CN102558307A

CN102558307A - 一种八肽菌素及其制备与应用

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Publication number: CN102558307A
Application number: CN201110425969XA
Authority: CN
Inventors: 吴雪昌; 钱朝东; 滕毅; 李欧; 赵文鹏
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2011-12-16
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2031-12-16
Also published as: CN102558307B

Abstract

本发明提供了一种新的具有生物防治和医疗应用潜在价值的多肽菌素及其制备方法与应用，所述多肽菌素结构如式(I)所示。本发明的有益效果主要体现在：提供了一种毒性低于多粘菌素B、具有医疗应用价值的八肽菌素及其制备方法和应用，体外实验表明该化合物对所有测试过的革兰氏阴性菌均具有显著的抑制作用，动物实验表明，该化合物对大肠杆菌引起的小鼠败血症模型具有良好的治疗效果。

Description

一种八肽菌素及其制备与应用

(一)技术领域

本发明涉及一种新的多粘菌素类似物——八肽菌素及其制备与应用。

(二)背景技术

几乎对所有抗生素均耐药的病原菌的出现，使人类健康正面临一个日益严重的巨大威胁。虽然，多重耐药革兰氏阳性和阴性细菌对公众卫生都是一个严峻考验，但是后者的问题目前看来要严重的多。一方面，革兰氏阴性菌正成为当前医院和社区感染的一类主要致病菌，且临床分离菌株耐药性呈日益上升趋势，特别是铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌以及克雷伯氏菌这些医院感染的重要条件致病菌，极易变异为对几乎所有抗生素均耐药的超级病原菌，从而严重影响人类健康。据报道，我国重症监护室内的细菌感染率逐渐增高，其中70％以上的感染是由上述三种革兰氏阴性菌引起的。

另一方面，近年来尽管针对多重耐药革兰氏阳性菌已开发出不少新药，但是除替加环素外，却没开发出一种适用于治疗革兰氏阴性菌，特别是针对上述超级耐药菌引起的全身性感染用新药，而且即使未来十年也难有此类新药出现。正因为如此，美国传染病学学会(IDSA)将铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌以及克雷伯氏菌列为6种最需优先应对的危险多重耐药微生物之列。目前，多粘菌素是治疗这些对其它所有抗生素均耐药的革兰氏阴性细菌，特别是铜绿假单胞杆菌感染的最后防线。

多粘菌素类抗生素发现于50年前，其中多粘菌素B和E曾在上世纪六、七十年代应用于临床治疗，后因肾毒性和神经毒性较大而停用；九十年代因对革兰氏阴性耐药菌有效，又重新起用。随着多重耐药革兰氏阴性菌所致的重症感染日渐增多，同时又缺乏能对抗这种感染的新型抗生素，促使人们对多粘菌素类抗生素进行重新评价。据对1950年至2005年间的研究资料统计分析表明，和早期的研究资料相比，近期研究显示多粘菌素所致肾毒性明显减少，即便有，其严重程度也较低。而且，多粘菌素所致的神经毒性作用也多较轻微，停药后即可消退。

尽管，新的证据显示多粘菌素的毒性没有以往报告中所说的那么严重，但是其机会性毒性，特别是肾毒性常导致治疗的复杂化甚至停药。因此，有必要加快开发高效、低毒的新型多粘菌素类似物以应对日益严重的革兰氏阴性杆菌耐药性问题。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种新的针对革兰氏阴性杆菌、具有医疗应用潜在价值的多粘菌素类似物——八肽菌素及其制备方法与应用。

本发明采用的技术方案是：

一种八肽菌素，结构如式(I)所示：

其中L-Dab为L型2，4-二氨基丁酸，D-Dab为D型2，4-二氨基丁酸，D-Phe为D型苯丙氨酸，L-Leu为L型亮氨酸。

该化合物相关参数如下：

外观：冻干后为白色粉末；

分子量：1030；

分子式：C₅₀H₈₇N₁₃O₁₀；

MS图谱：见图1；

MS-MS图谱：见图2。

根据上述特性，可推断该化合物为多粘菌素家族中的新成员，将其命名为八肽菌素。该化合物是国内外首次从类芽孢杆菌中分离到的又一新脂肽类抗生素。该化合物对所有测试过的革兰氏阴性菌均具有显著的抑制作用，动物实验表明，该化合物对大肠杆菌感染的小鼠具有良好的保护作用。

本发明还涉及所述的八肽菌素的制备方法，所述方法包括：将类芽孢杆菌(Paenibacillus tianmuensis)CCTCC No：M 209149(菌株编号F6-B70)接种至适用于类芽孢杆菌的发酵培养基，于28～32℃下培养72～120h，发酵液离心取上清液，上清液经常规分离纯化得到所述多肽菌素。

所述类芽孢杆菌F6-B70保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏日期2009年7月14日，保藏编号CCTCCNo：M 209149，已在在先中国专利200910153060.6(公开号CN101709058A)中作为新菌株保护。

所述分离纯化方法可选择本领域常规适用多粘菌素的方法，本发明中分离纯化如下：上清采用大孔吸附树脂进行固相萃取，先用蒸馏水和10～30％(优选25％)甲醇水溶液冲洗，然后用40～90％(优选80％)甲醇水溶液洗脱，收集活性洗脱液成分，浓缩蒸干得到粗品；粗品用甲醇溶解，离心过滤先用C-18固相萃取柱进一步纯化，然后进行高效液相色谱层析，收集活性组分，浓缩蒸干即可得到所述八肽菌素。

所述发酵培养基为本领域常规用于类芽孢杆菌的液体培养基，本发明中所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖，1～10g/L；(NH₄)₂SO₄，0.5～2.0g/L；MgSO₄.7H₂O，0.1～0.5g/L；NaCl，0.05～0.5g/L；CaCl₂，0.05～0.5g/L；FeSO₄，0.005～0.05g/L；ZnSO₄，0.005～0.05g/L；MnSO₄.H₂O，0.001～0.01g/L；KH₂PO₄，1～5g/L；溶剂为水，pH7.0～7.2。

优选的，所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖，5g/L；(NH₄)₂SO₄，1.5g/L；MgSO₄.7H₂O，0.2g/L；NaCl，0.1g/L；CaCl₂，0.1g/L；FeSO₄，0.01g/L；ZnSO₄，0.01g/L；MnSO₄.H₂O，0.0075g/L；KH₂PO₄，2.7g/L；溶剂为水，pH7.0～7.2。

优选的，所述大孔吸附树脂为Amberlite XAD-16。大孔吸附树脂是二十世纪发展起来的一类有机高聚物，在医药、食品和污水处理等领域已得到广泛应用。利用树脂特有的吸附性能，在天然产物，抗生素，维生素，中药有效成分等方面的提取、浓缩、纯化、脱盐及脱色处理中发挥着越来越重要的作用.Amberlite XAD-16，呈白色不透明球体，主要用于抗生素和小分子肽类的分离纯化，该填料对小分子化合物具有优良的吸附性能，其对头孢霉素、阿维霉素、依维菌素、氯洁霉素、磷酸酯具有良好的吸附效果。此外，Amberlite XAD-16树脂还可用于从极性溶液中去除非极性化合物。总之，Amberlite XAD-16的吸附性能良好，是一种理想的固相萃取材料。

本发明还涉及所述的八肽菌素在制备抗菌制剂中的应用。

进一步，所述的广谱八肽菌素可用于制备抗细菌感染药物，优选为抗革兰氏阴性菌感染的药物，更优选为抗铜绿假单胞杆菌感染的药物。

本发明提供的式(I)新化合物的抗菌图谱具体见表1。其中临床分离菌株A.baumannii isolates(5383，5064，and 5075)及P.aeruginosa 5215均为超级耐药菌，即对所有测试过的常用抗生素均不敏感(表2)。由表1可知，本发明式(I)新化合物对这些超级耐药菌都表现出较强的抑菌活性。

表1：式(I)新化合物、多粘菌素B及万古霉素体外抗菌活性

表2：临床分离菌株对常用抗生素的敏感性实验

^aR，resistant；S，susceptible；I，intermediate。

^bAMK，amikacin；；CEM，cefepime；IMP，imipenem；CET，cefotaxime；AMP，ampicillin；LEV，levofloxacin；GEN，gentamicin；MEM，meropenem；TAP，tazobactam/piperacilli。

本发明提供的式(I)新化合物对昆明鼠的静脉注射(iv)LD₅₀分别为15.46mg/kg，明显高于多粘菌素B硫酸盐对小鼠的iv LD₅₀(6.52mg/kg)，表明本发明提供的式(I)新化合物的毒性低于多粘菌素B硫酸盐，安全性更好。

表1中大部分的细菌都属于革兰氏阴性致病菌。式(I)新化合物对这些致病菌都具有较强的抑菌活性。在动物保护实验中，静脉给药4mg/kg的式(I)新化合物对多重耐药菌大肠杆菌5539的致命感染具有100％的保护效果，由此可见，式(I)新化合物在动物体内也具有明显的抗菌效果，可应用于制备抗细菌感染药物。

本发明的有益效果主要体现在：提供了一种毒性低于多粘菌素B、具有医疗应用价值的八肽菌素及其制备方法和应用，体外实验表明该化合物对所有测试过的革兰氏阴性菌，包括多重耐药以及超级耐药菌均具有显著的抑制作用；动物保护实验表明该化合物对大肠杆菌引起的小鼠败血症具有明显的防治效果。

(四)附图说明

图1为本发明制备的式(I)化合物的ESI-MS图谱；

图2为本发明制备的式(I)化合物的MS-MS图谱。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：将Paenibacillus tianmuensis F6-B70(CCTCC No：M 209149)按下述条件发酵产生式(I)新化合物

1.将菌株F6-B70接种于营养琼脂培养基斜面上活化，30℃培养1～2天；

2.将斜面种子接入盛于250mL三角瓶的50mL种子培养基中，于30℃，200rpm振荡培养24h，即为一级种子液；

3.将一级种子液接入盛于500mL三角瓶的200mL种子培养基中，于30℃，200rpm振荡培养24h，即为二级种子液；

4.将二级种子液按5～10％(v/v)的接种量接入含500mL发酵培养基的2L三角瓶中，于30℃，200rpm振荡培养96h，获得发酵液。

营养琼脂培养基，按如下组成配制：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂17g，蒸馏水1000mL，pH7.2；

种子培养基为营养肉汤培养基，按如下组成配制：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.2；

发酵培养基按如下组成配制：葡萄糖，5g；(NH₄)₂SO₄，1.5g；MgSO₄.7H₂O，0.2g；NaCl，0.1g；CaCl₂，0.1g；FeSO₄，0.01g；ZnSO₄，0.01g；MnSO₄.H₂O，0.0075g；KH₂PO₄，2.7g；蒸馏水补足至1000mL，pH 7.0～7.2。

实施例2：式(I)新化合物的分离纯化

将实施例1中获得的发酵液按下述步骤分离纯化可获得本发明提供的式(I)新化合物纯品。

1.将发酵液转到离心瓶中，6500×g离心30min，去除菌体，得澄清发酵上清液；

2.将上清液以恒定的流速流穿用水平衡好的Amberlite XAD-16层析柱，待样品上完后分别用蒸馏水及含25％(v/v)甲醇的水溶液各冲洗5～10个床体积，然后用含80％(v/v)甲醇的水溶液洗脱，收集80％甲醇水溶液洗脱的洗脱峰，浓缩蒸干，记为粗品1。

3.将粗品1用甲醇溶解，过0.45μm的滤膜，上样至用20％(v/v)乙腈水溶液平衡好的C-18固相萃取柱，样品加完后再20％乙腈水溶液冲洗5～10个床体积，然后用55％(v/v)乙腈水溶液洗脱，收集洗脱峰，浓缩蒸干，记为粗品2。

4.将粗品2用甲醇溶解、离心(12000rpm，10min)，并过膜后，用制备型HPLC进行分离。A液为0.1％(v/v)三氟乙酸水溶液，B液为色谱纯乙腈，洗脱梯度为：在40min时间里B液从20％(v/v)提高到60％。收集活性部分，浓缩、真空冷冻干燥，即得式(I)纯品。

实施例3：抑菌活性测定

1)用Mueller Hinton肉汤培养基配制浓度为256μg/ml的式(I)新化合物，并进行二倍稀释：浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5μg/ml。

2)在96孔聚苯乙烯板的第1至第10孔中分别加入50μl倍比稀释后不同浓度的式(I)新化合物溶液(200～0.39μg/ml)，第11孔中加入50μlMueller Hinton肉汤培养基(牛肉浸膏粉2g/L，酸水解酪蛋白17.5g/L，淀粉1.5g/L，溶剂为水)，作为生长对照，第12孔中加入100μl MuellerHinton肉汤培养基，作为阴性对照。阳性对照为多粘菌素B和万古霉素。

3)指示菌培养24h后，用Mueller Hinton肉汤培养基稀释为10⁶个/ml，向第1至第11孔中加入50μl稀释菌液，密封后置培养箱中35℃培养18h，判断结果。此时，第1至第10孔中式(I)新化合物的浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。

4)用酶标仪测定OD值，检测波长为570nm。将完全抑制指示菌生长的最低浓度定义为最低抑菌浓度(MIC)。

所述指示菌包括：大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 35218，铜绿假单胞菌A(Pseudomonas aeruginosa)TCC 27853以及从临床上分离到的17株革兰氏阴性致病菌。

实验结果见表1。

实施例4：小鼠急毒实验

1.小鼠

小鼠为昆明种，6～8周，重17～22g。对小鼠的处理都参照实验动物护理和使用指南(National Academy Press 1996)进行。当发现小鼠处于垂死状态时，采用颈椎脱臼处死法以减轻小鼠的痛苦。

2.实验方法

2.1实验动物：

2.1.1品种、来源、合格证号：昆明种小鼠，由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，合格证号：SCXK 2007-0005。本院实验动物使许可证号：SYXK(沪)2004-0015。

2.1.2性别及体重：雌雄各半，20±1g。

2.1.3每组动物数：20只，雌雄各半。

2.2.剂量：

2.2.1剂量设置：25mg/kg、20mg/kg、16mg/kg、12.8mg/kg、10.24mg/kg、五个组。

2.2.2剂量间距：为0.8。

2.2.3给药方案：iv×1。

2.2.4注射体积0.5ml/鼠。

2.2.5注射速度：均为1ml/1min.

2.3.药液的配制：取64.5mg(送样单位称量)样品，以灭菌注射用水稀释至10ml。取7.75ml(含样品50mg)以生理盐水稀释至50ml，取出10ml溶液作为第一组给药剂量(25mk/kg)。余下40ml再加生理盐水稀释至50ml，取出10ml溶液作为第二组给药剂量(20mk/kg)。以后依次以相同方法稀释至各档浓度剂量，各组注射体积为0.5ml/20克鼠。

2.4.给药方案：静脉单次给药。

2.5.试验主要步骤：采用Bliss法试验，取昆明小鼠随机分组，每组20只小鼠，雌雄各半。按设计的剂量方案对小鼠尾静脉注射，注射速度严格控制在1ml/1分钟。观察即时反应，统计动物死亡数。

3.实验结果

八肽菌素静脉单次给药对昆明种小鼠急性毒性LD50为15.459mg/kg。(雌性动物LD50为15.57mg/kg，雄性动物LD50为15.327mg/kg，雌雄动物间无显著性差异)。

实施例5：小鼠保护实验

1.方法：

第一批取ICR小鼠35只，雄性，体重18～22g，随机分为7组，每组5只，分别腹腔注射用1％酵母悬液按1∶10等比稀释的5种浓度(浓度分别为2×10⁸、2×10⁷、2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴个/ml)的大肠杆菌菌液0.5ml/只，记录一周内的死亡情况，结果见表3。从表3结果可见，2×10⁸个/ml浓度的大肠杆菌引起100％小鼠死亡，2×10⁷个/ml浓度的大肠杆菌引起80％小鼠死亡，2×10⁶个/ml浓度的大肠杆菌仅引起20％小鼠死亡，由此确定正式试验采用2×10⁷个/ml浓度大肠杆菌菌液进行感染。

第二批试验取ICR小鼠77只，体重18～22g，雌性，腹腔注射用1％酵母悬液稀释的大肠杆菌混悬液(浓度2×10⁷个/ml)，随机分为对照组、多粘菌素B(PMB)4mg/kg阳性对照单次给药组、PMB 4mg/kg阳性对分次给药照组、八肽菌素(OCT)高剂量(8mg/kg)单次给药组、OCT高剂量(8mg/kg)分次给药组、OCT中剂量(4mg/kg)单次给药组、OCT中剂量(4mg/kg)分次给药组、OCT低剂量(2mg/kg)单次给药组、OCT低剂量(2mg/kg)分次给药组，每组8～9只，分别静脉注射给予相应药物，给药方式为：单次给药组首日感染后1h内立刻给药，每天1次，连续3天；分次给药组在首日感染后4h给药1次，次日相同剂量但分成两次给药(间隔4h)，第3日剂量减半给药1次，给药体积均为0.2ml/10g体重，对照组给予等体积生理盐水；记录各组小鼠一周内的死亡情况，计算死亡率，结果见表4。

2.结果：

从表4结果可见，腹腔注射2×10⁷个/ml浓度的大肠杆菌小鼠的死亡率为87.5％，八肽菌素各剂量无论是单次给药或分次给药，均能使感染小鼠的死亡率明显降低(P＜0.05，与对照组比较)，表明该剂量范围对大肠杆菌有明显的体内抗菌作用。

表3：大肠杆菌最佳感染浓度预试验结果

注：X2检验，*P＜0.05(与对照组比较)。

Claims

1.一种八肽菌素，结构如式(I)所示：

2.如权利要求1所述的八肽菌素的制备方法，所述方法包括：将类芽孢杆菌(Paenibacillus tianmuensis)CCTCC No：M 209149接种至发酵培养基，于28～32℃下培养72～120h，发酵液离心取上清液，上清液经分离纯化得到所述多肽菌素。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述分离纯化方法如下：上清采用大孔吸附树脂进行固相萃取，先用蒸馏水和10～30％甲醇水溶液冲洗，然后用40～90％甲醇水溶液洗脱，收集活性洗脱液成分，浓缩蒸干得到粗品；粗品用甲醇溶解，离心过滤先用C-18固相萃取柱进一步纯化，然后进行高效液相色谱层析，收集活性组分，浓缩蒸干即可得到所述八肽菌素。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖，1～10g/L；(NH₄)₂SO₄，0.5～2.0g/L；MgSO₄.7H₂O，0.1～0.5g/L；NaCl，0.05～0.5g/L；CaCl₂，0.05～0.5g/L；FeSO₄，0.005～0.05g/L；ZnSO₄，0.005～0.05g/L；MnSO₄.H₂O，0.001～0.01g/L；KH₂PO₄，1～5g/L；溶剂为水，pH7.0～7.2。

5.如权利要求1所述的八肽菌素在制备抗菌制剂中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述八肽菌素用于制备抗细菌感染的药物。