CN110121349A - 铋(iii)化合物及其方法 - Google Patents

Abstract

本公开内容涉及一种药物组合物，其包含:(a)β‑内酰胺抗生素和(b)金属‑β‑内酰胺酶(MBL)抑制剂。所述抑制剂涉及Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐。本专利也提供了制备Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐的方法。还提供了一种使用金属替换机制治疗产生MBL的细菌感染的方法。

Description

铋(III)化合物及其方法

1.介绍

本文中公开了一种药物组合物，其包含：(a)β-内酰胺抗生素和(b)金属-β-内酰胺酶(MBL)抑制剂。在一个实施方案中，所述抑制剂涉及Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐。更具体地，所述药物组合物包含有效量的：(a)β-内酰胺抗生素；和(b)Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐。还提供了一种用于预防或治疗产生MBL的细菌感染的方法。本公开内容也提供了制备包含β-内酰胺抗生素和MBL抑制剂的组合物的方法。本公开内容也涉及Bi(III)化合物对MBL活性的调节。所述MBL抑制剂使用金属替换机制来抑制MBL。在某些实施方案中，公开的组合物包含这样的化合物：其为用于治疗表面的(topical)、局部的和/或全身的细菌感染的广谱抗细菌剂。在某些实施方案中，将公开的化合物用于治疗由产生MBL的细菌病原体造成的感染。本文提供了医疗装置，其包含含有本文中公开的化合物的涂层。本文提供了制备医疗装置的方法，所述医疗装置包含含有本文中公开的化合物的涂层。本文提供了制备抗-生物膜表面的方法。

2.背景

β-内酰胺抗生素是在细菌感染的治疗中最广泛地使用的抗细菌药(antibacterial drugs)。作为凶猛的抵抗，细菌产生被称作β-内酰胺酶的酶，其分解β-内酰胺，从而导致对这类抗生素的广谱耐药性。β-内酰胺酶的出现和传播构成对全球公共卫生的巨大威胁^1-3。

基于独特的酶机制，可以将β-内酰胺酶在功能上分为两大类，即丝氨酸-β-内酰胺酶(SBL)和金属-β-内酰胺酶(MBL)，其中前者采用丝氨酸作为亲核体，后者使用锌离子分解β-内酰胺环⁴。MBL被视作更有害的β-内酰胺酶，其由于它们的独特的酶机制而赋予对β-内酰胺抗生素的广谱耐药性^5-7。这主要由于以下：(1)MBL的耐药性决定簇经常在活动基因元件上编码，且可以容易地通过水平基因转移在多个细菌物种内部/之间传播。主要的MBL生产者(肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，包括埃希氏菌属种(Escherichia spp.)、克雷伯氏菌属种(Klebsiella spp.)、假单胞菌属种(Pseudomonas spp.)、不动杆菌属种(Acinetobacter spp.)和肠球菌属种(Enterococcus.spp.))可以容易地在社区和甚至健康护理背景中发现，并通过手运输、食品和水在人们之间传播^8-11。(2)MBL具有强烈的β-内酰胺酶活性且能够水解或灭活最常用的β-内酰胺抗生素，诸如头孢菌素类和碳青霉烯类(carbapenems)。此外，大多数产生MBL的肠道细菌菌株能够共表达其它类型的耐药性基因，包括编码其它β-内酰胺酶(AmpC、ESBL、OXA-48和KPC)和其它抗生素的耐药性决定簇的那些，所述其它抗生素包括荧光喹诺酮类(qnrA6和qnrB1)、氨基糖苷类(armA、rmtA和rmtC)、大环内酯类(acrolides)(ereC)、利福平(arr-2)和磺酰胺(sul-2)^4,12,13。MBL的最新实例是新德里金属-β内酰胺酶-1(“NDM-1”)。在2009年，首次报道一位瑞典患者在从印度返回后被产生NDM-1的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)感染，所述肺炎克雷伯氏菌具有对多种抗生素(包括所有的碳青霉烯类)的耐药性⁹。此后，NDM-1已经传播至所有有人居住的洲，其中印度次大陆和中国作为两个最大的蓄池出现，因此NDM-s经常在大量媒体中被视作臭名昭著的“超级细菌”^14-23。但是，没有出现针对由NDM-1造成的感染的有效治疗。

迄今为止缺少临床上可利用的特异性地靶向MBL的抑制剂。由于以下两个方面，认为MBL比SBL更有威胁性：(1)MBL的活性部位的体系结构在微生物体之间极大地变化。因而，它仍然是设计针对不同细菌中的所有MBL的抑制剂的巨大挑战。(2)不像SBL，MBL不具有或具有极少的稳定的反应中间体，这极大地增加了复制SBL抑制剂(诸如克拉维酸)的抑制模式的困难^7,12。

迄今，为了MBL抑制剂的开发已经做出大量努力。一种代表性的MBL抑制剂是2014年在Nature中报道的曲霉明A(AMA)，其对多种革兰氏阴性细菌中的MBL(主要对于NDM-1和VIM-2)是有效的，且对肺炎克雷伯氏菌(NDM⁺)发挥良好的体内效力²⁸。另一个实例是绕丹宁-衍生的含硫烯醇化物(thioenolate)，其表现出对MBL的有效广谱活性。通过晶体学发现所述含硫烯醇化物经由二锌螯合作用结合VIM-2²⁹。此后，相当多的MBL抑制剂开始出现并在该领域中做出进步，但是尚未证实它们的体内效力。以上实例反映了处理MBL的常规方式，即设计能够与在活性部位中的Zn(II)配位或螯合的抑制剂，诸如羧酸和含有巯基的化合物。但是这样的策略经常遭受相对差的选择性和低效力，且不可能开发出广谱的MBL抑制剂，更不要提微生物产生对那些有机抑制剂的耐药性的隐藏忧虑。此外，尽管一些FDA批准的药物(诸如DL-卡托普利、谷胱甘肽和2,3-二巯丙醇³⁰)已经用在研究中，但是尚未批准临床上可利用的MBL抑制剂。因此，似乎缺乏有关的MBL抑制剂的开发。

3.发明内容

本文提供了一种组合物，其包含:(a)β-内酰胺抗生素；和(b)金属-β-内酰胺酶(MBL)抑制剂。所述抑制剂涉及Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐，它们通过前所未有的金属替代机制调节MBL的活性。另外，MBL抑制剂是用于治疗由产生MBL的细菌病原体造成的感染的有效β-内酰胺抗生素配偶体。在某些实施方案中，用公开的组合物治疗的感染是由对β-内酰胺抗生素具有耐药性的细菌造成。在某些实施方案中，所述β-内酰胺抗生素具有以下核心结构:

β-内酰胺核心结构.(A)青霉烷.(B)碳青霉烷.(C)氧青霉烷.(D)青霉烯.(E)碳青霉烯.(F)单酰胺菌素.(G)头孢烯.(H)碳头孢烯.(I)氧头孢烯

在某些实施方案中，所述β-内酰胺族抗生素是青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类。在某些实施方案中，所述细菌是革兰氏阴性的。在某些实施方案中，所述细菌产生金属-β-内酰胺酶(“MBL”)。在某些实施方案中，所述MBL是亚胺培南酶(imipenemase)(“IMP”)、Verona整联蛋白编码的金属-β-内酰胺酶(“VIM”)和新德里金属-β-内酰胺酶(“NDM”)。

本文提供了通过将Bi(III)药物重新定位或将Bi(III)与含有N、O或S的配体配位而制备Bi(III)化合物的方法。Bi(III)化合物的配体的例子包括、但不限于：

本文提供了包含Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐的组合物。在某些实施方案中，所述Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐是Bi(III)复合物(complex)。在某些实施方案中，所述Bi(III)复合物包括在表1中列出的复合物。

还提供了使用Bi(III)化合物调节MBL活性的方法。本文提供了治疗细菌感染的方法。本文提供了一种药物组合物，其包含：(a)β-内酰胺抗生素；和(b)Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐，作为用于治疗产生MBL的细菌感染的药物。在某些实施方案中，所述Bi(III)化合物是碱式水杨酸酸铋(“BSS”)、碱式没食子酸铋(“BSG”)、胶体碱式枸橼酸铋(“CBS”)和雷尼替丁枸橼酸铋(“RBC”)。

本文描述的组合物还表现出对细菌生物膜的有效抗-生物膜活性，所述细菌生物膜对目前可得到的抗细菌剂具有耐药性。在某些实施方案中，所述组合物是对抗广谱细菌感染的抗细菌剂。本文还描述了包含Bi(III)化合物的组合物。在某些实施方案中，所述组合物是药物组合物，其包括溶液、混悬剂、凝胶、流体凝胶、乳剂、乳剂凝胶、洗剂、软膏剂、薄膜形成溶液、乳膏剂、喷雾剂和漆剂(lacquers)。具体地，所述抗细菌组合物用于治疗或预防受试者中的局部或全身细菌感染。在具体实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在具体实施方案中，所述受试者是人。在一个实施方案中，本文提供了治疗细菌感染的方法，所述方法包括给受试者施用药物制剂，所述药物制剂包含治疗有效量的与Bi(III)化合物组合的一种或多种抗细菌剂。

4.附图说明

图1显示了示例性的临床上使用的铋化合物、胶体碱式枸橼酸铋(CBS)的基本二聚体单元。

图2显示了在用不同量的Bi(III)化合物处理人肝细胞(MIHA)以后通过XTT测定进行的细胞生存力试验。

图3显示了CBS对经纯化的NDM-1和VIM-2的酶活性的抑制，IC₅₀值分别为5.83μM和44.45μM。

图4显示了天然的NDM-1和Bi结合的NDM-1(Bi-NDM-1)对美罗培南(MER)的水解速率的对比。对应的V_max和K_m值总结在表3中。

图5显示了通过ICP-MS确定的Bi(III)对NDM-1中的Zn(II)的置换。将递增量的CBS加入天然的NDM-1样品，Zn(II)被逐渐释放，且1摩尔当量的Bi(III)的结合导致2摩尔当量的Zn(II)被从NDM-1替换。

图6显示了加入0.2-1.5摩尔当量的Bi(III)以后apo-NDM-1的不同紫外-可见光谱。插图显示了在340nm的吸光度的变化。

图7显示了在补充不同浓度的ZnSO₄以后apo-NDM-1和Bi-NDM-1的酶活性的对比。

图8(a)-(c)显示了(a).经纯化的在大肠杆菌(BL21)细胞中表达的NDM-1的SDS-PAGE，所述细胞携带在pET-28a载体中的NDM-1基因。(b)从经纯化的天然的NDM-1生长的晶体的照片。(c)衍射图像显示了晶体的合理衍射(在上海光源(Shanghai SynchrotronRadiation Facility)中的BL17U1站收集数据)。

图9(a)-(b)显示了(a)天然的NDM-1的活性部位的X-射线结构，其中两个Zn(II)离子用灰色球显示，桥连羟基亲核体用红色球显示。(b)Bi结合的NDM-1的活性部位的X-射线结构，在1σ的波状外形的Bi的不规则密度以紫色显示。

图10(a)-(b)显示了针对(a)大肠杆菌(NDM-1⁺)和(b)大肠杆菌(NDM-1^-)的临床分离物在MER和CBS上的西洋跳棋盘(checkerboard)MIC分析的热图。

图11显示了在没有或有Bi(III)化合物存在下在暴露于不同抗生素后大肠杆菌(NDM-1⁺)的细胞生存力百分比。应当指出，观察到抗生素的活性的明显恢复。在该试验中使用的浓度是：CBS 32μg mL^-1，Bi-NAC 16μg mL^-1，所有抗生素32μg mL^-1。缩写：AMOX：阿莫西林；AMP：氨苄西林；NAF：萘夫西林；CEF：头孢地尼。

图12显示了在用MER、CBS和它们的组合处理多达24小时后对数期生长的大肠杆菌(NDM-1⁺)的时间-杀死曲线。对于MER和CBS，药物的浓度分别是16μg mL^-1和32μg mL^-1。

图13显示了暴露于相同浓度的MER或者MER和CBS的组合的大肠杆菌(NDM-1⁺)的突变频率的热图。

图14(a)-(b)显示了在(a)细胞相关的模型和(b)细胞侵入模型中在没有或有CBS(32μg mL^-1)存在下在用递增浓度的MER处理后的细菌密度。

图15是表明在鼠腹膜炎感染模型中的效力的存活曲线。将BALB/c小鼠通过腹膜内注射用致命剂量的大肠杆菌临床分离物(NDM-1⁺)感染，并在感染后4h用一剂治疗，随后通过腹膜内注射每天2次治疗。分别用MER(5mg kg^-1)、CBS(20mg kg^-1)、MER(5mg kg^-1)和CBS(20mg kg^-1)的组合、CBS(20mg kg^-1，在没有细菌存在下)和PBS治疗了5组小鼠。P<0.001，Mantel-Cox检验。

4.1定义

术语“抗生素”在本文中表示杀死或抑制细菌生长的化合物。

术语“金属-β-内酰胺酶”在本文中表示由细菌产生的一类金属酶，其通过催化β-内酰胺环中的酰胺键的水解而赋予所述细菌对β-内酰胺抗生素的耐药性，并从而消除所述β-内酰胺抗生素的抗细菌性能。

本文描述的术语“抑制剂”表示结合酶并阻碍所述酶发生它的催化反应的分子。

术语“Bi(III)化合物”表示铋药物，例如，包括、但不限于碱式水杨酸酸铋(“BSS”)、碱式没食子酸铋(“BSG”)、基于柠檬酸盐的铋化合物例如胶体碱式枸橼酸铋(“CBS”)和雷尼替丁枸橼酸铋(“RBC”)，或Bi(III)化合物包含与含有N、O或S的配体(但不限于此)配位的Bi(III)的复合物。涉及的配体包括、但不限于：

术语“细胞毒性”表示对细胞有毒的性质。

术语“产生MBL的细菌病原体”和“产生MBL的细菌”表示天然地或通过分子生物学试剂(诸如异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG))的诱导而产生MBL的细菌病原体。

术语“临床上有关的敏感范围”表示基于药物、试验化合物和临床试验的可得到的血清浓度认为生物体敏感时的抑制地带或MIC。

术语“协同效应”表示，当组合效应大于各种组分的效应的总和时，两种或更多种化合物或化学物质之间的相互作用。

术语“体外”表示在它们的正常生物学背景以外用微生物体、细胞和生物分子实现的实验。术语“体内”表示使用整个活生物体而不是部分或死生物体的实验，其最常见地以动物研究和临床试验为代表。

术语“生化方法”表示在生物化学领域中使用的那些常规实验技术，其在本文中包括分子克隆、蛋白表达和纯化以及蛋白表征。‘分子克隆’表示将期望的DNA片段工程改造进载体中的一般方法，所述载体用于容纳和保存所述片段以及指导它们在宿主细胞内的自我复制以便于蛋白表达和纯化。‘蛋白表达’涉及使用一些小分子来刺激宿主细胞以在细胞内以对于实验应用而言足够的大量从所述DNA产生期望的蛋白。‘蛋白纯化’表示将期望的蛋白与存在于细胞内的其它不希望的分子分离从而极大地增强得到的蛋白样品的同质性。

术语“蛋白表征”表示用于阐明经纯化的蛋白的结构和功能的各种物理和生化技术。术语‘金属含量’表示在不同的金属-蛋白中金属离子与蛋白之比。术语‘酶活性’表示每单位时间转化的底物的摩尔量，并且是用于评价和对比在有或没有抑制剂存在下酶的反应速率的标准参数。

术语“药学上可接受的盐”表示本文提供的化合物的任何盐，其暴露它的生物学特性且其对于药物用途而言不是有毒的或在其它方面不希望的。这样的盐可以从本领域众所周知的多种有机和无机抗衡离子衍生出。

术语“溶剂化物”包括本文提供的化合物或其盐，其还包括化学计量的或非化学计量的量的通过非共价分子间力结合的溶剂。

术语“受试者”和“患者”在本文中可互换地使用。术语“受试者”和“对象”表示动物，诸如哺乳动物，包括非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类动物(例如，猴诸如食蟹猴、黑猩猩和人)，和例如，人。

术语“有此需要的受试者”表示具有细菌感染的受试者，或处于发生细菌感染的风险中的受试者。如本文中所述或使用本领域技术人员已知的标准医学技术，所述受试者可能已经被诊断为具有这样的细菌感染。可替换地，受试者可能表现出细菌感染的一种或多种症状。

术语“化合物”、“药剂”和“药物”是可互换的。

术语“治疗剂”和“治疗试剂”表示可以用于治疗或预防感染的任何药剂。在某些实施方案中，术语“治疗剂”包括本文提供的化合物。在一个实施方案中，治疗剂是已知可用于、或已经或当前被用于治疗或预防感染的药剂。

术语“治疗有效量”包括这样的化合物或组合物的量：当为了治疗感染施用给受试者时，其足以实现这样的治疗。除了别的以外，“治疗有效量”可以随化合物、感染和它的严重程度、以及要治疗的受试者的年龄、重量等而变化。

在一个实施方案中，术语任何感染的“治疗”或“处理”表示改善受试者中存在的感染。在另一个实施方案中，“治疗”或“处理”包括改善至少一个身体参数，其可能是受试者不可辨别的。它意图包括阻止、改善、治愈、减少细菌生长，或阻止细菌生长的任何增加。

术语“减少细菌生长”包括干扰细菌细胞生长或处理，其可以通过细胞数目的减少、细胞分裂的减少来确定。

术语“约”表示数值±0.5。

术语“耐药性的”、“耐药性”和“产生耐药性”表示不再对化合物或药物有应答的细菌或细菌感染，所述化合物或药物在以前有效地减少细菌生长或阻止细菌生长的任何增加。

5.发明详述

5.1金属-β-内酰胺酶抑制剂

在以下详细描述中，阐述了众多具体细节以提供要求保护的主题的彻底理解。但是，本领域技术人员将理解，要求保护的主题可以在没有这些具体细节的情况下实践。在其它情况下，普通技术人员已知的方法、装置或系统没有进行详细描述也不会使要求保护的主题模糊。应当理解，描述的特定部件、结构或特征可以在一个或多个实现中以不同的方式组合。

本文提供了一种新的广谱MBL抑制剂类型—Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐，其通过金属替代机制来调节MBL活性。本文提供了通过与β-内酰胺抗生素一起施用MBL抑制剂来治疗产生MBL的细菌感染的方法。

本文提供了通过将Bi(III)药物重新定位和将Bi(III)与含有N、O或S的配体配位而制备Bi(III)化合物的方法。Bi(III)化合物的配体的例子包括、但不限于：

本文提供了包含Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐的组合物。在某些实施方案中，所述Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐是Bi(III)复合物。在某些实施方案中，所述Bi(III)复合物包括在表1中列出的复合物。

在某些实施方案中，所述β-内酰胺抗生素和MBL抑制剂具有按重量(w/w)计算在1:16、2:15、3:14、4:13、5:12、6:11、7:10、8:9、9:8、10:7、11:6、12:5、13:4、14:3、14:3、15:2、16:1范围内的摩尔比。在某些实施方案中，所述β-内酰胺抗生素和MBL抑制剂具有按重量(w/w)计算在1:16至16:1范围内的摩尔比。

β-内酰胺抗生素是以在它们的结构的核心处的它们的四元、含氮β-内酰胺环为特征的一大类抗生素。β-内酰胺抗生素的例子包括、但不限于青霉素衍生物(青霉烷类)、头孢菌素类(头孢烯类)、碳青霉烯类和单酰胺菌素类。

在一个实施方案中，所述β-内酰胺抗生素是属于碳青霉烯的美罗培南(“MER”)，且具有针对多种细菌的拓宽谱的抗细菌活性。类似于其它β-内酰胺抗生素，MER的β-内酰胺环部分结合不同的DD-转肽酶，即在细胞膜中的青霉素结合蛋白(“PBP”)，使它们不能执行它们在细菌细胞壁的肽聚糖层的合成中的作用。由于渗透压不稳定性或自溶，这导致细菌死亡。MER的结构由下式表示：

通过X-射线晶体学揭示了Bi(III)的作用机理，其表明一个铋离子被两个锌离子替换，从而导致MBL的灭活。基于在这些细菌中通过相同机制灭活MBL的事实，本文中公开的Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐充当广谱MBL抑制剂。在某些实施方案中，Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐没有表现出或表现出可忽略的对人细胞的体外细胞毒性。在某些实施方案中，所述铋化合物表现出对MBL的良好抑制活性。应用Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐后，β-内酰胺抗生素显示出恢复的抗微生物活性并在临床上有关的敏感范围内阻止生长或杀死产生MBL的细菌。在一个实施方案中，所述MER和CBS的组合在体外细菌感染的治疗中发挥协同效应。在某些实施方案中，当与CBS共同施用时，MER在体内鼠腹膜炎感染模型中表现出增强的效力。在某些实施方案中，与不含Bi(III)复合物或其药学上可接受的盐的抗生素相比，所述Bi(III)复合物或其药学上可接受的盐的抗细菌效力增强了2-4、4-6、6-8倍。在某些实施方案中，在有Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐存在下MER的抗细菌效力与单独的MER相比增强了4-8倍。

在某些实施方案中，不同复合物的Bi(III)中心以单体、二聚体或聚合物的形式存在于溶液中。Bi(III)配位核心经常是带负电荷的，因而需要至少一个抗衡阳离子(counter-cation)来实现电中性。在某些实施方案中，其药学上可接受的盐包括从带电荷的铋复合物和抗衡阳离子和/或阴离子产生的那些。

在某些实施方案中，MBL需要Zn(II)才能催化且能够水解β-内酰胺抗生素。例子包括、但不限于，BCII、CcrA、IMP、VIM、NDM和DIM。在某些实施方案中，所述β-内酰胺酶包括NDM-1、VIM-2和IMP-4。

在某些实施方案中，所述抑制剂表示Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐。

本文描述的Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐涉及稳定的Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐。Bi(III)化合物包含与含有N、O或S的配体(但不限此)配位的Bi(III)的复合物。涉及的配体包括、但不限于：

鉴于暴露于细胞毒性物质的细胞可能经历坏死，其中它们丧失膜完整性并由于细胞裂解而快速死亡；或它们可能停止生长和繁殖；或它们可能开始细胞凋亡，这是受控的细胞死亡的遗传程序。在一个实施方案中，使用XTT测定来检查Bi(III)复合物对人细胞的细胞毒性。所述人细胞系包括、但不限于人肝细胞细胞系(MIHA)。

在某些实施方案中，产生MBL的细菌的实例包括、但不限于一些肠道细菌菌株，诸如大肠杆菌(NDM-1⁺)、大肠杆菌(VIM-2⁺)、大肠杆菌(IMP-4⁺)、肺炎克雷伯氏菌(NDM-1⁺)和弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)(NDM-1⁺)。

在一个具体实施方案中，根据欧洲抗微生物药物敏感性试验委员会的标准(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)，碳青霉烯对肠杆菌科的临床上有关的敏感范围是≤2μg mL^-1。

在某些具体实施方案中，通过分级抑制浓度指数(FICI)的计算来定量协同效应。

在一个具体实施方案中，选择madin-darby犬肾(MDCK)细胞作为体外细菌感染实验的背景。在一个具体实施方案中，选择BALB/c小鼠作为体内鼠感染实验的背景。

在某些实施方案中，通过确定NDM-1蛋白的‘金属含量’和‘酶活性’，研究经纯化的NDM-1的抑制机制。发现在人类和微生物中的约四分之一至30％的蛋白结合各种重要的金属离子以发挥它们的体内功能，且它们通常被视作‘金属-蛋白’。在某些实施方案中，研究了Bi(III)和Zn(II)含量。

在一个实施方案中，使经纯化的NDM-1结晶，并与Bi(III)化合物一起温育，随后X-射线衍射实验以产生蛋白的三维结构数据。然后如在下面的实施例部分中所述使用合适的结构生物学计算机软件观察Bi(III)与蛋白的结合。

5.2联合治疗

如本文中所述的化合物可以任选地与其它抗细菌剂一起以抗细菌混合液的形式递送，或单独地递送，但是在时间上足够接近以对感染的治疗具有协同效应。抗细菌混合液是本文所述化合物中的任一种与另一种抗细菌药物的混合物。在一个实施方案中，为如本文中所述的化合物和其它抗细菌剂使用共同施用媒介物(例如，片剂、植入物、可注射的溶液、可注射的脂质体溶液等)。

5.3药物组合物

使用本领域中可得到的方法和本文中公开的那些，可以将本文中公开的化合物配制成药物组合物。这样的化合物在某些实施方案中可以用于增强所述化合物向受试者的递送。

本文提供的方法包括施用药物组合物，其含有至少一种如本文中所述的化合物，如果合适的话，以盐形式，其单独使用或以与一种或多种相容的且药学上可接受的载体(诸如稀释剂或辅助剂(adjuvant))或与另一种抗细菌剂组合的形式使用。在某些实施方案中，根据本领域技术人员，第二药剂可以与本文提供的化合物一起配制或包装，这样的共同制剂不应当干扰任一种试剂的活性或施用方法。在某些实施方案中，本文提供的化合物和第二药剂单独地配制。为了本领域技术从业人员的方便，它们可以一起包装或单独地包装。在临床实践中，本文提供的活性剂可以通过任何常规途径施用，特别是口服地、胃肠外地、直肠地或通过吸入(例如以气雾剂的形式)。在某些实施方案中，口服地施用本文提供的化合物。作为用于口服施用的固体组合物，可以使用片剂、丸剂、硬明胶胶囊剂、散剂或颗粒剂。在这些组合物中，将活性产物与一种或多种惰性稀释剂或辅助剂(诸如蔗糖、乳糖或淀粉)混合。这些组合物可以包含除了稀释剂以外的物质，例如润滑剂，诸如硬脂酸镁，或意图用于控释的包衣剂。作为用于口服施用的液体组合物，可以使用含有惰性稀释剂(诸如水或液状石蜡)的药学上可接受的溶液、混悬剂、乳剂、糖浆剂和酏剂。这些组合物还可以包含除了稀释剂以外的物质，例如润湿剂、甜味剂或调味品。用于胃肠外施用的组合物可以是乳剂或无菌的溶液。作为溶剂或媒介物，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(特别是橄榄油)或可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。这些组合物还可以含有辅助剂，特别是润湿剂、等渗剂、乳化剂、分散剂和稳定剂。灭菌可以以几种方式进行，例如使用细菌滤器、通过辐射或通过加热。它们还可以以无菌固体组合物的形式制备，所述无菌固体组合物在使用时溶解在无菌水或任何其它可注射的无菌介质中。用于直肠施用的组合物是栓剂或直肠胶囊剂，其除了活性成分以外还含有赋形剂诸如可可脂、半合成的甘油酯或聚乙二醇。所述组合物还可以是气雾剂。对于以液体气雾剂形式使用，所述组合物可以是稳定的无菌的溶液或固体组合物，所述固体组合物在使用时溶解在无菌水、盐水或任意其它药学上可接受的媒介物中。对于以意图直接吸入的干燥气雾剂形式使用，将活性成分精细粉碎并与水溶性固体稀释剂或媒介物(例如右旋糖酐、甘露醇或乳糖)组合。在一个实施方案中，本文提供的组合物是药物组合物或单个单元剂型(unit dosage form)。本文提供的药物组合物和单个单元剂型包含治疗有效量的一种或多种治疗剂(例如，本文提供的化合物或其它预防剂或治疗剂)和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。术语“载体”包括与治疗剂一起施用的稀释剂、辅助剂(例如，弗氏佐剂(adjunvant)(完全和不完全))、赋形剂或媒介物。这样的药用载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内地施用药物组合物时，可以使用水作为载体。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液还可以用作液体载体，尤其是可注射溶液的液体载体。合适的药用载体的例子记载在E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”。典型的药物组合物和剂型包含一种或多种赋形剂。合适的赋形剂是药学领域的技术人员众所周知的，合适的赋形剂的非限制性例子包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。特定赋形剂是否适合用于掺入药物组合物或剂型中取决于本领域众所周知的多种因素，包括、但不限于将剂型施用给受试者的方式和剂型中的具体活性成分。如果需要的话，所述组合物或单个单元剂型还可以含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。本文提供的不含乳糖的组合物可以包含本领域众所周知的和在例如美国药典中列出的赋形剂。一般而言，不含乳糖的组合物包含药学上适合的和药学上可接受的量的活性成分、粘合剂/填充剂和润滑剂。示例性的不含乳糖的剂型包含活性成分、微晶纤维素、预胶化淀粉和硬脂酸镁。本文还包括包含活性成分的无水药物组合物和剂型，因为水可以促进一些化合物的降解。使用无水或含有低水分的成分和低水分或低湿度条件，可以制备本文提供的无水药物组合物和剂型。应当制备并贮存无水药物组合物使得维持它的无水性质。因此，可以将无水组合物用已知阻止暴露于水的材料包装，使得它们可以被包括在合适的规定试剂盒中。合适包装的例子包括、但不限于气密密封的箔、塑料、单元剂量容器(例如，小瓶)、泡罩包和条状包。所述药物组合物和单个单元剂型可以呈溶液、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、持续释放制剂等的形式。口服制剂可以包括标准的载体诸如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这样的组合物和剂型将含有预防或治疗有效量的预防剂或治疗剂，在某些实施方案中，以纯化形式，以及合适量的载体，以便提供适合施用给受试者的形式。制剂应当适合施用模式。在一个特定实施方案中,所述药物组合物或单个单元剂型是无菌的并且呈适合施用给受试者(例如，动物受试者，诸如哺乳动物受试者，例如，人受试者)的形式。

将药物组合物配制成与它的预期施用途径相容。施用途径的例子包括、但不限于胃肠外施用，例如，静脉内、真皮内、皮下、肌肉内、皮下、口服、含服、舌下、吸入、鼻内、透皮、外用(topical)、透粘膜、肿瘤内、滑膜内和直肠施用。在一个具体实施方案中，根据常规操作将组合物配制为适合用于静脉内、皮下、肌肉内、口服、鼻内或外用施用给人类的药物组合物。在一个实施方案中，根据常规操作将药物组合物配制成用于皮下施用给人类。通常，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。在必要时，所述组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂诸如利多卡因(lignocamne)以缓解注射部位的疼痛。剂型的例子包括、但不限于：片剂；胶囊形片剂(caplet)；胶囊剂，诸如软的弹性明胶胶囊剂；扁囊剂；药片(cachet)；锭剂(lozenges)；分散体(dispersion)；栓剂；软膏剂；敷剂(cataplasm)(泥敷剂)；糊剂；散剂；敷料；乳膏剂；硬膏剂；溶液；贴剂；气雾剂(例如，鼻腔喷雾剂或吸入器)；凝胶剂；适合用于口服或粘膜施用给受试者的液体剂型，包括混悬剂(例如，水性的或非水性的液体混悬剂、水包油乳剂或油包水液体乳剂)、溶液和酏剂；适合用于胃肠外施用给受试者的液体剂型；和无菌的固体(例如，结晶性固体或无定形固体)，其可以重构以提供适合用于胃肠外施用给受试者的液体剂型。本文提供的剂型的组成、形状和类型通常根据其用途而变化。例如，在细菌感染的初次治疗中使用的剂型可以含有与在相同感染的维持治疗中使用的剂型相比更大量的一种或多种活性成分。类似地，胃肠外剂型可以含有与用于治疗相同疾病或障碍的口服剂型相比更小量的一种或多种它所包含的活性成分。这些和其它方式(其中本文包括的特定剂型将相对于彼此变化)是本领域技术人员可容易地明白的。参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第20版,Mack Publishing,Easton Pa.(2000)。典型剂型包含本文提供的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物，范围为约0.1mg至约1000mg/天，作为单次每日一次剂量在早晨施用或作为分份剂量在一天中与食物一起施用。特定剂型可以具有约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、100、200、250、500或1000mg活性化合物。口服剂型适合用于口服施用的药物组合物可以呈现为离散(discrete)剂型，例如，但不限于：片剂(例如，咀嚼片)、胶囊形片剂、胶囊剂和液体(例如，矫味的糖浆)。这样的剂型含有预定量的活性成分，且可以通过本领域技术人员众所周知的药学方法来制备。通常参见，Remington's PharmaceuticalSciences,第20版,Mack Publishing,Easton Pa.(2000)。

在某些实施方案中，本文提供了包含本文中公开的化合物的手消毒组合物。在某些实施方案中，本文提供了包含本文中公开的化合物的洗剂。

5.4剂量和单元剂型

在人治疗剂中，医生将根据预防性或治愈性治疗和根据要治疗的受试者的具体年龄、重量、感染的阶段和其它因素确定其认为最适当的剂量(posology)。在某些实施方案中，对于成人，剂量为约1至约1000mg/天，或对于成人为约5至约250mg/天或约10至50mg/天。在某些实施方案中，剂量为每位成人约5至约400mg/天或25至200mg/天。在某些实施方案中，也预见到约50至约500mg/天的剂量率。

在其它方面，提供了通过给有此需要的受试者施用有效量的本文提供的化合物或其药学上可接受的盐来治疗或预防受试者中的细菌感染的方法。在障碍或其一种或多种症状的预防或治疗中有效的化合物或组合物的量将随感染的性质和严重程度以及所述活性成分的施用途径而变化。频率和剂量也将随每个受试者特有的因素而变化，这取决于施用的具体疗法(例如，治疗或预防剂)、感染的严重程度、施用途径、以及受试者的年龄、体重、应答和既往医疗史。可以从来源于体外或动物模型试验系统的剂量-响应曲线外推有效剂量。

在某些实施方案中，组合物的示例性剂量包括毫克或微克量的活性化合物/千克的受试者或样品重量(例如，约10微克/千克至约50毫克/千克、约100微克/千克至约25毫克/千克、或约100微克/千克至约10毫克/千克)。对于本文提供的组合物，在某些实施方案中，给受试者施用的剂量是0.140mg/kg至3mg/kg受试者体重，基于活性化合物的重量。在某些实施方案中，给受试者施用的剂量是在0.20mg/kg至2.00mg/kg之间，或在0.30mg/kg和1.50mg/kg受试者体重之间。

在某些实施方案中，对于本文描述的病症，本文提供的组合物的推荐每日剂量范围是在约0.1mg至约1000mg/天的范围内，作为单次每日一次剂量或作为在一天中的分份剂量施用。在一个实施方案中，以相同分份剂量每天2次施用所述每日剂量。在某些实施方案中，每日剂量范围应当是约10mg至约200mg/天，在其它实施方案中，在约10mg和约150mg/天之间，在其它实施方案中，在约25和约100mg/天之间。在某些情况下，可能必须使用在本文公开的范围以外的活性成分的剂量，正如本领域普通技术人员会明白的。此外，应当指出，临床医师或治疗医师将结合受试者应答知晓如何以及何时中断、调整或终止疗法。

不同的治疗有效量可能适用于不同的感染，如本领域普通技术人员将容易地知道的。类似地，上述的剂量和给药频率计划也包括足以预防、控制、治疗或改善这样的感染、但是不足以造成或足以减轻与本文提供的组合物有关的不良作用的量。此外，当给受试者施用多剂量的本文提供的组合物时，并非所有的剂量都需要相同。例如，可以增加施用给受试者的剂量以改善组合物的预防或治疗效果，或可以减小所述剂量以减轻特定受试者正在经历的一种或多种副作用。

在某些实施方案中，基于活性化合物的重量，为了预防、治疗、控制或改善受试者中的感染或其一种或多种症状而施用的本文提供的组合物的剂量是0.1mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、10mg/kg或15mg/kg或更多受试者体重。在另一个实施方案中，为了预防、治疗、控制或改善受试者中的感染或其一种或多种症状而施用的本文提供的一种或多种组合物的剂量是0.1mg至200mg、0.1mg至100mg、0.1mg至50mg、0.1mg至25mg、0.1mg至20mg、0.1mg至15mg、0.1mg至10mg、0.1mg至7.5mg、0.1mg至5mg、0.1至2.5mg、0.25mg至20mg、0.25至15mg、0.25至12mg、0.25至10mg、0.25mg至7.5mg、0.25mg至5mg、0.5mg至2.5mg、1mg至20mg、1mg至15mg、1mg至12mg、1mg至10mg、1mg至7.5mg、1mg至5mg或1mg至2.5mg的单元剂量。在某些实施方案中，治疗或预防可以从本文提供的化合物或组合物的一个或多个负荷剂量开始，继之以一个或多个维持剂量。在这样的实施方案中，所述负荷剂量可以是例如约60至约400mg/天、或约100至约200mg/天，持续一天到五周。负荷剂量之后可以是一个或多个维持剂量。在某些实施方案中，每个维持剂量独立地是约10mg至约200mg/天，在约25mg和约150mg/天之间，或在约25和约80mg/天之间。维持剂量可以每天施用，并且可以作为单次剂量或作为分份剂量施用。在某些实施方案中，可以施用一定剂量的本文提供的化合物或组合物以实现活性成分在受试者的血液或血清中的稳态浓度。稳态浓度可以根据本领域技术人员可得到的技术来确定，或可以基于受试者的体格特征(诸如高度、重量和年龄)来确定。在某些实施方案中，施用足够量的本文提供的化合物或组合物以实现约300至约4000ng/mL、约400至约1600ng/mL或约600至约1200ng/mL的在所述受试者的血液或血清中的稳态浓度。在某些实施方案中，可以施用负荷剂量以实现约1200至约8000ng/mL、或约2000至约4000ng/mL的稳态血液或血清浓度1至5天。在某些实施方案中，可以施用维持剂量以实现约300至约4000ng/mL、约400至约1600ng/mL、或约600至约1200ng/mL的在所述受试者的血液或血清中的稳态浓度。在某些实施方案中，可以重复相同组合物的施用，并且所述施用可以间隔1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或6个月。在其它实施方案中，可以重复相同预防剂或治疗剂的施用，并且所述施用可以间隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或6个月。在某些方面，本文提供了适合施用的形式的包含化合物或其药学上可接受的盐的单元剂量。这样的形式在上面详述。在某些实施方案中，所述单元剂量包含1至1000mg、5至250mg或10至50mg活性成分。在特定实施方案中，所述单元剂量包含约1、5、10、25、50、100、125、250、500或1000mg活性成分。这样的单元剂量可以根据本领域技术人员熟悉的技术制备。将第二药剂的剂量用在本文提供的联合治疗中。在某些实施方案中，在本文提供的联合治疗中使用比已经或当前正在用于预防或治疗细菌感染的那些剂量更低的剂量。第二药剂的推荐剂量可以得自技术人员的知识。对于被批准用于临床应用的那些第二药剂，推荐的剂量描述在，例如，Hardman等人,编,1996,Goodman&Gilman's The Pharmacological Basis Of Basis OfTherapeutics第9版,Mc-Graw-Hill,New York；Physician's Desk Reference(PDR)第57版,2003,Medical Economics Co.,Inc.,Montvale,N.J.，它们通过引用整体并入本文。

在不同的实施方案中，间隔小于5分钟、间隔小于30分钟、间隔1小时、间隔约1小时、间隔约1至约2小时、间隔约2小时至约3小时、间隔约3小时至约4小时、间隔约4小时至约5小时、间隔约5小时至约6小时、间隔约6小时至约7小时、间隔约7小时至约8小时、间隔约8小时至约9小时、间隔约9小时至约10小时、间隔约10小时至约11小时、间隔约11小时至约12小时、间隔约12小时至18小时、间隔18小时至24小时、间隔24小时至36小时、间隔36小时至48小时、间隔48小时至52小时、间隔52小时至60小时、间隔60小时至72小时、间隔72小时至84小时、间隔84小时至96小时或间隔96小时至120小时，施用所述治疗(例如，在联合治疗中的本文提供的化合物和第二药剂)。在不同的实施方案中，间隔不超过24小时或间隔不超过48小时，施用所述治疗。在某些实施方案中，在相同患者就诊内施用两种或更多种治疗。在其它实施方案中，并行地施用本文提供的化合物和第二药剂。在其它实施方案中，间隔约2至4天、间隔约4至6天、间隔约1周、间隔约1至2周或间隔超过2周施用本文提供的化合物和第二药剂。在某些实施方案中，可以重复相同药剂的施用，且所述施用可以间隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或6个月。在其它实施方案中，可以重复相同药剂的施用，且所述施用可以间隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或6个月。在某些实施方案中，可以依次和在某一时间区间内将本文提供的化合物和第二药剂施用给患者，例如，哺乳动物，诸如人，使得本文提供的化合物可以与其它药剂一起起作用以提供与以其它方式施用它们相比增加的益处。例如，第二活性剂可以同时或以任何次序在不同时间点依次施用；但是，如果不是同时施用，那么它们应当在时间上足够接近地施用，从而提供期望的治疗或预防效果。在一个实施方案中，本文提供的化合物和第二活性剂在重叠的时间发挥它们的作用。每种第二活性剂可以以任何合适的形式并通过任何合适的途径单独地施用。在其它实施方案中，本文提供的化合物的施用是在第二活性剂的施用之前、同时或之后。在某些实施方案中，将本文提供的化合物和第二药剂周期性地施用给患者。周期疗法包括施用第一药剂(例如，第一预防剂或治疗剂)一段时间，随后施用第二药剂和/或第三药剂(例如，第二和/或第三预防剂或治疗剂)一段时间，并重复这种相继施用。周期疗法可以减轻对所述疗法中的一种或多种的耐药性的发生、避免或减轻所述疗法之一的副作用和/或提高治疗的效力。在某些实施方案中，以小于约3周、约每2周一次、约每10天一次或约每周一次的周期施用本文提供的化合物和第二活性剂。一个周期可以包括在每个周期约90分钟、每个周期约1小时、每个周期约45分钟期间通过输注施用本文提供的化合物和第二药剂。每个周期可以包括至少1周的休息、至少2周的休息、至少3周的休息。所施用的周期数为约1至约12个周期，更典型地约2至约10个周期，且更典型地约2至约8个周期。在其它实施方案中，将疗程并行地施用患者，即，第二药剂的各个剂量单独地、但是仍在时间区间内施用，使得本文提供的化合物可以与第二活性剂一起起作用。例如，可以与每2周一次或每3周一次施用的其它组分联合地每周一次施用一种组分。换而言之，即使治疗不是同时或在同一天施用，所述定量施用方案也并行地进行。第二药剂可以与本文提供的化合物累加地或协同地起作用。在一个实施方案中，将本文提供的化合物与一种或多种第二药剂一起并行地在相同药物组合物中施用。在另一个实施方案中，本文提供的化合物与一种或多种第二药剂在分开的药物组合物中并行地施用。在另一个实施方案中，本文提供的化合物在施用第二药剂之前或之后施用。也预见到通过相同或不同的施用途径(例如，口服和胃肠外)施用本文提供的化合物和第二药剂。在某些实施方案中，当本文提供的化合物与可能产生不利副作用(包括、但不限于毒性)的第二药剂并行地施用时，可以有利地在降至引起不利副作用的阈值以下的剂量施用第二活性剂。

5.5患者群体

在某些实施方案中，根据本文提供的方法治疗感染的受试者是具有或被诊断出感染的人。在其它实施方案中，根据本文提供的方法治疗感染的受试者是易患或易发感染的人。在某些实施方案中，根据本文提供的方法治疗感染的受试者是处于发生感染的风险中的人。

在一个实施方案中，根据本文提供的方法治疗感染的受试者是人类婴儿。在另一个实施方案中，根据本文提供的方法治疗感染的受试者是人类幼儿。在另一个实施方案中，根据本文提供的方法治疗感染的受试者是人类儿童。在另一个实施方案中，根据本文提供的方法治疗感染的受试者是人类成人。在另一个实施方案中，根据本文提供的方法治疗感染的受试者是中年人。在另一个实施方案中，根据本文提供的方法治疗感染的受试者是老年人。

在某些实施方案中，根据本文提供的方法治疗感染的受试者具有感染的复发。

在某些实施方案中，根据本文提供的方法治疗感染的受试者是约1至约5岁、约5至10岁、约10至约18岁、约18至约30岁、约25至约35岁、约35至约45岁、约40至约55岁、约50至约65岁、约60至约75岁、约70至约85岁、约80至约90岁、约90至约95岁或约95至约100岁或之间的任何年龄的人。在一个具体实施方案中，根据本文提供的方法治疗感染的受试者是18岁或更大的人。在一个特定实施方案中，根据本文提供的方法治疗感染的受试者是1岁至18岁之间的人类儿童。在一个特定实施方案中,根据本文提供的方法治疗感染的受试者是12岁至18岁之间的人。在一个特定实施方案中,所述受试者是男人。在另一个实施方案中，所述受试者是女人。在一个实施方案中，所述受试者是没有怀孕或没有处于哺乳期的女人。在一个实施方案中，所述受试者是怀孕或将要怀孕或处于哺乳期的女人。

在某些实施方案中，在任何不良作用或对治疗的不耐受性之前，给根据本文提供的方法治疗感染的受试者施用其药物组合物或联合治疗。

在某些实施方案中，根据本文提供的方法治疗感染的受试者是已经建立对以前的抗生素治疗(除了使用本文公开的疗法的治疗以外)的耐药性的人。在某些实施方案中，根据本文提供的方法治疗感染的受试者是已经接受一种或多种常规抗细菌疗法的人。在这些患者中包括已经发生抗生素耐药性感染的患者和尽管用现有疗法治疗仍然具有复发性感染的患者。在某些实施方案中，所述患者在以前已经用β-内酰胺族(β-lactum)抗生素治疗。在某些实施方案中，所述患者在以前已经用碳青霉烯治疗。在某些实施方案中，所述患者在以前已经用美罗培南、亚胺培南、厄他培南、多立培南、比阿培南、法罗培南、帕尼培南、雷珠培南、替比培南、托莫培南或它们的组合治疗。在某些实施方案中，所述患者已经发生对β-内酰胺族抗生素具有耐药性的感染。在某些实施方案中，所述患者已经发生对碳青霉烯具有耐药性的感染。在某些实施方案中，所述患者已经发生对美罗培南、亚胺培南、厄他培南、多立培南、比阿培南、法罗培南、帕尼培南、雷珠培南、替比培南、托莫培南或它们的组合具有耐药性的感染。

5.6试剂盒

还提供了用于用在细菌感染的治疗方法中的试剂盒。所述试剂盒可以包括本文提供的化合物或组合物、第二药剂或组合物、以及说明书，所述说明书给保健提供者提供关于用于治疗感染的用法的信息。可以以印刷形式或以电子介质(诸如软盘、CD或DVD)的形式或以可得到这样的说明书的网址的形式提供说明书。本文提供的化合物或组合物、或第二药剂或组合物的单元剂量可以包括这样的剂量：当施用给受试者时，可以在所述受试者中维持所述化合物或组合物的治疗或预防有效的血浆水平至少1天。在某些实施方案中，可以包括化合物或组合物作为无菌水性药物组合物或干粉(例如，冻干的)组合物。在某些实施方案中，提供了合适的包装。本文中使用的“包装”包括固体基质或材料，其通常用在某一系统中并且能够将本文提供的化合物和/或第二药剂保持在适合用于施用给受试者的固定限度内。这样的材料包括玻璃和塑料(例如、聚乙烯、聚丙烯和聚碳酸酯)瓶子、小瓶、纸、塑料和塑料箔层压的封套等。如果采用电子束灭菌技术，所述包装应当具有足够低的密度以允许内容物的灭菌。

本文描述的试剂盒含有一个或多个容器，所述容器含有所述的化合物、信号传递实体、生物分子和/或颗粒。所述试剂盒也含有关于混合、稀释和/或施用所述化合物的说明书。所述试剂盒也包括具有一种或多种溶剂、表面活性剂、防腐剂和/或稀释剂(例如，生理盐水(0.9％NaCl)或5％右旋糖)的其它容器以及用于将所述组分混合、稀释或施用给样品或需要这种治疗的患者的容器。

所述试剂盒的组合物可以提供为任意适合形式，例如，作为液体溶液或作为干燥的粉末。当提供的组合物是干粉时，通过加入合适的溶剂(其也可以提供)可以重构所述粉末。在其中需要所述组合物的液体形式的实施方案中，所述液体形式可以是浓缩的或随时可用的。所述溶剂将取决于化合物和使用或施用模式。药物组合物的合适溶剂是众所周知的且可在文献中得到。所述溶剂将取决于化合物和使用或施用模式。

所述试剂盒包含载体，所述载体被隔离以在封闭空间中容纳一个或多个容器诸如小瓶、试管等，所述容器中的每一个包含要在所述方法中使用的单独元件之一。例如，所述容器之一可以包含测定中的阳性对照。另外，所述试剂盒可以包括其它组分(例如，在测定中有用的缓冲液)的容器。

5.7治疗方法

本文提供了通过施用本文提供的一种或多种化合物来减少细菌生长的方法。所述方法包括使细胞与有效地减少细菌生长的量的一种或多种如本文中所述的化合物接触。本文提供了通过给有此需要的受试者施用有效地减少细菌生长的量的本文所述化合物来治疗受试者中的细菌感染的方法。

5.8涂覆医疗装置的方法

本文提供的化合物可以用于处理多种医疗装置，诸如导管、以及工业表面。细菌可以在血管内导管和其它医学植入物上形成生物膜。这些生物膜会增强抗微生物耐药性，且可以使抗细菌疗法难以治疗感染。感染的持久性可能需要取出所述装置，这可能是不希望的或甚至危及生命的。因此，本文提供了在医疗装置的材料或表面上使用本文所述化合物涂覆医疗装置的方法，所述医疗装置减轻或阻止细菌定居或具有随后的生物膜形成的感染。所述方法包括将本文描述的组合物应用于医疗装置的表面上。在某些实施方案中，所述组合物附着于医疗装置的表面。在某些实施方案中，所述组合物涂覆在医疗装置内。

在某些实施方案中，本文提供了一种组合物，其包含涂剂和一种或多种如本文中所述的化合物。还提供了修饰医疗装置的表面的方法。所述方法包括向医疗装置的表面的至少一部分提供组合物的一个或多个涂层以形成经涂覆的表面区域，所述组合物包含一种或多种如本文中所述的化合物。在某些实施方案中，所述医疗装置是可植入的医疗装置。在某些实施方案中，所述工业表面是不锈钢。在某些实施方案中，所述工业表面是塑料。在某些实施方案中，所述工业表面是外科手术台。在某些实施方案中，所述医疗装置是外科器械。

以下实施例解释了本文提供的代表性化合物的合成和应用。这些实施例无意、也不应当它们解释为限制要求保护的主题的范围。显而易见，除了本文特别描述的以外可以实践主题的范围。考虑到本文中的教导，主题的众多修改和变化是可能的，且因此在要求保护的主题的范围内。

6.实施例

6.1.实施例1：示例性铋复合物的制备

6.1.1复合物1、2、3和4的合成

合成了复合物1、2、3和4。以复合物1的合成为例，将5,10,15,20-四苯基-21H-23H-卟吩(L1,0.20mmol)加入吡啶(50mL)，并升高温度直到紫色溶液回流。然后加入Bi(NO₃)₃·5H₂O(2.10mmol)，并将溶液放置回流3小时。加入更多的Bi(NO₃)₃·5H₂O(4.10mmol)，并将溶液放置回流另外5小时。然后将得到的深绿色溶液冷却至室温，然后通过旋转蒸发除去大部分吡啶溶剂。然后将得到的绿色混合物在真空下干燥过夜以除去任何残余的溶剂。然后将得到的绿色固体用氯仿(20mL)洗涤并旋转蒸发以确保所有吡啶被除去。将此重复5次，随后在真空下干燥过夜。然后将深绿色固体在硅胶柱上纯化。使用干燥方法将所述化合物加载到柱上，并通过用20:1比例的氯仿和甲醇洗脱柱而得到产物。

6.1.2复合物5的合成

将Bi(NO₃)₃·5H₂O(1.00mmol)加入去离子水(50mL)中，得到混浊的白色溶液。升高温度直到溶液回流且已经变成无色。在此时，加入2-吡啶甲酸(3.00mmol)(L5)，并将得到的无色溶液放置回流2小时。然后将溶液冷却至室温，然后在真空下过滤以除去任何不溶性杂质。然后将无色滤液倾析进烧杯中，覆盖，并在室温静置2天，此后得到少量复合物的小无色晶体，其适合用于x-射线分析。然后通过真空过滤收集结晶产物。

6.1.3复合物7的合成

如下制备与硫代水杨酸(L7)的铋复合物：将Bi(NO₃)₃·5H₂O(1.00mmol)和硫代水杨酸(2.50mmol)溶解在DMSO(15mL)中，随后声处理直到溶解。将混合物在室温搅拌0.5小时，并然后用水和乙酸乙酯萃取。通过重结晶得到终产物，并用水和饱和的NaCl溶液洗涤，并然后在真空中干燥。

6.1.4复合物8的合成

将Bi(NO₃)₃·5H₂O(1.00mmol)在去离子水(15mL)中回流，直到溶液变成无色。加入2-羟基烟酸(1.00mmol)(L8)，并将混合物回流过夜。将任何残余的固体滤出，并将滤液在4℃放置几天。形成灰白色固体的小收率，并用小体积的去离子水洗涤。这剩下白色不溶性固体和黄色水溶液。使溶液放置结晶形成。

6.1.5复合物9的合成

在搅拌下，在室温将Bi(NO₃)₃·5H₂O(1.00mmol)溶解在乙醇(60mL)中0.5小时，随后加入8-羟喹啉(3.00mmol)(L9)。将溶液(其在加入配体后立即变成黄色)放置回流3小时，此后将它冷却至室温。然后将混浊的黄色溶液在真空下过滤，并收集澄清的黄色滤液。然后加入三乙胺和去离子水以造成黄色固体的立即沉淀。将溶液再次真空过滤，并使黄色粉末在真空下放置干燥过夜。

6.1.6复合物11和12的合成

通过通用方法合成了复合物11和12。以复合物12的合成为例，首先将(BiO)₂CO₃(2.50mmol)缓慢地加入热的EDTA-水溶液(100mL)中。将混合物在油浴上回流4小时，并然后趁热过滤。使滤液在4℃沉降1或2天，并通过缓慢蒸发得到小晶体。

6.1.7复合物13的合成

如下制备与四溴儿茶酚(L13)的铋复合物：将Bi(NO₃)₃·5H₂O(1.00mmol)和L13(1.00mmol)溶解在DMSO(20mL)中，并在室温搅拌1小时。然后将溶液用水和乙酸乙酯萃取，随后蒸发。将终产物用水和饱和的NaCl溶液洗涤，并然后在真空中干燥。

6.1.8复合物15的合成

将BiCl₃(1.00mmol)溶解在甲醇(15mL)中，随后加入HCl(37％,50μL)。加入卡托普利(3.00mmol)(L15)，并将混合物在室温在pH 2搅拌过夜。加入氢氧化钠以使pH增加至10。溶液的颜色变成橙色。在真空中除去甲醇，并将得到的固体过滤，并用最小体积的乙醇洗涤。

6.1.9复合物16的合成

在温和加热下，将Bi(NO₃)₃·5H₂O(1.00mmol)和2,2’-联吡啶(2.00mmol)(L16)溶解在最小体积的DMSO中。一旦完全溶解，将温热的无色溶液过滤并将无色滤液在室温放置静置14天以得到少量淡粉红色晶体，其适合用于x-射线分析。然后通过真空过滤收集结晶产物。

6.1.10复合物17的合成

将Bi(NO₃)₃·5H₂O(1.00mmol)和谷胱甘肽的还原形式(2.00mmol)(L17)溶解在去离子水(20mL)中，声处理，并在室温搅拌0.5小时。然后将溶液过滤以除去任何不溶性杂质，并然后缓慢地旋转蒸发以除去大部分水。然后将湿样品在冷冻干燥器中放置过夜并然后收集固体产物。

6.1.11复合物20的合成

将BiCl₃(1.00mmol)溶解在含有青霉胺(3.00mmol)(L20)的甲醇(15mL)中。颜色从无色变成黄色。将混合物在室温搅拌过夜，此后通过真空过滤除去任何固体。从得到的滤液除去溶剂，并形成黄色油。将其在4℃放置几天，产生黄色固体。将固体从甲醇中重结晶。

6.1.12复合物21的合成

将Bi(NO₃)₃·5H₂O(0.50mmol)和N-乙酰基-L-半胱氨酸(1.50mmol)(L21)溶解在去离子水(15mL)中并在室温放置搅拌1小时。将NaOH(3mL,1M)加入得到的黄色溶液以使pH升高至约6。然后将溶液过滤以除去任何不溶性杂质，并然后旋转蒸发以除去水。然后将固体产物用乙醇洗涤，并真空过滤以除去额外的NaNO₃。

复合物6(碱式水杨酸酸铋)和复合物14(碱式没食子酸铋)购自Alfa Aesar。复合物10(胶体碱式枸橼酸铋,CBS)和雷尼替丁枸橼酸铋(RBC)由Livzon PharmaceuticalGroup友情提供。这些示例的特征信息显示在表1中。

表1

表2

表3

6.2实施例2:示例性的Bi(III)复合物的细胞毒性

6.2.1XTT测定

根据生产商的说明书，使用细胞增殖试剂盒II XTT测定(Roche Diagnostics,USA)，测量来自铋对MIHA细胞的影响的生长和生存力特征。以100μl培养基/孔的终体积在平底96-孔平板(Costar,Corning Incorporated,NY,USA)中生长1-2×10⁴个细胞/孔过夜。然后将细胞暴露于铋化合物(1-100μM)2天。将在单独培养基下生长的那些细胞用作阴性对照。固定的温育阶段以后，将50μl XTT标记混合物加入每个孔，并将细胞在37℃在5％CO₂控湿气氛下温育2小时。通过分光光度计法在490nm检测甲臢(formazan)染料(仅由代谢活性细胞产生)的形成。从图2所示的XTT试验结果，除了9和13以外，大多数示例性铋复合物没有表现出或表现出非常低的对MIHA细胞的细胞毒性，甚至在100μM(最高剂量实验)。

6.3实施例3：酶抑制的体外机理研究

6.3.1野生型NDM-1和VIM-2表达载体的构建

全长NDM-1蛋白包含N-端信号肽(Met1-Pro28)，其在蛋白翻译后用于将蛋白引导至细菌周质，并随后在蛋白成熟过程中切掉。如下所述制备野生型表达载体pET-28a-NDM-1和pET-28a-VIM-2。使用KOD热启动DNA聚合酶(Novagen)执行聚合酶链式反应(PCR)。将合成的引物对“NDM-1_29-270_WT_for/NDM-1_29-270_WT_rev”或“VIM-2_21-226_WT_for/VIM-2_21-226_WT_rev”(Life Technologies)分别用于扩增编码NDM-1蛋白(Gly29-Arg270)或VIM-2蛋白(Ser21-Glu266)的基因。结果，分别在扩增的NDM-1和VIM-2基因的5’和3’末端处掺入了NdeI和EcoRI限制位点。然后分别将NDM-1和VIM-2基因在NdeI和EcoRI位点之间插入质粒pET-28a(+)(Novagen)，使得N-端His-标签经过工程改造，从而促进镍亲和色谱法的蛋白纯化。随后将具有正确插入物的质粒构建体转化进大肠杆菌XL-1Blue(LifeTechnologies)中进行克隆。选择带有卡那霉素-耐药性基因的质粒pET-28a(+)以避免具有NDM-1或VIM-2的其它β-内酰胺酶的污染。将变体的所有质粒构建体转化进大肠杆菌XL-1Blue(Life Technologies)中进行克隆。通过DNA测序来证实构建体的DNA序列。

用于表达NDM-1(29-270)和VIM-2_(21-266)的PCR引物：

NDM-1_29-270_for:

GGGGGCATATGGGTGAAATCCGTCCGAC

NDM-1_29-270_rev:

GGGGGGAATTCTTAACGCAGTTTATCAGCCAT

VIM-2_21-266_for:

GGGGGCATATGAGCCCGCTGGCGTTTAGCGTG

VIM-2_21-266_rev:

GGGGGGAATTCCACCACGCTGCGGTTGGTATG

6.3.2野生型NDM-1和VIM-2的纯化

随后将野生型NDM-1或VIM-2表达载体转化进大肠杆菌BL21(DE3)中用于蛋白表达。挑选新鲜菌落并在37℃接种在1L补充了50μg mL^-1卡那霉素的Luria-Broth培养基中直到O.D.达到0.6。加入0.2mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷和0.2mM ZnSO₄以后，诱导细胞以在25℃过表达NDM-1持续16-18小时。为了纯化野生型NDM-1或VIM-2，将培养的细胞收获，并通过在裂解缓冲液[20mM HEPES/Na pH 7.0,0.5M NaCl和1mM苯基甲磺酰氟(PMSF)]中声处理进行裂解。然后将裂解物在20,000g离心30分钟，以除去大部分不溶性的细胞碎片。随后将上清液使用0.45μm过滤器(Sartorius)过滤并以2mL min^-1的速率加载到Ni²⁺-NTA亲和色谱柱(GE Healthcare)上。将柱使用5个柱体积的洗涤缓冲液[20mM HEPES,pH 7.0,500mMNaCl和30mM咪唑]洗涤，并使用4个柱体积的洗脱缓冲液[20mM HEPES,pH 7.0,500mM NaCl和300mM咪唑]洗脱蛋白。通过凝血酶消化将N-端His-标签使用切割缓冲液[20mM HEPES/NapH 7.0,150mM NaCl]在25℃切割3小时，并如下将融合His-标签与NDM-1分离：使用洗涤缓冲液再次穿过Ni²⁺-NTA柱，使得大部分NDM-1蛋白处于流通(flow-through)级分中。使用HiLoad 16/60Superdex 200pg凝胶过滤柱，将蛋白在纯化缓冲液[20mM HEPES,pH 7.0,150mM NaCl]中进一步纯化至>98％的纯度，其从SDS-PAGE凝胶判断。将蛋白使用AmiconUltra-15Centrifugal Filter Devices(Millipore)浓缩，并在贮存缓冲液[50mM HEPES/Na pH 7.0]中分离成等分试样用于在-20℃贮存。使用双金鸡宁酸蛋白测定试剂盒(Novagen)确定蛋白浓度，并估计纯化的NDM-1的收率为0.23mg/L的LB培养基。在系列纯化步骤以后，通过ICP-MS确定经纯化的NDM-1和VIM-2为含有大约2摩尔当量的Zn(II)(即Zn₂-NDM-1)。

6.3.3IC₅₀酶抑制测定

首先将新鲜制备的Zn₂-NDM-1(50nM)或Zn₂-VIM-2与不同浓度的Bi(III)化合物一起在25℃温育1h。使用Varian 紫外-可见光分光光度计的动力学模式在25℃在1cm石英比色皿中执行测定。最终的测定缓冲液含有50mM HEPES/Na pH 7.0、100mM NaCl和100μM MER。在10分钟的持续时间中每秒监测由MER的开环造成的在300nm的吸光度的下降，直到反应结束。从每条反应曲线引出和计算初始速率。确定CBS对NDM-1和VIM-2的半数最大抑制浓度(IC₅₀)分别为5.83±0.53μM和44.45±3.94μM。

6.3.4Zn(II)补充测定

为了研究酶抑制是否可以被逆转，在补充Zn(II)的情况下对比了apo-NDM-1和Bi-NDM-1的酶活性。通过将apo-NDM-1与CBS一起在25℃预温育2h来制备Bi-NDM-1(50nM)，并使用ICP-MS验证结合的Bi。将以上蛋白溶液与ZnSO₄(在相对于NDM-1直到2摩尔当量的浓度)和100μM MER混合。在1cm石英比色皿中使用Varian 紫外-可见光分光光度计在25℃监测在300nm的吸光度的变化进行反应速率计算。将在加入2摩尔当量的ZnSO₄的情况下apo-NDM-1的反应速率归一化为1。发现向Bi-NDM-1溶液补充Zn(II)后，酶活性仅仅可以恢复至25％。相反，在向apo-NDM-1补充Zn(II)后，酶活性可以显著地恢复(图7)。这无疑提示，Bi(III)不可逆地抑制NDM-1，且Zn(II)在Bi(III)结合后不可重新占据活性部位以恢复它的酶活性。为了证实这一点，如下所述通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)监测Zn(II)和Bi(III)的金属含量。

6.3.5使用ICP-质谱法(ICP-MS)监测Bi(III)的Zn(II)置换

为了监测Bi(III)对Zn(II)的替换，采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)准确地定量不同的经纯化的NDM-1样品中的²⁰⁹Bi和⁶⁶Zn含量。如以前所述制备经纯化的Zn₂-NDM-1，并使用Amicon Ultra-15Centrifugal Filter Devices(具有3kDa截止值)通过缓冲液洗涤循环溶解在不含痕量金属的ICP-MS缓冲液(其含有50mM HEPES,pH 7.0)中。将Zn₂-NDM-1(20μM)与不同浓度的CBS一起在轻轻摇动下在25℃温育5小时。随后将样品在ICP-MS缓冲液中透析以除去未结合的金属离子，并在温和加热下用10％(v/v)硝酸酸化1h以从蛋白释放结合的金属离子用于ICP分析。然后将样品与作为内部标准品的115In混合以达到在1％HNO₃中的10ppb的终浓度。在用来自Sigma的同位素标准品²⁰⁹Bi、⁶⁶Zn和³⁴S校准以后，随后将样品注射进基于四极的电感耦合等离子体质谱仪(Agilent 7500a,AgilentTechnologies,CA,USA)中。使用来自仪器的内置软件通过峰面积的积分同时确定²⁰⁹Bi、⁶⁶Zn和³⁴S同位素丰度，使得³⁴S丰度充当用于定量每个样品中的蛋白浓度的方式。发现2.13摩尔当量的Zn(II)被0.96当量的Bi(III)替换，如从样品的各个金属含量所确定的，从而提供了Bi(III)与蛋白的竞争性结合的直接证据。

6.3.6紫外-可见光光谱法

使用1-cm石英比色皿在25℃在Varian Cary 50分光光度计上收集紫外-可见光谱。制备在20mM HEPES缓冲液(含有50mM NaCl，在pH 7.4)中的新鲜制备的apo-NDM-1样品(50μM)，并将铋溶液的等分试样逐渐滴定进样品中。通过在大约340nm测量吸收的增加(由于涉及半胱氨酸残基的配体至金属电荷转移(LMCT))，监测Bi(III)与apo-NDM-1的结合。由于Cys208是蛋白中的唯一半胱氨酸残基，涉及半胱氨酸残基的LMCT会提供Bi(III)与Cys208结合并随后导致Zn(II)从NDM-1解离的坚实证据。为了进一步证实我们的假设，如下面实施例4中所述进行X-射线结晶研究。

6.4实施例4:与NDM-1结合的铋的结晶研究

6.4.1结晶、衍射数据收集和结构确定

通过悬滴蒸汽扩散方法得到天然NDM-1的晶体。简而言之，将NDM-1蛋白(浓缩至100mg mL-1)以等体积比与含有0.1M Bis-Tris(在pH 5.5)、PEG 3350 15％(w/v)和20mML-脯氨酸的沉淀剂混合。在该条件下，可以容易地得到在一个不对称单元中具有8个分子的在P1空间群中的晶体，并将它们衍射至的分辨率。拖出P1晶体以后，使P21的空间群中的新晶体随机生长，且它们通常具有至的分辨率的更大衍射限度。将P21晶体用作种子用于NDM-1的以后结晶。菱形样或矩形晶体在接种后1天内出现，并在3天至1周中生长至全尺寸。

为了得到铋结合的晶体，提取天然晶体中的锌离子，并将铋化合物浸泡在这些晶体中。简而言之，将天然晶体在25℃与25％戊二醛交联30min，并然后浸泡在螯合溶液(0.1M醋酸钠pH 4.6,25％PEG 3350,20％甘油,10mM EDTA)中过夜。将晶体在冷冻-保护剂溶液(0.1M Bis-Tris pH 5.5,25％PEG 3350,20％甘油)中洗涤3次。在含有0.1M Bis-Tris(pH5.5)、25％PEG 3350、20％甘油、5mM TCEP和1mM Bi(III)葡萄糖酸盐的浸泡溶液中完成浸泡17小时。然后将晶体用冷冻-保护剂溶液洗涤4次并在液氮中快速冷冻。

在上海光源在BL17U上收集衍射数据。在0.92和的波长收集了2个数据集，它们与元素铋的吸收边缘相交。为每种晶体执行激发扫描以证实锌离子被完全提取出且仅铋留在晶体中。用HKL2000处理衍射数据。使用来自CCP4套件的程序Phaser执行分子替换，且将氨苄西林结合的NDM-1(PDB代码:3Q6X)用作检索模型。将模型用Refmac精化，并在Coot中用手工重建进行循环。将异常数据用在精化中，并在2个数据集(在0.92和的波长收集)之间对比异常信号强度。

在收集的数据的异常峰是在收集的数据的异常峰的至少2倍。与激发扫描一起，我们证实了异常信号由铋促成。将铋的占据在早期精化时根据异常信号的强度精化，并在晚期阶段通过B-因子评估。将TLS精化掺入以后的精化过程中。在Coot中自动地加入溶剂，并然后手工地检查和修改。用MolProbity分析最终的模型。数据收集和模型精化统计总结在表4中。

表4

6.5实施例5：体外抗微生物活性评估

针对产生MBL的细菌菌株检查了铋化合物的抗-耐药性活性。所述方法涉及基于细胞的最小抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定、时间杀死测定和体外细胞感染测定。

6.5.1细菌

采用的细菌涉及大肠杆菌ATCC 25922、大肠杆菌临床分离物(NDM-1⁺)、大肠杆菌(NDM-1^-)、肺炎克雷伯氏菌临床分离物(NDM-1⁺)、弗氏柠檬酸杆菌临床分离物(NDM-1⁺)、大肠杆菌临床分离物(IMP-4⁺)、大肠杆菌BL21(VIM-2⁺)和Rosetta(NDM-1⁺)。肺炎克雷伯氏菌临床分离物(NDM-1⁺)和弗氏柠檬酸杆菌临床分离物(NDM-1⁺)由Woo,Patrick Chiu Yat教授(LKS Faculty of Medicine,HKU)友情提供。大肠杆菌临床分离物(IMP-4⁺)由Ho,PakLeung教授(LKS Faculty of Medicine,HKU)友情提供。通过大肠杆菌临床分离物(NDM-1⁺)在不含抗生素的培养基中的第20代连续传代，筛选大肠杆菌(NDM-1^-)。通过PCR检查来证实NDM-1基因的缺失。

6.5.2微量稀释MIC和MBC测定

使用MIC和MBC测定对MER和Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐的组合定量地评价抗微生物活性。使用分级抑制浓度指数(FICI)反映它们之间的协同作用。

首先通过标准的液体培养基(broth)微稀释方法(Clinical and LaboratoryStandards Institute(CLSI)M100-S20,2010)确定抗生素或Bi(III)化合物的MIC值。简而言之，将细菌细胞在LB液体培养基中在37℃在250rpm培养过夜，并使用微孔滴定板读数器在600nm(OD₆₀₀)测量光密度。将细菌密度调至约1×10⁶CFU mL^-1，并通过此后在琼脂平板上的CFU计数进行检查。将经试验的化合物一式三份加入平底96-孔平板的各个孔中，并执行2倍系列稀释，随后加入制备的细菌接种物。然后将平板在37℃温育过夜。不含抗生素或铋化合物的泳道用作阳性对照，且没有加入细菌的泳道用作阴性对照。通过肉眼读出和OD₆₀₀测量将MIC确定为可以抑制微生物生长的化合物的最低浓度。在MIC测定结束时，将试验的每种分离物的每个孔(含有指定的抗微生物剂浓度)的50μL等分试样应用于LB琼脂平板并在37℃在环境空气中温育过夜。在过夜培养以后检查得到的生长(或生长的缺乏)，并将抑制99.9％的原始培养物的最低浓度取作MBC。

对于药物组合的试验，在直到单独试验的化合物的MIC的8倍的浓度共施用抗生素和Bi(III)化合物。其它操作和MIC的检查保持严格相同。基于下述方程式确定FICI：

FICI＝FICA+FICB＝C_A/MIC_A+C_B/MIC_B

其中MICA和MICB是化合物A和B当单独起作用时的MIC值，且C_A和C_B是在有效组合时化合物A和B的浓度。将协同作用定义为FICI≤0.5，将无差别定义为FICI>0.5且<4，并将拮抗作用定义为FICI≥4。在不同天至少一式三份地执行所有确定。

使用上述方法，针对它们与MER组合地杀死或抑制产生MBL的细菌的生长的能力评价了示例性的Bi(III)化合物。图10(a)显示了针对产生NDM-1的大肠杆菌的MER和CBS的组合的西洋跳棋盘MIC的热图。当单独使用时，MER具有相对高的MIC值，经常大于16μg mL^-1，其远超过肠杆菌科的经验敏感水平(2μg mL^-1)。随着CBS的浓度升高，MER的MIC逐渐下降至2μgmL^-1，且FIC指数被计算为0.250，指示它们之间的协同效应。相反，当使用不含NDM-1的大肠杆菌菌株时没有观察到抑制(图10(b))。针对其它产生NDM-1的细菌菌株和其它产生MBL的细菌菌株也发现了在MER和其它示例性的Bi(III)化合物之间的这样的协同作用，如在表5、6和7中总结的。在与试验的Bi(III)化合物组合后，针对产生MBL的细菌，MER的MIC实质性下降，通常下降了4～32倍。代表性结果初步指示MER和试验的Bi(III)化合物之间的协同作用，其可能来自试验的细菌病原体所产生的MBL的抑制，这与在实施例3中以前描述的酶研究相一致。

表5

表6

表7

表8

CBS与其它β-内酰胺抗生素的抗细菌活性显示在图11中。尽管试验组合都没有完全抑制细菌的生长，但是在有铋复合物存在下AMOX、氨苄西林(AMP)、萘夫西林(NAF)和头孢地尼(CEF)都使Rosetta(DE3)(NDM-1⁺)细菌细胞的生长速率明显下降。AMOX、NAF和CEF在加入化合物(CPD)21后变得有效，细菌细胞的生长速率分别下降了77.9％、60.5％和61.1％，而CEF当与CBS组合使用时变得非常有效并使生长速率下降了76％。该研究证实了铋化合物与其它抗生素的组合对产生NDM-1的细菌的体外效力。

6.5.3时间杀死测定

使用时间杀死测定进一步探究MER和Bi(III)化合物(其在本文中用CBS代表)之间的协同作用。在典型测定中，在该试验中使用的化合物的浓度如下表示：16μg mL^-1MER，32μgmL-1CBS。将细菌培养过夜并以1:250稀释在LB液体培养基中在37℃保持3小时以达到对数期。根据标准曲线将最初的细菌浓度调至～10⁷CFU mL^-1。将单独的或组合的试验化合物加入在50ml试管内的20mL新鲜制备的细菌溶液中，并在37℃温育。将不含化合物的LB液体培养基用作阳性对照。在不同的时间间隔(0、1、2、4、6、8和24小时)以后抽取100mL悬浮液的等分试样。通过在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中系列稀释和铺板在LB琼脂上，从菌落计数估计细菌浓度。所有测定是三份并在不同天执行3次。对于24小时内的每个时间点，将来自3个独立实验的数据取平均值并绘制为log₁₀CFU mL^-1相对于时间(h)，如在图12中所示。

与单一组分相比，在测定端点处，当暴露于CBS和MER的化合物组合时，细菌密度显著下降了超过1000倍。根据NCCLS，这指示CBS和MER之间的明显协同作用，并还观察到所述化合物组合的杀菌作用。

6.5.4耐药性研究

鉴于MIC的特有概念，所有敏感的细菌细胞将被超过它的剂量抑制或杀死。但是，细菌群体经常是大的；感染可能含有具有降低的易感性的第一步突变体。因而，在MIC的化合物剂量会不利地扩大那些不太敏感的突变体的总数²⁶。因而与突变体预防指数(MPI＝MPC/MIC)一起引入突变体预防浓度(MPC，定义为抑制大量敏感细菌群体中的第一步耐药性突变体的生长的化合物浓度)以估计示例性化合物组合的突变体预防能力。

对于典型试验，将1～2×10¹⁰CFU的大肠杆菌细胞(NDM⁺)在含有相同浓度的MER和CBS的组合的LB琼脂上铺展。将所有平板在37℃温育。温育48小时后，挑选至多4个菌落并从具有可观察的菌落的任何平板重新培养，随后测量它们的MIC值。将高于原始值(16μg mL^-1)的MER的任何MIC确定为突变体菌落。将限制突变体菌落的生长的浓度确定为MPC。

热图显示了突变频率的程度(图13)，即使当应用高剂量(8×MIC)的MER时，突变体菌落仍然是可观察的。相反，随着CBS剂量的增加，突变频率显著下降，如在表7中所示。MER的MPI降低至1，且当使用≥128μg mL^-1CBS时，没有突变体菌落是可观察的。这可能由使用铋化合物的多种靶机制促成，其被认为是金属试剂(metalloagent)的典型特征。该独特特征可能在提供Bi化合物的效力以应付耐药性问题中起关键作用。

6.5.5体外细胞感染测定

为了进一步评价与MER组合的CBS的抗微生物效力，我们在哺乳动物细胞中探究了体外细菌感染模型。通常，在补充了胎牛血清(FBS,10％)的最低基础培养基(MEM)中培养MDCK细胞，并在5％CO₂潮湿气氛下在37℃培养3天。然后将MDCK细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液洗涤3次，用胰蛋白酶-EDTA(0.25％)释放并用培养基重新悬浮。将约500μL重新悬浮的细胞接种在24-孔平板中并如上所述温育48小时以确保汇合，产生约1.0×10⁵个细胞/孔(通过台盼蓝测定)。将新鲜生长的对数大肠杆菌(NDM-1⁺)细菌细胞用PBS洗涤3次并重新悬浮在MEM/10％FBS中。将密度调至2×10⁷CFU mL^-1。然后将500μL细菌悬浮液加入每个孔并置换以前的MDCK培养基。将平板在800×g离心10min，并然后在37℃在5％CO₂中温育6小时，以200的感染复数(MOI)执行细菌侵入。感染以后，将细胞用PBS洗涤3次以除去未结合的细菌并补给培养基。

对于那些细胞侵入细菌实验，将受感染的细胞在补充了100μg mL^-1环丙沙星的培养基中温育1h以除去细胞外细菌。然后将经处理的细胞用PBS剧烈洗涤6次并补充培养基。为了测量最初的细菌密度，将细胞在PBS中洗涤3次并用1％Triton X-100在PBS中的溶液完全裂解。将细胞裂解物系列稀释并铺板在LB琼脂上，并通过琼脂铺板计数菌落。对于细胞相关的(附着的、内化的和跨细胞的(transcytosed))感染，在没有环丙沙星处理存在下将所述细胞用PBS剧烈洗涤6次。将本文中的细胞侵入细菌定义为穿透MDCK细胞的那些细菌，并将细胞相关的细菌定义为在MDCK细胞中穿透、附着或跨细胞的细菌。在细菌侵入以后，将适当浓度的试验化合物加入24-孔平板的每个孔中。在没有化合物存在下的细胞充当对照。将平板在37℃温育过夜。如以前所述计数存活的细菌。一式三份地执行测定，重复3次并将结果表达为平均值±SD。

图14显示了用抗微生物剂处理以后存活细菌的CFU减小。即使当使用2×MIC的MER时，细菌负荷(bacterial loads)是在10⁶CFU水平，但是，在细胞相关的模型中在有CBS存在下其急剧下降至不大于10⁴CFU水平。对于细胞侵入模型，MER(2×MIC)和CBS的化合物组合仍然能够使细胞内细菌密度比仅MER下降9.22倍。以上研究证实了CBS和MER的化合物组合对产生NDM-1的细菌的体外效力。

6.6实施例6:体内抗微生物活性评估

6.6.1鼠腹膜炎感染

基于酶和细胞的研究(其中CBS用于抑制MBL的功能和增强β-内酰胺抗生素对产生MBL的细菌的活性)证实了以下潜力：当前的化合物组合在体内会发挥与单独的β-内酰胺抗生素相比增强的抗微生物效力。为了证实这点，建立了小鼠腹膜炎模型，并然后用于检查体内化合物效力。

简而言之，在50mL LB液体培养基中以1:250稀释度执行大肠杆菌(NDM-1⁺)的过夜培养，并在37℃、250rpm摇动2.5小时以后在250-mL烧瓶中重新培养至约0.3的OD。将得到的细菌沉淀物收集，并用PBS洗涤3次用于进一步使用。对于细菌感染，在400μL补充了2％粘蛋白的PBS等分试样中以10⁵个CFU细菌的剂量腹膜内地(i.p.)诱导小鼠(雌性BALB/c品种，6～8周龄，18～22g重量)。在感染后4小时给4组小鼠分别腹膜内地施用100μL的PBS、MER、CBS以及MER和CBS的组合的等分试样。对于端点监测体重和小鼠存活直到感染后第4天。

代表性结果显示在图15中。在感染后4小时小鼠变得严重患病，它们都没有存活至感染后20小时以后。在与CBS共同施用后，MER能够延迟小鼠的死亡并使存活率在实验端点时增加至50％，与此相比，单独的MER仅增加25％。

本发明的范围不受本文描述的具体实施方案限制。实际上，除了描述的那些以外，本领域技术人员从前述描述和附图会明白本发明的多种改变。这样的改变意图落入所附权利要求的范围内。

在本文中引用的所有参考文献通过引用整体并入本文和用于所有目的，达到如同明确地且单独地指出每篇单独的出版物或专利或专利申请通过引用整体并入用于所有目的的相同程度。

参考文献：

(1)Wright,G.D.；Sutherland,A.D.Trends Molecular Medicine 2007,13,260.

(2)Fisher,J.F.；Meroueh,S.O.；Mobashery,S.Chemical Reviews 2005,105,395.

(3)Medeiros,A.A.Clinical Infectious Diseases 1997,24,S19.

(4)Walsh,T.R.；Toleman,M.A.；Poirel,L.；Nordmann,P.Clinical MicrobiologyReviews 2005,18,306.

(5)Feng,H.；Ding,J.；Zhu,D.；Liu,X.；Xu,X.；Zhang,Y.；Zang,S.；Wang,D.-C.；Liu,W.Journal of the American Chemical Society 2014,136,14694.

(6)Tripathi,R.；Nair,N.N.ACS Catalysis 2015,5,2577.

(7)Cornaglia,G.；Giamarellou,H.；Rossolini,G.M.The Lancet InfectiousDiseases 2011,11,381.

(8)Munoz-Price,L.S.；Poirel,L.；Bonomo,R.A.；Schwaber,M.J.；Daikos,G.L.；Cormican,M.；Cornaglia,G.；Garau,J.；Gniadkowski,M.；Hayden,M.K.；Kumarasamy,K.；Livermore,D.M.；Maya,J.J.；Nordmann,P.；Patel,J.B.；Paterson,D.L.；Pitout,J.；Villegas,M.V.；Wang,H.；Woodford,N.；Quinn,J.P.The Lancet Infectious Diseases2013,13,785.

(9)Lippmann,N.；Lübbert,C.；Kaiser,T.；Kaisers,U.X.；Rodloff,A.C.TheLancet Infectious Diseases 2014,14,271.

(10)Nordmann,P.；Cuzon,G.；Naas,T.The Lancet Infectious Diseases 2009,9,228.

(11)Poirel,L.；Nordmann,P.Clinical Microbiology and Infection 2006,12,826.

(12)Queenan,A.M.；Bush,K.Clinical Microbiology Reviews2007,20,440.

(13)Woodford,N.；Turton,J.F.；Livermore,D.M.FEMS Microbiology Reviews2011,35,736.

(14)Kumarasamy,K.K.；Toleman,M.A.；Walsh,T.R.；Bagaria,J.；Butt,F.；Balakrishnan,R.；Chaudhary,U.；Doumith,M.；Giske,C.G.；Irfan,S.；Krishnan,P.；Kumar,A.V.；Maharjan,S.；Mushtaq,S.；Noorie,T.；Paterson,D.L.；Pearson,A.；Perry,C.；Pike,R.；Rao,B.；Ray,U.；Sarma,J.B.；Sharma,M.；Sheridan,E.；Thirunarayan,M.A.；Turton,J.；Upadhyay,S.；Warner,M.；Welfare,W.；Livermore,D.M.；Woodford,N.TheLancet Infectious Diseases 2010,10,597.

(15)Nordmann,P.；Naas,T.；Poirel,L.Emerging Infectious Diseases 2011,17,1791.

(16)Borgia,S.；Lastovetska,O.；Richardson,D.；Eshaghi,A.；Xiong,J.；Chung,C.；Baqi,M.；McGeer,A.；Ricci,G.；Sawicki,R.；Pantelidis,R.；Low,D.E.；Patel,S.N.；Melano,R.G.Clinical Infectious Diseases 2012,55,e109.

(17)Cantón,R.；Akóva,M.；Carmeli,Y.；Giske,C.G.；Glupczynski,Y.；Gniadkowski,M.；Livermore,D.M.；Miriagou,V.；Naas,T.；Rossolini,G.M.；Samuelsen,Seifert,H.；Woodford,N.；Nordmann,P.；the European Network on,C.ClinicalMicrobiology and Infection 2012,18,413.

(18)Shahcheraghi,F.；Nobari,S.；Rahmati Ghezelgeh,F.；Nasiri,S.；Owlia,P.；Nikbin,V.S.；Imani Fooladi,A.A.Microbial Drug Resistance 2012,19,30.

(19)Ho,H.J.；Toh,C.Y.；Ang,B.；Krishnan,P.；Lin,R.T.P.；La,M.-V.；Chow,A.American Journal of Infection Control 2016,44,177.

(20)Saliba,V.；Washer,P.；Pett,P.；Kakkar,M.；Abbas,S.；Raghuvanshi,B.；McKee,M.J Public Health Pol 2016,37,1.

(21)Yong,D.；Toleman,M.A.；Giske,C.G.；Cho,H.S.；Sundman,K.；Lee,K.；Walsh,T.R.Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2009,53,5046.

(22)Chen,Y.；Zhou,Z.；Jiang,Y.；Yu,Y.Journal of AntimicrobialChemotherapy 2011,66,1255.

(23)Ho,P.L.；Lo,W.U.；Yeung,M.K.；Lin,C.H.；Chow,K.H.；Ang,I.；Tong,A.H.Y.；Bao,J.Y.-J.；Lok,S.；Lo,J.Y.C.PLoS ONE2011,6,e17989.

(24)Gupta,N.；Limbago,B.M.；Patel,J.B.；Kallen,A.J.Clinical InfectiousDiseases 2011,53,60.

(25)Reading,C.；Cole,M.Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1977,11,852.

(26)Ehmann,D.E.；H.；Ross,P.L.；Gu,R.-F.；Hu,J.；Kern,G.；Walkup,G.K.；Fisher,S.L.Proceedings of the National Academy of Sciences 2012,109,11663.

(27)Gardiner,B.J.；Golan,Y.Expert Rev Anti Infect Ther 2016.

(28)King,A.M.；Reid-Yu,S.A.；Wang,W.；King,D.T.；De Pascale,G.；Strynadka,N.C.；Walsh,T.R.；Coombes,B.K.；Wright,G.D.Nature 2014,510,503.

(29)Brem,J.；van Berkel,S.S.；Aik,W.；Rydzik,A.M.；Avison,M.B.；Pettinati,I.；Umland,K.-D.；Kawamura,A.；Spencer,J.；Claridge,T.D.W.；McDonough,M.A.；Schofield,C.J.Nat Chem2014,6,1084.

(30)Klingler,F.-M.；Wichelhaus,T.A.；Frank,D.；Cuesta-Bernal,J.；El-Delik,J.；Müller,H.F.；Sjuts,H.；S.；Koenigs,A.；Pos,K.M.；Pogoryelov,D.；Proschak,E.Journal of Medicinal Chemistry 2015,58,3626.

Claims (32)

1.一种治疗受试者中由产生MBL的细菌引起的细菌感染的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的组合物，其中所述组合物包含:(a)β-内酰胺抗生素；和(b)金属-β-内酰胺酶(MBL)抑制剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述β-内酰胺抗生素是碳青霉烯。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述碳青霉烯是美罗培南、亚胺培南、厄他培南、多立培南、比阿培南、法罗培南、帕尼培南、雷珠培南、替比培南、托莫培南或它们的组合。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述金属-β-内酰胺酶抑制剂是Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述Bi(III)化合物是来自复合物1至复合物21的复合物或它们的组合。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐是具有与含有N、O、S的配体配位的Bi(III)的稳定Bi(III)复合物，所述配体是氨基酸、肽、蛋白、无机盐或它们的组合。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐是Bi(III)盐或Bi(III)复合物，且其中所述Bi(III)复合物是单体、二聚体或聚合物。

8.根据权利要求4所述的方法，其中所述Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐具有约3至约10的pH值。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述MBL是新德里金属-β-内酰胺酶(NDM)、蜡状芽孢杆菌金属-β-内酰胺酶(BCII)、脆弱拟杆菌金属-β-内酰胺酶(CcrA)、亚胺培南酶(IMP)、维罗纳亚胺培南酶(VIM)、荷兰亚胺培南酶(DIM)、德国亚胺培南酶(GIM)、澳大利亚亚胺培南酶(AIM)、圣保罗金属-β-内酰胺酶(SPM)或它们的组合。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述产生MBL的细菌病原体是埃希氏菌属种(Escherichia spp.)，大肠杆菌(E.coli)、阿尔伯蒂埃希氏杆菌(E.albertii)、蟑螂埃希氏菌(E.blattae)、弗洛森埃希氏菌(E.fergusonii)、赫氏埃希氏菌(E.hermannii)、塞内加尔埃希氏菌(E.senegalensis)、塞内加尔埃希氏菌(E.senegalensis)、伤口埃希氏菌(E.vulneris)，克雷伯氏菌属种(Klebsiella spp.)，肺炎克雷伯氏菌(K.pneumonia)、产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)、肉芽肿克雷伯氏菌(K.granulomatis)、K.milletis、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、植生克雷伯氏菌(K.cf.planticola)B43、塞内加尔克雷伯氏菌(K.senegalensis)、新加坡克雷伯氏菌(K.singaporensis)、变栖克雷伯氏菌(K.variicola)，柠檬酸杆菌属种(Citrobacter spp.)，弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、无丙二酸柠檬酸杆菌(C.amalonaticus)和差别柠檬酸杆菌(C.koseri)，不动杆菌属种(Acinetobacter spp.)，鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、Acinetobacterbaylyi、Acinetobacter bouvetii、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)，假单胞菌属种(Pseudomonas spp.)，铜绿假单孢菌(P.aeruginosa)、产碱假单胞菌(P.alcaligenes)、病鳝假单胞菌(P.anguilliseptica)、香茅醇假单胞菌(P.citronellolis)、变绿假单胞菌(P.flavescens)、晋州假单胞菌(P.jinjuensis)、门多萨假单胞菌(P.mendocina)、硝基还原假单胞菌(P.nitroreducens)、食油假单胞菌(P.oleovorans)、类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)、食树脂假单胞菌(P.resinovorans)、稻草假单胞菌(P.straminae)或它们的组合。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述β-内酰胺抗生素和MBL抑制剂具有按重量(w/w)计在1:16至16:1范围内的摩尔比。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述β-内酰胺抗生素和MBL抑制剂存在于混合物中或单独组分中。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述MBL抑制剂通过MBL的金属替代来抑制MBL。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述金属是Zn(II)。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述金属替代是通过一个Bi(III)离子对两个金属辅因子的置换。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者被已经产生碳青霉烯耐药性的细菌感染。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述细菌已经产生对美罗培南、亚胺培南、厄他培南、多立培南、比阿培南、法罗培南、帕尼培南、雷珠培南、替比培南、托莫培南或它们的组合的耐药性。

18.组合物，其包含:(a)β-内酰胺抗生素；和(b)金属-β-内酰胺酶(MBL)抑制剂，其中所述MBL抑制剂是Bi(III)化合物。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述β-内酰胺抗生素是碳青霉烯。

20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述碳青霉烯是美罗培南、亚胺培南、厄他培南、多立培南、比阿培南、法罗培南、帕尼培南、雷珠培南、替比培南、托莫培南或它们的组合。

21.根据权利要求18所述的组合物，其中所述金属-β-内酰胺酶是Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述Bi(III)化合物是来自复合物1至复合物21的复合物或它们的组合。

23.根据权利要求21所述的组合物，其中所述Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐是具有与含有N、O、S的配体配位的Bi(III)的稳定Bi(III)复合物，所述配体是氨基酸、肽、蛋白、Bi(III)无机盐或它们的组合。

24.根据权利要求21所述的组合物，其中所述Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐是Bi(III)盐或Bi(III)复合物，且其中所述Bi(III)复合物是单体、二聚体或聚合物。

25.根据权利要求18所述的组合物，其中所述Bi(III)化合物或其药学上可接受的盐具有约3-10的pH值。

26.根据权利要求18所述的组合物，其中所述MBL是新德里金属-β-内酰胺酶(NDM)、蜡状芽孢杆菌金属-β-内酰胺酶(BCII)、脆弱拟杆菌金属-β-内酰胺酶(CcrA)、亚胺培南酶(IMP)、维罗纳亚胺培南酶(VIM)、荷兰亚胺培南酶(DIM)、德国亚胺培南酶(GIM)、澳大利亚亚胺培南酶(AIM)、圣保罗金属-β-内酰胺酶(SPM)或它们的组合。

27.根据权利要求18所述的组合物，其中所述产生MBL的细菌病原体是埃希氏菌属种(Escherichia spp.)，大肠杆菌(E.coli)、阿尔伯蒂埃希氏杆菌(E.albertii)、蟑螂埃希氏菌(E.blattae)、弗洛森埃希氏菌(E.fergusonii)、赫氏埃希氏菌(E.hermannii)、塞内加尔埃希氏菌(E.senegalensis)、塞内加尔埃希氏菌(E.senegalensis)、伤口埃希氏菌(E.vulneris)，克雷伯氏菌属种(Klebsiella spp.)，肺炎克雷伯氏菌(K.pneumonia)、产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)、肉芽肿克雷伯氏菌(K.granulomatis)、K.milletis、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、植生克雷伯氏菌(K.cf.planticola)B43、塞内加尔克雷伯氏菌(K.senegalensis)、新加坡克雷伯氏菌(K.singaporensis)、变栖克雷伯氏菌(K.variicola)，柠檬酸杆菌属种(Citrobacter spp.)，弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、无丙二酸柠檬酸杆菌(C.amalonaticus)和差别柠檬酸杆菌(C.koseri)，不动杆菌属种(Acinetobacter spp.)，鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、Acinetobacterbaylyi、Acinetobacter bouvetii、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)，假单胞菌属种(Pseudomonas spp.)，铜绿假单孢菌(P.aeruginosa)、产碱假单胞菌(P.alcaligenes)、病鳝假单胞菌(P.anguilliseptica)、香茅醇假单胞菌(P.citronellolis)、变绿假单胞菌(P.flavescens)、晋州假单胞菌(P.jinjuensis)、门多萨假单胞菌(P.mendocina)、硝基还原假单胞菌(P.nitroreducens)、食油假单胞菌(P.oleovorans)、类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)、食树脂假单胞菌(P.resinovorans)、稻草假单胞菌(P.straminae)或它们的组合。

28.根据权利要求18所述的组合物，其中所述β-内酰胺抗生素和MBL抑制剂具有按重量(w/w)计在1:16至16:1范围内的摩尔比。

29.根据权利要求18所述的组合物，其中所述β-内酰胺抗生素和MBL抑制剂存在于混合物中或单独组分中。

30.根据权利要求18所述的组合物，其中所述MBL抑制剂通过MBL的金属替代来抑制MBL。

31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述金属是Zn(II)。

32.根据权利要求30所述的组合物，其中所述金属替代是通过一个Bi(III)离子对两个金属辅因子的置换。