CN104473954A - 黄芩苷作为金属β-内酰胺酶抑制剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及天然药物领域，具体涉及黄芩苷的医药用途，即作为金属β-内酰胺酶抑制剂的用途。试验证明黄芩苷及其可药用盐对金属β-内酰胺酶具有抑制作用，特别是对VIM-2型金属β-内酰胺酶和IMP-1型金属β-内酰胺酶具有优良的抑制作用。可防止β-内酰胺抗生素被MBLs酶催化水解，起到对这类抗生素的保护作用。因此，黄芩苷可作为抗生素保护剂，用于与抗生素组成复方药物组合物。

Description

黄芩苷作为金属β-内酰胺酶抑制剂的应用
技术领域
本发明涉及天然药物领域，具体涉及黄芩苷的医药用途，即作为金属β-内酰胺酶抑制剂的用途，用于防止金属β-内酰胺酶对β-内酰胺类抗生素的水解，可作为保护剂加入到青霉素等抗生素的药物组方中，以阻止产金属β-内酰胺酶的微生物对青霉素等抗生素的水解作用，维持抗生素的疗效。
背景技术
细菌通过产生β-内酰胺酶催化水解β-内酰胺类抗生素中内酰胺环上的C-N键断裂而使其开环，从而使抗生素失活，这一机制是细菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要原因。基于DNA序列相似性，β-内酰胺酶分为4类：A-D。其中，A,C,D类利用活性位点Ser作为亲核试剂，另一类是依赖Zn的水解酶，称为金属β-内酰胺酶(metallo-β-lactamases，MBLs),它能水解包括亚胺培南在内几乎所有β-内酰胺类抗生素，引起细菌对这类抗生素的耐药。对于A,C,D类β-内酰胺酶，临床上已有有效的抑制剂，如已获准上市的克拉维酸、他唑巴坦和舒巴坦等，但到目前为止，金属β-内酰胺酶尚没有有效的抑制剂上市(Sarah M.Drawz1，Three Decades of 「-Lactamase Inhibitors.Clinical Microbiology Reviews 2010,23(1):160-201)。
从国内临床分离到的产MBLs耐药菌来看，报道的MBLs类型主要集中于IMP型和VIM型，且其亚型不断涌现(孟祥兆，金属β内酰胺酶的检出及流行病学研究进展.中国感染与化疗杂志2014，14(1)：69)。到目前为止，已发现的IMP亚型有48种(IMP-1～IMP-48)，VIM亚型有41种(VIM-1～VIM-42)。由于目前已经发现的获得性金属酶基因除SPM-1外均位于整合子－基因盒中，整合子是细菌基因组中的可移动遗传物质，能捕捉环境中基因整合在自己的基因盒上，从而携带大量不同的耐药基因，因此整合子携带的抗性酶基因很容易在环境中扩散开来。MBLs能水解临床常用的β-内酰胺类抗生素，而其抑制剂能够抑制该类酶的活性，从而保护β-内酰胺类抗生素，恢复其抗菌效果，因此，开发新型、有效的金属β-内酰胺酶抑制剂是当前研究的热点课题。
黄芩苷是从常用的中药材黄芩Scutellaria baicalensis Georgi根中提取得到的一种黄酮类化合物，它具有抑菌、利尿、利胆、抗炎、抗变态、解痉等作用，临床用于治疗肝炎，急性胆道感染及铅中毒。作为传统中药提取物，它具有毒副作用小，可口服给药等优点。但是目 前尚未见黄芩苷作为MBLs抑制剂方面的报道。
发明内容
本发明以金属β-内酰胺酶为靶标，其抑制剂可以抑制该类酶对β-内酰胺抗生素的水解作用，从而恢复抗生素对产酶细菌的抗菌活性。
本发明首次发现黄芩苷及其可药用盐对金属β-内酰胺酶具有抑制作用，特别是对VIM-2型金属β-内酰胺酶和IMP-1型金属β-内酰胺酶具有优良的抑制作用。可防止β-内酰胺抗生素被MBLs酶催化水解，起到对这类抗生素的保护作用。因此，黄芩苷可作为抗生素保护剂，用于与抗生素组成复方药物组合物。
本发明中所述的金属β-内酰胺酶是从自然界中提取或用基因工程菌制备而来。
黄芩苷结构式如下：
可以通过市场购得，也可参考相关文献制备。优选下列制备方法：
1.黄芩提取浓缩液的制备：取黄芩原料100g，用60％乙醇1000ml于80℃水浴中回流提取3次，每次2h。合并提取液，减压浓缩后定容至2000mL，平均分成20份备用(每份消耗原料黄芩约5g)。
2.取上述黄芩提取物浓缩液调节pH为2.0之后，呈现黄色浑浊的悬浊液，当高温80℃保温60min时，浑浊消失，液体呈透明酒红色，有浓郁药香味，冷却静置时，得黄色沉淀，过滤干燥后得到黄芩苷粗粉。所得粗粉在60℃下真空干燥，称重。HPLC检测粗粉中黄芩苷纯度，并观察成品色作为。
3.重结晶精制将黄芩苷粗粉溶于95％乙醇中，回流30min，室温冷却，析晶，过滤，滤饼真空干燥得黄色晶体。HPLC测量黄芩苷纯度为86.14％。
本发明的化合物来源简单，原材料是常见中药，提取工艺方法简单，技术成熟，产物质量容易控制，能满足大规模工业化生产的需要。
药效学试验证明本发明的化合物对β-内酰胺类抗生素具有良好的保护作用，在MBL存在的条件下，对美罗培南的保护指数可达到16，显著高于空白对照组。
本发明的化合物可以作为保护剂加入β-内酰胺类抗生素药物制剂中，其制剂类型包括注射剂、片剂、注射用无菌粉末、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂等。上述各种剂型均可以根据药学领域的常规方法制备。可以通过注射、口服、滴鼻、滴眼、物理或化学介导的方法导入肌肉、内皮、皮下、静脉、粘膜组织，或是被其他物质混合或包裹后导入肌体。
下面是本发明的化合物的部分药效学试验及结果：
一、黄芩苷对VIM-2型金属β-内酰胺酶抑制活性的测定：
以头孢呋辛钠为报告底物，在260nm波长下测定VIM-2型金属β-内酰胺酶水解底物后吸光度的变化。测定缓冲液为50mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸),200mM NaCl,100μMZnCl2,pH＝7.2,温度30℃。
(1)首先将金属β-内酰胺酶(终浓度10nM)于缓冲液中孵育10min，使得Zn2+充分占据活性中心；
(2)将抑制剂溶于缓冲液，向(1)的体系中加入不同浓度的黄芩苷溶液，30℃孵育6min，使抑制剂与酶充分结合；
(3)将体系转入石英比色皿中，加入3μL头孢呋辛钠(终浓度60μM)的同时立即测定体系吸光度的变化，记录数据。
由于底物头孢呋辛钠被酶水解后其吸光度下降，因而通过测定吸光度的变化可以表征底物的水解程度。计算不同浓度的黄芩苷对VIM-2水解底物的抑制率，以化合物的浓度对抑制率拟合曲线，结果如图1所示，说明黄芩苷对VIM-2型金属酶有较好的抑制作用。
二、黄芩苷对β-内酰胺类抗生素保护指数的测定：
试验所用的产MBLs菌株为基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-IMP-1菌，该菌株可以胞内可溶性表达IMP-1酶，水解β-内酰胺类抗生素，使抗生素失活。以E.coli BL21(DE3)/pET28a菌株作为阴性对照。采用二倍稀释法测定，通过保护指数反映黄芩苷对抗生素的保护作用。
保护指数定义为，达到相同活性效果(如抑菌)时，未添加保护剂时抗生素所使用的浓度，与添加保护剂时抗生素所用浓度的比值，该值大于1时，表明加入保护剂后，抗生素需要使用的量可减少，该值越大，表明保护剂的效果越强。
具体方法如下：
将超低温冰箱中保存的工程菌菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-IMP-1以及对照菌株E. coli BL21(DE3)/pET28a分别接种于灭菌的Luria-Bertani(LB)固体培养基中，于37℃恒温培养箱中倒置培养12小时。用接种环挑取单菌落分别转接到灭菌的液体LB培养基中，于37℃，200rpm条件下震荡培养至对数生长期。用紫外分光光度计测定600nm波长处菌液的吸光度值(OD600)，根据1OD＝1×109CFU/mL的换算关系，分别将表达金属β-内酰胺酶的工程菌菌株以及对照菌株稀释至终浓度1×106CFU/mL。
对照组(1)：E.coli BL21(DE3)/pET28a菌。在无菌96孔板中加入依次倍比稀释的终浓度为256～1μg/mL的抗生素头孢呋辛钠，然后向各孔中加入终浓度1×106CFU/mL的菌液，混合均匀。
对照组(2)：表达金属β-内酰胺酶的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-IMP-1。在无菌96孔板中加入依次倍比稀释的终浓度为256～1μg/mL的抗生素头孢呋辛钠，然后向各孔中加入终浓度1×106CFU/mL的菌液，混合均匀。
对照组(3):表达金属β-内酰胺酶的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-IMP-1。在无菌96孔板中加入终浓度1×106CFU/mL的菌液和终浓度为32μg/mL的黄芩苷，混合均匀。
实验组均使用能表达金属β-内酰胺酶的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-IMP-1。
实验组(1)：在无菌96孔板中加入依次倍比稀释的浓度为256～1μg/mL的抗生素头孢呋辛钠，然后向各孔中加入终浓度1×106CFU/mL的菌液和终浓度为32μg/mL的化合物，混合均匀。
实验组(2)：在无菌96孔板中依次倍比稀释的浓度为256～1μg/mL的抗生素头孢呋辛钠，然后向各孔中加入终浓度1×106CFU/mL的菌液和0.9％生理盐水，混合均匀。
其他抗生素在无菌96孔板中加入倍比稀释浓度为256～1μg/mL，除了头孢唑肟倍比稀释浓度为1024～4μg/mL，其他β-内酰胺类抗生素测定方法与以上步骤相同。
以上各组于37℃缓慢震荡培养16小时，测定波长为600nm处的吸光度值。检测不到细菌生长的孔中头孢呋辛钠的终浓度为有效浓度，黄芩苷对提高头孢呋辛钠的保护指数见图2。
由图2结果可以看出，将黄芩苷加入抗生素中联合使用时，通过保护作用能明显抑制金属β-内酰胺酶活性，减少抗生素的水解，从而使抗生素有效使用浓度降低，当黄芩苷浓度为32μg/mL时，黄芩苷对头孢呋辛钠的保护指数为8(128/16)；头孢唑肟的保护指数为4(16/4)；美罗培南的保护指数为16(32/2)；亚胺培南的保护指数为2(32/16)。
附图说明
图1是黄芩苷对VIM-2型金属β-内酰胺酶的抑制活性
图2是黄芩苷对β-内酰胺类抗生素的保护指数 。

Claims (5)

1.黄芩苷用于制备金属β-内酰胺酶抑制剂的用途。
2.权利要求1的用途，其中金属β-内酰胺酶是VIM-2型金属β-内酰胺酶。
3.权利要求1的用途，其中金属β-内酰胺酶是IMP-1型金属β-内酰胺酶。
4.黄芩苷作为抗生素保护剂的用途。
5.权利要求1的用途，其中金属β-内酰胺酶是从自然界中提取或用基因工程菌制备而来。
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