抑制细菌的细胞壁合成而显示出针对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的广谱功效。它们因为具有很强的杀菌作用和低毒性在临床上被广泛使用。

然而，各种病原细菌已经进化产生可以使β-内酰胺失活的β-内酰胺酶，并在菌种之间和内部传播和共享此工具的能力。这种酶通过催化水解内酰胺环而灭活β-内酰胺抗生素，使其与细菌中的目标青霉素结合蛋白的结合无效而产生耐药性。这是已知的与细菌耐药性相关的最重要的机制。广义定义的β-内酰胺酶有丝氨酸水解酶和金属水解酶两个基本类别。根据其氨基酸序列，β-内酰胺酶通常进一步分类细分为4类：即Ambler类A，B，C和D[布什和雅各比，更新的β-内酰胺酶功能分类，抗微生物制剂和化疗，54(3)：969-976(2010年3月)]。其中A，C和D类酶活性中心是丝氨酸，而相对遇到较少的B类酶是锌依赖的。传统上A类是青霉素酶，C类酶指的是头孢菌素酶，D类酶是广谱或超广谱β-内酰胺酶(ESBL)，而B类酶同样具有超广谱的抗药性。克服这种最重要的细菌耐药性机制的一个策略是开发新的抗生素，例如较新一代头孢菌素和碳青霉烯类能逃避早期丝氨酸β-内酰胺酶的失活作用。然而，对β-内酰胺抗生素的依赖已经导致近来新的β-内酰胺酶的多样化和发生率显著增加，例如A类超广谱β-内酰胺酶(ESBL)及碳青霉烯酶(KPC-2)，C类染色体和质粒介导的头孢菌素酶(AmpC，CMY等)，和D类oxacillinases(ESBL)以及B类金属β-内酰胺酶(例如VIM，NDM)。这显著减少了β-内酰胺抗生素家族包括更近代的β-内酰胺药物，例如作为临床治疗上最后手段的碳青霉烯类抗生素的效用，从而导致严重的医学问题和一个重大的公共卫生和经济负担[Llarrull等人，β-内酰胺类的未来，微生物学的当前观点，13：551-557(2010)]。

另一个策略是开发β-内酰胺酶抑制剂帮助改善β-内酰胺抗生素的有效性。抑制剂与β-内酰胺抗生素结合使用可以减慢或防止β-内酰胺抗生素的降解，并恢复β-内酰胺酶生产菌对β-内酰胺抗生素的敏感性。然而越来越多地使用新一代头孢菌素和碳青霉烯类推动细菌的选择和新的β-内酰胺酶的变异的传播，目前系统编录的仅丝氨酸β-内酰胺酶的数量已经超过750变种(参见在Lahey Clinic网站上，Jacoby&Bush，“TEM，SHV和OXA广谱和抑制剂耐药β-内酰胺酶氨基酸序列”)。在许多情况下，现有β-内酰胺酶抑制剂不足以对抗不断增加的β-内酰胺酶的多样性。

目前市售使用最常见的三种丝氨酸β-内酰胺酶抑制剂，克拉维酸，他唑巴坦和舒巴坦仅仅针对某些A类酶具有活性，而且这些抑制剂的活性核心仍然是一个β-内酰胺环，其使用导致越来越多的细菌进化具有针对这类β-内酰胺酶抑制剂的耐药机制，这严重限制了它们的效用。此外，最近被FDA批准上市的Avibactam,目前在临床试验中的Relebactam和与本发明同类的化合物RPX7009等β-内酰胺酶抑制剂，主要对A类和C类的酶起作用，对D类和B类的β-内酰胺酶只有最小的有效性【Bebrone等，目前在抗菌化疗方面的挑战：聚焦β-.内酰胺酶抑制作用，药品，70(6)：651-679(2010)】或无效【贝克尔等，碳青霉烯/β-内酰胺酶抑制剂(RPX2003/RPX7009组合对所测试的丝氨酸-碳青霉烯酶生产病原体作用的临床前评价，摘要F-856，ICAAC论文摘要集，旧金山(2012)】。这些新抑制剂相对目前的β-内酰胺酶抑制剂而言有一个相当大的改进。因为目前还没有对人类和动物感染有效的D类或B类β-内酰胺酶抑制剂，而细菌对常规抗生素耐药率仍在继续上升。因此新的能有效地失活我们今天明显看到的所有三类的丝氨酸β-内酰胺酶及新出现的金属β-内酰胺酶，以及不含β-内酰胺环的广谱抑制剂已经日益成为必要。

因为其酶抑制活性较窄或本身结构含有β-内酰胺环而引起细菌的抗性，目前可用的抑制剂不足以抑制不断提升的β-内酰胺酶多样性，今天我们迫切需求新颖广谱的β-内酰胺酶抑制剂用来治疗由耐药细菌引起的难以治愈的感染性疾病。这些细菌生产C类、A类、D类和B类的超广谱和广谱的β-内酰胺酶(ESBL)，例如A类的KPC-2β-内酰胺酶，它甚至能够分解作为β-内酰胺抗生素临床治疗的最后手段的碳青霉烯。因此，需要开发出一种新的广谱的β-内酰胺酶抑制剂，其作为药物用于抑制β-内酰胺抗生素的失活作用并且恢复抗菌活性。

发明内容

本发明的目的就是要解决上述背景技术的不足，提供一种新的广谱的β-内酰胺酶抑制剂，其作为药物用于抑制β-内酰胺抗生素的失活作用并且恢复抗菌活性。

本发明的技术方案为：如下式Ⅰ的化合物：

其中：m为0，1或2；n为0或1；Y为二取代吡啶基-C₅H₃N-；

R₁，R₂单独为氢或氨基，-C＝NH(NH₂)，羟基，卤素羧基，氰基，硫醇，任选取代的C1-C5烷基，C1-C5烷氧基，C1-C5烯基，C3-C6环烷基，C3-C6的杂环，硫醚，砜。

优选的，化合物Ⅰ为以下结构：

本发明还提供上述化合物作为β-内酰胺酶抑制剂在制备用于治疗细菌感染疾病药物的用途。

优选的，所述化合物制成药物类型为注射剂、粉针剂、口服剂、喷雾剂、胶囊、栓剂或任何药学上可接受的赋形剂。

进一步的，所述化合物与β-内酰胺抗生素一起制备用于预防或治疗细菌感染的药物的用途。

进一步的，所述化合物、β-内酰胺抗生素和任选可药用载体的药物组合物制成治疗细菌感染的药物。

化合物Ⅰ的合成方法为：利用商购的芳基硼酸使用以下描述的通用合成路线来制备。

上述合成路线中，首先在浓硫酸催化的存在下，采用2-甲基丙烯将羧酸基团保护为叔丁基酯，然后采用(+)-2,3-蒎烷二醇将硼酸转化为手性硼酸酯。接着采用(溴代甲基)锂的同系化反应(改良于Matteson等，Organometallics,1985,4,1687-1689)获得硼酸苄基酯。向二(三甲基甲硅烷基)胺中间体的转化可以采用下面文献中所述条件完成：Schoichet等，J.Am.Chem.Soc.2003，125，685-695。然后，通过与活性酯的反应，可以将这些中间体转化为需要的酰胺。活性酯可以通过羧酸与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐试剂(EDCI)的反应获得。蒎烷二醇基团的除去以及羧酸和酚基团的去保护可以在酸性条件下一步完成，例如在含三氯化硼(BCl₃)或三溴化硼(BBr₃)，或氯化铝(AlCl₃)等路易斯酸的二氯甲烷溶液。尽管本领域技术人员可以理解，在反应产物中可能存在较少量的I-(S)异构体，但是根据文献方法，本申请者可以获得占优势的(多于99％)I-(R)对映体。同样，如合成路线中所示，这些在芳基环上具有邻-羟基基团的化合物可以以游离羧酸存在，或者以环状硼酸酯的形式存在，或者以环状形式和开链形式的混合物存在。

β-内酰胺酶抑制剂的用途和施用

本发明还提供了该化合物的用途。它在与β-内酰胺抗生素组合使用时，强效恢复该β-内酰胺抗生素对耐药菌的抗微生物活性。

如上所述，通式(I)化合物具有β-内酰胺酶抑制作用并且因此用于抑制β-内酰胺酶。作为其应用的一个特别实施方案，本发明化合物可以与其它β内酰胺抗生素中的通过β-内酰胺酶的作用而失活的抗生素组合应用以恢复这些抗生素的活性而用于治疗感染。因此，根据本发明的一个实施方案，提供了β-内酰胺酶抑制剂和药物组合物，其包含作为有效成分的通式(I)化合物，与β内酰胺抗生素组合应用。即本发明的β-内酰胺酶抑制剂和药物组合物与β内酰胺抗生素同时或依次给动物包括人类施用。

β-内酰胺酶抑制剂的给药可以以任何药理学形式，包含治疗活性量的β-内酰胺酶抑制剂或者还包含一种药学上可接受的载体或添加剂，例如稳定剂、表面活性剂、增塑剂、增溶剂、增亮剂、增稠剂、润滑剂、缓冲剂、甜味剂、芳香剂、香料、糖包衣剂、矫味剂、基质、吸收剂、粘合剂、助悬剂、包衣剂、保湿剂、湿度调节剂、填充剂、消泡剂、咀嚼剂、冷冻剂、着色剂、等渗剂、pH调节剂、软化剂、乳化剂、粘合剂、粘合增强剂、粘稠剂、起泡剂、赋形剂、溶剂、液化剂、溶解加速剂、流化剂分散剂、抛射剂、崩解剂、崩解加速剂、抗湿润剂、无菌剂、防腐剂、镇痛剂等，或两种或多种这些添加物组合。本领域技术人员可以根据广泛应用的方法和药物组合物的形式选择用于制剂的适合的添加物以制备药物组合物的所需的形式。添加剂实例包括明胶、乳糖、精制糖、氧化钛、淀粉、玉米淀粉、结晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、微晶蜡、白凡士林、硅酸镁铝、无水磷酸钙、硬脂酸镁、柠檬酸、柠檬酸三钠、山梨醇、脂肪酸山梨醇酯、聚山梨酯polyisobate(polysorbate)、脂肪酸蔗糖酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、植物油、聚乙烯吡咯烷酮、轻无水硅酸、滑石粉、苯甲醇、阿拉伯胶、丙二醇、聚二醇、环糊精和羟丙基环糊精等。剂量方案可以调整，例如药物可以优选以0.1100mg/kg到1100mg/kg(基于化合物的重量和施用途径)每天施用一次至数次，以提供最佳治疗响应。治疗组合物或药物组合物可以以本领域已知的口服或非肠道施用，口服施用的制剂的实例包括片剂、粒剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂、溶液剂、胶囊剂、咀嚼片或混悬剂等。非肠道施用途径包括鼻内、眼内、耳内、经皮、气管内、直肠内、尿道内、皮下、肌内、静脉内、鞘内或脑内给药等。非肠道施用的制剂的实例包括注射剂、滴剂、吸入剂、喷雾剂、栓剂、阴道栓剂、经皮吸收剂、透粘膜吸收剂、滴眼剂、滴耳剂、滴鼻剂或贴剂。其中液体制剂，例如注射剂或滴剂可以提供例如为冻干粉末形式的药物组合物，其可以在应用时溶于或悬浮于水或其它适合的溶剂(例如生理盐水或葡萄糖输液)中。

β-内酰胺酶抑制剂还可以与转铁蛋白受体的抗体，聚乙二醇等相连接或轭合，以获得所需的溶解性、稳定性、半衰期和其它药学有利的性质。β内酰胺抗生素包括青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、单环内酰胺类、桥连的单环内酰胺类或它们的前药和组合，它们可以以可药用盐形式应用，例如钠盐。青霉素类的实例包括青霉素、青霉素V、氨苄西林、阿莫西林、羧苄西林、叠氮西林、丙匹西林、依匹西林、替卡西林、环己西林、吡苄西林、阿洛西林、美洛西林、磺苄西林、哌拉西林以及其它众所周知的青霉素。头孢菌素类实例包括头孢噻肟、头孢曲松、头孢吡肟、头孢曲秦、头孢噻啶、头孢噻吩、头孢唑林、头孢氨苄、头孢乙腈、头孢吡啉(cefapilin)、头孢孟多酯钠(cefamandolena-phate)、头孢拉定、4羟基头孢氨苄、头孢哌酮、拉氧头孢、头孢米诺、氟氧头孢、头孢磺啶、头孢他啶、头孢呋辛、头孢托仑、头孢美唑、头孢匹罗、头孢唑兰以及其它众所周知的头孢菌素类。碳青霉烯类的特别实例包括亚胺培南、美罗培南、尔他培南(ertapenem)、比阿培南、多利培南、替比培南等。

β-内酰胺酶抑制剂或其药学上可接受的盐可以在给药β-内酰胺抗生素的同时给药，或者分别给药。这可以以两种活性成分的混合物的形式或者以两种独立的活性成分的药物组合产品的形式进行。产生β-内酰胺酶的菌株众多，包括例如大肠埃希氏杆菌、肺炎克雷白杆菌、铜绿假单孢菌、蜡状芽孢杆菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌、脆弱拟杆菌、嗜水气单胞菌、粘质沙雷氏菌、嗜麦芽窄食单胞菌、福氏志贺氏菌、木糖氧化产碱杆菌、戈尔曼尼肺炎军团菌、脑膜脓毒性金黄杆菌、产吲哚金黄杆菌和弗劳地柠檬酸杆菌等。Β-内酰胺酶抑制剂和其药学上可接受的盐的剂量以及它们与β-内酰胺抗生素的比例也可以在宽范围内变化，例如重量比例为1：0.5至1：18。应当理解实际给药的组合物的量将由医生根据相关情况确定，所述情况包括待治疗的疾病；待给药的组合物的选择；个体患者的年龄、体重和响应；患者症状的严重程度和所选的给药途径。

细菌生长的抑制本公开还提供了通过例如降低细菌对β内酰胺抗生素的耐药来抑制细菌生长的方法，所述方法包括使细菌细胞培养物与本文所述的β-内酰胺酶抑制剂接触。通过施用本发明的β-内酰胺酶抑制剂而被抑制的细菌是对β-内酰胺抗生素耐药或高度耐药的的细菌。在本领域中抑制β-内酰胺酶活性的实验是众所周知的。例如，可以采用测定化合物抑制β-内酰胺酶活性的能力的标准酶抑制实验。在此类实验中使用的β-内酰胺酶可以从通过重组DNA技术制备，也可以通过细菌源纯化得到，或者可以测定已知的或工程得到的产生β-内酰胺酶的细菌对抑制剂的敏感性。细菌抑制其它实验包括琼脂平板扩散和琼脂稀释法。因此，β-内酰胺酶可以如下被抑制：使β-内酰胺酶与有效量的本发明化合物接触，或使产生β-内酰胺酶的细菌与有效量的所述化合物接触，从而使细菌中的β-内酰胺酶与抑制剂接触。接触可以在体外或体内发生，使抑制剂能够与β-内酰胺酶结合。抑制包括降低和消除β-内酰胺酶活性。

本发明的有益效果为：

1.本发明中的化合物有效地解决由细菌产生的β-内酰胺酶多样性引起的抑制剂及β-内酰胺抗生素失效问题，是一种新型的广谱β-内酰胺酶抑制剂。

2.β-内酰胺酶有三个主要的分子类型是基于丝氨酸的，以及一个主要的分子类型是基于金属的，并且每个类型含有显著不同数目的β-内酰胺酶变体，本发明的化合物显示出对所有四个主要类别β-内酰胺酶都存在有效活性。

3.通过本发明化合物对四类β-内酰胺酶活性的研究，发现该化合物能成功抑制四类六种β-内酰胺酶(SHV-5、CTXM-15、KPC-2、VIM-2、P99+、OXA-23)活性，而且当它们与β-内酰胺抗生素组合时对产生各种β-内酰胺酶的细菌均具有很强的生长抑制活性，可以预期发展成为可以恢复β-内酰胺抗生素抗菌活性从而治疗和预防动物包括人的细菌引起的感染的药物，具有很大的社会和经济效益。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

化合物Ⅰ的通用合成方法为：利用芳基硼酸使用以下描述的通用合成路线来制备。

实施例1

化合物I-1的合成

化合物Ⅰ-1是化合物Ⅰ中m＝1、n＝0、Y为3,5-二取代吡啶基-C₅H₃N-、R₁与R₂均为氢时的具体结构。

I.合成(2-叔丁氧基羰基)-5-氨基甲基吡啶-3-羧酸，即化合物A，合成路线如下：

步骤1.合成5-氰基烟酸乙酯(化合物A-2)在300ml圆底烧瓶中装入5-溴烟酸乙酯(化合物A-1，4.60克，20.0毫摩尔)，氰化锌(9.94克，84.6毫摩尔)，四(三苯基膦)钯(0)(4.69克，4.06毫摩尔)和DMF(100毫升)中。将混合物在90℃氩气下加热15小时。冷却后，将反应用10％乙酸铵溶液猝灭并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机萃取物用水，盐水洗涤和浓缩。残余物通过硅胶色谱纯化，用的2/98(V/V，体积与体积比)乙酸乙酯/己烷的梯度洗脱至10/90(V/V)乙酸乙酯/己烷，得到产物A-2：3.36克(92％)。ESI-MS M/Z 177(MH)⁺。

步骤2.合成5-氨基甲基-烟酸乙酯二盐酸盐(化合物A-3)将5-氰基烟酸乙酯(化合物A-2，3.88克，22.0毫摩尔)，含有10％钯的碳上(2克)和盐酸溶液(15.7毫升,4M在二恶烷中)溶于乙醇(140毫升)中，并充入60psi氢气,在Parr振荡器里搅拌4小时。通过硅藻土过滤该混合物，浓缩滤液，得到5.10克粗产物(92％)化合物A-3。ESI-MS M/Z 181(MH)⁺。

步骤3.合成5-叔丁氧基羰基氨基甲基-烟酸乙酯(化合物A-4)向40毫升叔丁醇和13毫升丙酮溶液中,加入(5-氨基甲基-烟酸乙酯二盐酸盐(化合物A-3，5.08克，20.0毫摩尔)，二碳酸二叔丁酯(13.05克，60.0mmol)，碳酸氢钠(3.36克，40.0mmol)，和4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP 5.10毫克，4.15毫摩尔)。混合物在室温下搅拌过夜。用饱和氯化铵将反应物淬灭，并用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机萃取液用盐水洗涤，干燥并蒸发。将粗物质通过硅胶色谱纯化，选用的梯度从20/80(V/V)乙酸乙酯/己烷的梯度洗脱至50/50(V/V)乙酸乙酯/己烷，得到产物5.60克(100％)化合物A-4，为白色固体：ESI-MS RN/Z 281(MH)⁺。

步骤4.合成(5-叔丁氧羰基氨基甲基-烟酸(化合物A)向(5-叔丁氧基羰基氨基甲基-烟酸乙酯(化合物A-4，5.6克，20.0毫摩尔)在甲醇(20毫升)和水(10毫升)的混合溶液中加入氢氧化钠(10.5克，262毫摩尔)，将混合物室温搅拌15小时，在此期间溶液变澄清。在真空中除去溶剂，并在搅拌中滴加3N盐酸，pH调至为4和5之间。将溶剂在真空中除去，并通过C18反相硅胶色谱纯化产物，得到白色固体5.56克(100％)化合物A。ESI-MS M/Z 253(MH)⁺.

II.主要反应，合成化合物I-1，合成路线如下：

步骤1.合成3-二羟硼基-2-甲氧基苯甲酸叔丁酯(化合物B-2)将3-二羟硼基-2-甲氧基苯甲酸(化合物B-1，5.0克，25.5毫摩尔)加入1，4-二恶烷(30毫升)并封在密封管；再加入浓硫酸(98％，15毫升)。将溶液冷却至0℃并鼓入等体积的异丁烯。该管密封并在室温下搅拌18小时。在冰浴中将该溶液冷却，打开密封，并将该溶液在室温下搅拌30分钟。该溶液用饱和碳酸氢钠水溶液碱化。并用乙酸乙酯萃取两次。将合并的有机层用水(5×)，盐水洗涤，硫酸钠干燥并真空浓缩，得到产物4.0克(62％)白色固体化合物B-2。ESI-MS M/Z 275(M+Na)⁺。

步骤2.合成2-甲氧基-3-(2,9,9-三甲基-3,5-二氧杂-4-硼-三环[6,1,1,02,6]癸-4-基)-苯甲酸叔丁基酯(化合物B-3)将(+)-2,3-蒎烷二醇(2.70克，15.9毫摩尔和3-二羟硼基-2-甲氧基苯甲酸叔丁酯(化合物B-2，4.0克，15.9毫摩尔)的四氢呋喃(THF，21毫升)溶液于室温下搅拌15h。将溶液真空浓缩，残留物用己烷洗涤，获得5.0g(86％)，为缓慢结晶的白色固体，ESI-MS M/Z 409(M+Na)⁺。

步骤3.合成2-甲氧基-3-(2,9,9-三甲基-3,5-二氧杂-4-硼-三环[6,1,1,0^2,6]癸-4-基甲基)-苯甲酸甲酸叔丁酯(化合物B-4)于-90℃[甲醇，液氮冷浴]，2-甲氧基-3-(2,9,9-三甲基-3,5-二氧杂-4-硼杂三环[61.1.0^2,6]癸-4-基)-苯甲酸叔丁酯(化合物B-3，8.5克，22毫摩尔)和二溴甲烷(4.96克，26.4毫摩尔)的THF(65毫升)溶液中，在10分钟内加入正丁基锂(10.56毫升，2.5M在己烷中，26.4毫摩尔)。将溶液于-90℃搅拌45分钟。将反应物逐步温热并搅拌过夜。反应物用水淬灭，采用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用水和盐水洗涤，用硫酸镁干燥并真空浓缩。残留物经二氧化硅色谱纯化，采用70％二氯甲烷/己烷-30％己烷梯度洗脱，获得8克产物化合物B-4(91％产率)，为无色油状物。ESI-MS M/Z 401(MH)⁺。

步骤4.合成3-(2R)-[2-[(5-叔丁氧羰基甲基-烟碱)-氨基]-2-(2,9,9-三甲基-3,5-二氧杂-4-硼杂-三环[6,1,1,0^2，6]癸-4-基-乙基]-2-甲氧基苯甲酸叔丁酯(化合物B-6)于-90℃，10分钟内，向加有无水二氯甲烷(1.80毫升28.50毫摩尔)的四氢呋喃(65mL)溶液中加入n-BuLi(10.5毫升，2.5M的己烷溶液，26.3毫摩尔)。将溶液于-90℃搅拌，20分钟内通过注射器加入2-甲氧基-3-(2，9，9-三甲基-3，5-二氧杂-4-硼杂-三环[6，1，1，0，^2,6]癸-4-基甲基)-苯甲酸异叔基酯(化合物B-4，8.77克，21.93毫摩尔)的THF(11毫升)溶液。30分钟后去掉冷阱，混合物温热至0℃并保持搅拌1小时。然后将溶液冷却至-78℃，5分钟内加入二(三甲基甲硅烷基)氨基锂(LHMDS，1.0M的THF溶液，24.1毫升)。将反应物逐步温热并搅拌过夜。然后将混合物冷却至-10℃，加入无水甲醇(0.96毫升24.1毫摩尔。将其搅拌45分钟，然后撤去冰浴，将溶液于室温下搅拌1.25h。在这个阶段LCMS表明2-甲氧基-3-(2-(2,9,9-三甲基-3-5-二氧杂-4-硼杂三环[6,1,1,0^2,6]癸形成-4-基)-2-(三甲基硅烷基氨基)-乙基]-苯甲酸叔丁基酯中间体化合物B-5。然后在真空中除去所有溶剂，将残余物溶解在140毫升DCM中，备用。

在一个单独的干燥圆底烧瓶将制备的(5-叔丁氧羰基氨基甲基烟酸(化合物A，5.53克，21.93毫摩尔)，溶于二氯甲烷(220毫升)中。溶液烧瓶冷却至0℃，加入NMM(7.3毫升，66.4毫摩尔)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(5.09，44.2毫摩尔)：1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(8.54克，44.2毫摩尔)。将混合物在0℃搅拌30分钟，然后在室温搅拌一小时。在0℃下向此反应混合物加入备用溶液(化合物B-5的DCM溶液)。将冷却浴除去并且将反应在室温下搅拌1.5小时后反应用水淬灭，水相用二氯甲烷萃取，将合并的有机层用硫酸钠干燥，并真空浓缩。粗产物通过快速柱色谱法二氧化硅纯化凝胶用30/70(v/v)乙酸乙酯/己烷的梯度洗脱至70/30(v/v)乙酸乙酯/己烷，得到产物4.36克(30％)化合物B-6，微黄色。ESI-MS M/Z664(MH)⁺。

步骤5.合成(R)-3-(5-氨基甲基)烟酰胺-2-羟基-3,4-二氢-2H-苯并[1,2]二氧杂硼烷-8-羧酸盐酸盐(化合物I-1)将[2-[(2-叔丁氧羰基吡啶-3-羰基)-氨基]-2-(2,9,9-三甲基-3,5-二氧杂-4-硼-三环[6,1,1,0^2,6]癸-4-基)-乙基]-2-甲氧基-苯甲酸叔丁酯(化合物B-6，4.30克，6.48mmol)溶于二氯甲烷(15毫升)。在氩气保护下，加入三氯化硼(65毫升，65mmol，在二氯甲烷中的1M溶液)在-78℃下的溶液。搅拌混合物在-78℃下1小时后，LC-MS表明起始物质的消耗，此时将反应物在0℃用水(30毫升)淬灭。将二氯甲烷层旋转蒸发。再加入30毫升的水，并用乙醚(3×30毫升)萃取水层。水相浓缩后，用C18反相硅胶色谱法纯化的得到1.40克化合物I-1(61％)的白色固体。ESI-MS M/Z 342(MH-H₂O)⁺。

实施例2

化合物I-2的合成

化合物Ⅰ-2是化合物Ⅰ中m＝1、n＝1、Y为2,5-二取代吡啶基-C₅H₃N-、R₁与R₂均为氢时的具体结构。

，I.合成6-叔丁氧羰基氨基甲基-吡啶-3-基-乙酸，即化合物C，合成路线如下：

步骤1.合成(6-溴-吡啶-3-基)-乙酸乙酯(化合物C-2)在500mL圆底烧瓶中，将二异丙胺(13.2毫升93.92毫摩尔)与四氢呋喃(41毫升)混合，并冷却至-78摄氏度。并加入正丁基锂(2.5M在己烷中；38毫升，91.20毫摩尔)，并将该混合物搅拌30分钟。然后加入溶于17毫升四氢呋喃的2-溴-5-甲基吡啶(化合物C-1，5毫升，46.92毫摩尔)。并将该混合物搅拌2小时。然后加入碳酸二乙酯(6.2毫升，51.40毫摩尔)，并将该混合物搅拌过夜，同时逐渐升温至室温。将反应用饱和氯化铵淬灭，并用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机萃取液用盐水洗涤，干燥并浓缩。通过硅胶色谱纯化，用的2/98(V/V)到7/93(V/V)乙酸乙酯/己烷的梯度洗脱，得到产物8.05克(70％)化合物C-2，为无色油状物。ESI-MS M/Z 246(MH)⁺.

步骤2.合成(6-氰基-吡啶-3-基)-乙酸乙酯(化合物C-3)在300ml圆底烧瓶中装入6-溴-吡啶-3-基-乙酸乙酯(化合物C-2，4.91克20.0毫摩尔)，氰化锌(9.94克，84.6毫摩尔)，四(三苯基膦)钯(0)(4.69克，4.06毫摩尔)和DMF(100毫升)。混合物在氩气保护下于90℃下加热15小时。冷却后，将反应用10％乙酸铵溶液猝灭，并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机萃取液用水，盐水洗涤，并干燥浓缩后，用硅胶色谱纯化，用的2/98(v/v)乙酸乙酯/己烷的梯度至10/90(v/v)乙酸乙酯/己烷洗脱得起的产品3.45克化合物C-3(90.3％)。ESI-MSM/Z 191(MH)⁺。

步骤3.合成(6-氨基甲基-吡啶-3-基)-乙酸乙酯二盐酸盐(化合物C-4)将6-氰基-吡啶-3-基)-乙酸乙酯(化合物C-3，4克，21.03毫摩尔)10％钯碳(2克)，和盐酸(15.7毫升4M在二恶烷中)加入乙醇(140毫升)中并装在Parr振荡器，并充入60psi的氢气。搅拌4小时，通过硅藻土过滤混合物，滤液浓缩后得到粗产物5.13克(91％)化合物C-4。ESI-MS M/Z 195(MH)⁺。

步骤4.合成(6-叔丁氧羰基-吡啶-3-基)-乙酸乙酯(化合物C-5)在40毫升叔丁醇和13毫升丙酮中加入(6-氨基甲基-吡啶-3-基)-乙酸乙酯二盐酸盐(化合物C-4，5.13克19.2毫摩尔)，二碳酸二叔丁酯(12.98克，59.5毫摩尔)，并加入碳酸氢钠(3.23克38.4mmol)，和4-(二甲基氨基)吡啶(5.13毫克，4.20毫摩尔)。将混合物在室温下搅拌过夜，反应物用饱和氯化铵淬灭，并用乙酸乙酯萃取三次，将合并的有机萃取液用盐水洗涤，干燥并浓缩，将粗物质通过硅胶色谱纯化，用20/80(v/v)到30/70(v/v)乙酸乙酯/己烷梯度洗脱得到产物6.02克(100％)化合物C-5，为白色固体：ESI-MS M/Z 295(MH)⁺。

步骤5.合成(6-叔丁氧羰基氨基甲基-吡啶-3-基)-乙酸(化合物C)

向(6-叔丁氧羰基-氨基甲基-吡啶-3-基)-乙酸乙酯(化合物C-5，6克，20.3毫摩尔)在甲醇(20mL)和水(10毫升)的混合溶液中加入氢氧化钠(1.05克中的溶液中，加入2.62毫摩尔)。将混合物搅拌15小时，在此期间溶液变澄清。真空除去甲醇，并在搅拌中加入3N盐酸，滴加至得到pH为4和5之间。溶液浓缩后。用碳18相硅胶色谱纯化得到5.42克(100％)化合物C，为白色固体：ESI-MS M/Z 267(MH)⁺。

II.主要反应，合成化合物I-2，合成路线如下：

步骤1.合成3-[2-[(5-叔丁氧羰基-吡啶-3-基乙酰基)-氨基]-2-(2,9,9-三甲基- 3,5-二氧杂-4-硼-三环[6,1,1,0^2,6]癸-4-基-乙基]-2-甲氧基-苯甲酸叔丁酯(化合物B-8)于-90℃，15分钟内，向加有无水二氯甲烷(1.80毫升28.50毫摩尔)的四氢呋喃(65mL)溶液中加入正丁基锂(10.5毫升，2.5M的己烷溶液，26.3毫摩尔)。将溶液于-90℃搅拌，20分钟内通过注射器加入2-甲氧基-3-(2，9，9-三甲基-3，5-二氧杂-4-硼杂-三环[6,1,1,0^2,6]癸-4-基甲基)-苯甲酸异叔基酯(化合物B-4，8.77克，21.93毫摩尔)的THF(11毫升)溶液，化合物B-4制得方法与实施例1中相同。30分钟后去掉冷阱，混合物温热至0℃并保持搅拌1小时。然后将溶液冷却至-78℃，5分钟内加入二(三甲基甲硅烷基)氨基锂(LHMDS，1.0M的THF溶液，24.1毫升)。将反应物逐步温热并搅拌过夜。然后将混合物冷却至-10℃，加入无水甲醇(0.96毫升24.1毫摩尔。将其搅拌45分钟，然后撤去冰浴，将溶液于室温下搅拌1.25h。在这个阶段LC-MS表明2-甲氧基-3-(2-(2,9,9-三甲基-3-5-二氧杂-4-硼杂三环[6,1，1，0^2,6]癸-4-基)-2-(三甲基硅烷基氨基)-乙基]-苯甲酸叔丁基酯中间体(化合物B-7)形成。然后在真空中除去所有溶剂，将残余物溶解在140毫升DCM中，备用。

在一个单独的干燥圆底烧瓶将制备的(6-叔丁氧羰基氨基甲基-吡啶-3-基-乙酸(化合物C，55.84克，22.0毫摩尔)，溶于DCM(220毫升)中。溶液烧瓶冷却至0℃，加入NMM(7.3毫升，66.4毫摩尔)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(5.09克，44.2毫摩尔)：1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(8.54克，44.2毫摩尔)。将混合物(化合物B-7的DCM溶液)在0℃搅拌30分钟，然后在室温搅拌一小时。在0℃下向此反应混合物加入备用溶液。将冷却浴除去并且将反应在室温下搅拌1.5小时后反应用水淬灭，水相用二氯甲烷萃取，将合并的有机层用硫酸钠干燥，并真空浓缩。粗产物通过快速柱色谱法二氧化硅纯化凝胶用30/70(v/v)乙酸乙酯/己烷的梯度洗脱至70/30(v/v)乙酸乙酯/己烷，得到2.84克(20％)产物化合物B-8，微黄色。ESI-MS M/Z 678(MH)⁺。

步骤2.合成(2R)-3-{2-[(6-氨基甲基-吡啶-3-基-乙酰基)-氨基]-2-羟硼基乙基}-2-羟基-苯甲酸盐酸盐(化合物I-2)将3-[2-[(6-叔丁氧羰基-吡啶-3-基乙酰基)-氨基]-2-(2,9,9-三甲基-3,5-二氧杂-4-硼-三环[6.1.1.0^2,6]癸-4-基)-乙基]-2-甲氧基-苯甲酸叔丁酯(化合物B-8，2.48g,3.66mmol)溶于10毫升二氯甲烷。氩气保护下，三氯化硼(38毫升，38毫摩尔，1M溶液在DCM中)在-78℃下加入。将混合物搅拌1小时。反应用在0℃的水(30毫升)淬灭。旋转蒸发到二氯甲烷。加入水(20ml)中。并用乙醚萃取水层(3×30毫升)。水相浓缩后，产物通过C18反相硅胶色谱纯化，得到770毫克(58％)的白色固体化合物I-2。ESI-MS M/Z 356(MH-H₂O)⁺。

上述制得化合物作为β-内酰胺酶抑制剂的性能测试

β-内酰胺酶分析的实验方法。β-内酰胺酶的分离：粗β-内酰胺酶提取物由20ml振摇过夜的培养物制备。将含有SHV5或CTXM15的大肠杆菌(Escherichia coli)细胞，含有P99的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，含有KPC2的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，含有OXA-23的鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)以及含有VIM-2的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)10倍稀释，并在37℃在Mueller Hinton II(MHII)肉汤中生长至对数中期(OD在600nm，.5-.8)。将细胞以5000g沉淀，洗涤并再混悬在2mL pH7.0的PBS中。通过冷冻、解冻随后离心的四次循环提取β-内酰胺酶。用发色的头孢菌素头孢硝噻测定提取物中的β-内酰胺酶活性。在每一β-内酰胺酶制备物中的蛋白质的量通过双辛可宁酸(BCA)实验测定。β-内酰胺酶抑制：为了测定β-内酰胺酶的抑制水平，将化合物在pH7.0的PBS中稀释，以在微孔板中得到1000μM到005μM的浓度。加入等体积的稀释的酶贮备液，并将板在37℃孵育10分钟。然后将头孢硝噻溶液作为底物以100μM的终浓度分配至各孔中，并将板Plus384(高通量微量板分光光度计；Molecular Devices Corp.，Sunnyvale，CA)上用动态程序在486nm立即读数，持续10分钟。然后将代谢的最大速率与对照孔(没有抑制剂)相比较，并且对于抑制剂的每一浓度计算酶抑制的百分数。采用SoftMax Pro 5.0软件(Molecular Devices Corp.)在486nm以β-内酰胺酶的残留活性计算使底物的最初水解速度减少50％所需的抑制剂浓度(IC₅₀)。采用上面所述的方法，评价本发明的实施例的抑制β-内酰胺酶的能力。这些实验的结果总结在跨越不同亚型的代表性酶(其中SHV5和CTXM15作为Ambler A类超广谱β-内酰胺酶的不同亚类，KPC2作为A类碳青霉烯酶，VIM-2代表B类金属酶，P99代表染色体C类AmpC，而OXA-23属于D类代表酶)的表1中，其中A代表＞1μM的IC₅₀，B代表0.1至1μM的IC₅₀，且C代表＜0.1μM的IC₅₀。

表1.实施例化合物对多种β-内酰胺酶活性的半数抑制浓度IC₅₀(μM)范围

β-内酰胺酶抑制的体外抗菌实验。为了测定测试化合物抑制产生β-内酰胺酶的细菌菌株的生长的能力，采用了传统的的基于细胞的筛选实验。使用六种产生β-内酰胺酶的细菌菌株：表达A类超广谱β-内酰胺酶(ESBL)CTXM15和SHV5的大肠杆菌(E.coli)，表达A类碳青霉烯酶KPC2的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，表达B类VIM-2的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，表达C类P99+的阴沟肠杆菌(E.cloacae)和表达D类OXA-23的的鲍曼不动杆菌(A.baumannii)。为了评价测试化合物抑制β-内酰胺酶活性的能力，使用改良的肉汤微量稀释实验。该实验在Cation Adjusted Mueller Hinton Broth(CAMHB，BD#212322，BDDiagnostic Systems，Sparks，MD)中进行。细菌菌株在CAMBH肉汤中生长35小时。所有六种菌株在50μg/mL氨苄西林存在下生长以确保保持耐药。同时，将测试化合物在DMSO中稀释成0.1mg/mL贮备液。将化合物加至微孔板，并以2倍系列稀释在CAMHB中稀释到32μg/mL至0.25μg/mL的终浓度。将包含头孢菌素的CAMHB的覆盖层以8μg/mL或16μg/mL的终止浓度加至化合物。8μg/mL的头孢他啶(CAZ，Sigma#C38091G，Sigma Aldrich，St.Louis，MO)用作下列菌株的搭档抗生素：表达A类ESBL SHV5的大肠杆菌(MIC单独＞1024μg/mL)、表达Ambler A类碳青霉烯酶KPC2的肺炎克雷伯菌(MIC单独＝32μg/mL)和表达C类P99+AmpC的阴沟肠杆菌(MIC单独＝256μg/mL)；16μg/mL的头孢他啶(CAZ)则用作下列菌株的搭档抗生素：表达D类酶OXA-23的鲍曼不动杆菌(MIC单独>256μg/mL)、表达B类酶VIM-2的铜绿假单胞菌(MIC单独>256μg/mL)；而8μg/mL头孢噻肟(TAX，USP#1097909，U.S.Pharmacopeia，Rockville，MD)用作表达A类ESBLCTXM15的大肠杆菌(MIC单独＝1024μg/mL)的搭档抗生素。测试化合物的剂量递增测试(titration)的MIC读数表示足以抑制β-内酰胺酶活性和保护头孢菌素的原有抗菌活性所需的检品浓度。每一化合物需要准备六板，每一板用于一种细菌菌株。除了测试化合物的剂量递增测试外，还测试了一组头孢菌素类化合物的MIC，以确保菌株在测试与测试之间保持行为一致。一旦加入测试化合物和头孢菌素，可以对板进行接种。接种根据CLSI肉汤微量稀释法进行。接种后，将板在37℃孵育16-20小时，然后可视地测定测试化合物的最小抑菌浓度(MIC)。采用上面所述的方法，评价本发明的实施例在β-内酰胺抗生素存在下抑制产生β-内酰胺酶的细菌的生长的能力。代表性结果显示在表2中，其中A代表MIC＞16μg/mL，B代表MIC＝2-16μg/mL，C代表＜1μg/mL的MIC。

表2细菌生长的广谱抑制,在固定量的头孢菌素抗生素存在下化合物的MIC范围

Claims

1.一种如下式Ⅰ-2的化合物：

。

2.如权利要求1中所述化合物作为β-内酰胺酶抑制剂在制备用于治疗细菌感染疾病药物的用途。

3.如权利要求2所述化合物的用途，其特征在于，所述化合物制成药物类型为注射剂、粉针剂、口服剂、喷雾剂、胶囊、栓剂或任何药学上可接受的赋形剂。

4.如权利要求2所述化合物的用途，其特征在于，所述化合物与β-内酰胺抗生素一起制备用于预防或治疗细菌感染的药物的用途。

5.如权利要求4所述化合物的用途，所述化合物、β-内酰胺抗生素和任选可药用载体的药物组合物制成治疗细菌感染的药物。