CN105238814A - 钌配合物作为靶向细胞核核酸载体的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了钌配合物作为靶向细胞核核酸载体的应用，实验数据表明，钌(II)配合物可以与核酸序列有效地结合在一起，并有效改变长序列核酸的形态，使得其可以有效地跨膜运输至活细胞内，并很好地定位于细胞核中，大大提高了核酸的运载效率。利用这一特性，可以方便地转运核酸序列至细胞内，进行基因治疗，或进行荧光示踪等。本发明钌配合物-核酸复合物的制备方法，能够高效率地制备得到稳定的钌配合物-核酸复合物，获得更好的效果。
Description
技术领域
本发明涉及钌配合物的新应用，特别涉及钌配合物作为核酸载体的新应用。
背景技术
基因治疗(genetherapy)技术对肿瘤等疾病的治疗日益受到研究者的重视和关注。所谓基因治疗是指把某些功能性遗传物质，包括siRNA，mRNA、miRNA、DNA、核酸适配体以及癌症基因的启动区序列转染(transfection)到细胞中，使其在细胞中表达，最终达到治疗疾病的目的。基因治疗的关键是安全、高效的载体(vector)将治疗基因转染到细胞中。通常可以采用病毒(viral)载体如RNA病毒或DNA病毒，或者非病毒(non-viral)载体包括磷酸钙沉淀法、脂质体转染法、显微注射法等转染治疗基因(H.Yin,R.L.Kanasty,A.A.Eltoukhy,A.J.Vegas,J.R.Dorkin,D.G.Anderson,Non-viralvectorsforgene-basedtherapy,NatureRev.,15,541-555,2014;ViktoriyaSokolovaandMatthiasEpple,InorganicNanoparticlesasCarriersofNucleicAcidsintoCells,Angew.Chem.Int.Ed.2008,47,1382–1395;S.Huo,S.Jin,X.Ma,X.Xue,K.Yang,A.Kumar,P.C.Wang,J.Zhang,Z.Hu,X.-J.Liang,Ultrasmallgoldnanoparticlesascarriersfornucleus-basedgenetherapyduetosize-dependentnuclearentry,ACSNANO,8(6),5852-5862,2014)。但是这些方法由于各自的缺陷和不足，在临床上的应用仍然受到较大限制。
近年来，应用钌(II)配合物作为基因载体的研究引起研究者的广泛兴趣。Kumbhar等报道了一种应用钌多吡啶配合物作为基因载体的应用(S.S.Bhat,A.S.Kumbhar,A.K.Kumbhar,A.Khan,P.Lonnecke,Rutheium(II)polypyridylcomplexesascarriersforDNAdelivery,Chem.Comm.,2011,47,11068-1070)；巢辉等人报道了多吡啶钌(II)配合物作为基因载体的方法(B.Yu,Y.Chen,C.Ouyang,H.Huang,L.JiandH.Chao;Aluminescenttetranuclearruthenium(II)complexasatrackingnon-viralgenevector,Chem.Commun.,2013,49,810-812).但是这些报道中所使用的钌配合物分子分子量相对较大，合成工艺相对复杂，其作为基因载体的效果十分有限，且上述报道钌配合物及其光学异构体均未报道作为靶向细胞核的基因载体的应用。由于基因的复制转录的主要场所为细胞核，因此将核酸靶向性的转运到细胞核可以提高基因的自我复制和转录应用效率，获得更好的疗效。
发明内容
本发明的目的在于提供钌配合物作为核酸载体的应用。
实验数据表明，具有下述通式的钌(II)配合物，可以与核酸序列有效地结合在一起，并有效改变长序列（如50bp以上）核酸的形态，使得其可以有效地跨膜运输至活细胞内，并很好地定位于细胞核中，大大提高了核酸的运载效率。利用这一特性，可以方便地转运核酸序列至细胞内，进行基因治疗，或进行荧光示踪等。
钌(II)配合物具有如下结构通式：
、、或，
式中，
L为辅助配体，其结构式为、、或；
R独立选自取代烷基、取代苯基、取代吡啶基、取代呋喃基、取代噻唑和取代吡咯的取代基任选自羟基、硝基、卤素、氨基、羧基、氰基、巯基、碳原子数为3～8的环烷基、SO3H、碳原子数为1～6的烷基、碳原子数为2～6的链烯基、碳原子为2～6的链炔基、羟基(C1-C6)烷基、氨基(C1-C6)烷基、CO2R’、CONR’R’、COR’、SO2R’R’、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷硫基、-N=NR’、NR’R’或三氟(C1-C6)烷基；其中，所述R’选自H、碳原子数为1～6的烷基或苯基；
R1独立选自氢，羟基，三甲基硅基，碳原子数为1～6的烷基或碳原子为1～6的取代烷基，苯基或取代苯基，吡啶基或取代吡啶基，呋喃基或取代呋喃基，吡咯基或取代吡咯基，噻唑或取代噻唑基；式中R1取代的乙炔基位置可以位于苯环的邻位、间位或者对位；取代乙炔基的数量为1个，2个或者是多个；R2独立的选自甲基、甲氧基、硝基、卤素；Y为使钌(II)配合物整体呈电中性的离子或者酸根离子，n为使钌(II)配合物整体呈电中性的离子或者酸根离子的数目；
核酸序列的长度至少为4bp。特别的，核酸的长度不超过3000bp。
作为上述应用的进一步改进，钌配合物为其单一手性异构体。
作为上述应用的进一步改进，核酸的长度不超过3000bp。核酸选自cmyc启动区DNA,C-kit启动区DNA,bcl-2启动区DNA,miR-21，AS1411的DNA、SiRNA、microRNA、核酸适配体以及mRNA。
作为上述应用的进一步改进，核酸上标记有荧光基团。
钌配合物-核酸复合物作为荧光探针的应用，其中钌配合物如上所述。
钌配合物-核酸复合物的制备方法，包括如下步骤：将钌配合物与核酸溶液混合均匀，加热至70～100℃并维持30S～30min；冷却后去除游离的钌配合物，得到钌配合物-核酸复合物；其中，钌配合物的结构式如权利要求1～3任意一项所述，核酸的长度不低于4bp。
作为上述方法的进一步改进，使用微波进行加热。
作为上述方法的进一步改进，核酸上标记有荧光基团。
本发明的有益效果是：
本发明钌配合物-核酸复合物的制备方法，能够高效率地制备得到稳定的钌配合物-核酸复合物，获得更好的效果。
附图说明
图1～41分别是实施例1～41所使用的钌配合物的结构式（如有）及其与DNA复合得到的复合物的TEM图；
图42荧光显微镜下观察钌配合物-核酸（FAM荧光标记）复合物(Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2:FAM-c-mycpu22DNA=1:1)在肝癌HepG2细胞中的分布与定位；
图43荧光显微镜下观察钌配合物-核酸（FAM荧光标记）复合物(Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2:FAM-c-mycpu22DNA=1:1)在宫颈癌Hela细胞中的分布与定位；
图44荧光显微镜下观察钌配合物-核酸（FAM荧光标记）复合物(Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2:FAM-c-mycpu22DNA=1:1)在乳腺癌MCF-7细胞中的分布与定位；
图45激光共聚焦显微镜下观察钌配合物-核酸（FAM荧光标记）复合物(Λ-Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2:FAM-c-mycpu22DNA=1:1)在肝癌HepG2细胞中的分布与定位；
图46激光共聚焦显微镜下观察钌配合物-核酸（FAM荧光标记）复合物(Λ-Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2:FAM-c-mycpu22DNA=1:1)在肝癌MCF-7细胞中的分布与定位；
图47荧光显微镜下观察钌配合物-核酸（FAM荧光标记）复合物(Δ-Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2:FAM-c-mycpu22DNA=1:1)在肝癌HepG2细胞中的分布与定位；
图48荧光显微镜下观察钌配合物-核酸（FAM荧光标记）复合物(Λ-Ru(bpy)2pEPIP](ClO4)2:FAM-AS1411DNA=1:1)在肝癌HepG2细胞中的分布与定位。
具体实施方式
本发明所使用的钌配合物，可参照本发明人之前的专利申请（CN103709202A、CN103788134A）或其他公知的方法合成得到。
下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。
以下实施例中使用的核酸序列如下：
c-mycPu22:5’-TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA-3’（SEQIDNO：1）
Bcl-2Pu27：5’-CGGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGGAGC-3’（SEQIDNO：2）
c-Kit1：5’-GGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG-3'（SEQIDNO：3）
K-ras：5’-GCGGTGTGGGAAGAGGGAAGAGGGGGAGGCAG-3’（SEQIDNO：4）
端粒DNA序列：5’-TTAGGG-3'
AS1411序列：5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3′（SEQIDNO：5）
miR-21RNA序列：5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’（SEQIDNO：6）
PAR-1siRNA:5’-AGAUUAGUCUCCAUCAUA-3’（SEQIDNO：7）。
实施例1:[Ru(bpy)pBEPIP](ClO4)2 －c-myc启动区DNA复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2(图1A)与1mMc-mycPu22溶液按1:1均匀混合，加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了c-mycPu22序列发生自组装形成了纳米管结构(图1B)。
实施例2:[Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2-端粒DNA复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2与1mM端粒DNA(5’-TTAGGG-3’)溶液按1:1均匀混合，溶液按1:1均匀混合，加热至90℃，维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米管结构(图2)。
实施例3:[Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2 与bcl-2启动区DNA复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2与1mMBcl-2pu27溶液按1:1均匀混合，加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米管结构(图3)。
实施例4:[Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2 与c-kit启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2与1mMc-kitpu27溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米管结构(图4)。
实施例5:[Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2 与K-Ras启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2与1mMK-Raspu32溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米管结构(图5)。
实施例6:[Ru(bpy)2pBEPIP]Cl2 与核酸适配体AS1411DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(bpy)2pBEPIP]Cl2与1mMAS1411DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米管结构(图6)。
实施例7:[Ru(bpy)2pBEPIP]Cl2 与CT-DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(bpy)2pBEPIP]Cl2与1mMCT-DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米管结构(图7)。
实施例8:[Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2 与miR-21纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2与10mMmiR-21溶液按1:10均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米管结构(图8)。
实施例9:[Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2 与PAR-1SiRNA纳米复合物的制备
实验方法：10mM[Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2与1mMSiRNA)溶液按10:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米管结构(图9)。
实施例10: Λ -[Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2与c-mycpu22DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mMΛ-[Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2(图10A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米管结构(图10B)。
实施例11: Δ- [Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mMΔ-[Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2(图11A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米管结构(图11B)。
实施例12:[Ru(phen)2pBEPIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(phen)2pBEPIP](ClO4)2(图12A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米管结构(图12B)。
实施例13:[Ru(bpy)2pTEPIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(bpy)2pTEPIP](ClO4)2(图13A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米管的结构(图13B)。
实施例14:[Ru(phen)2pTEPIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(bpy)2pTEPIP](ClO4)2(图14A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米管结构(图14B)。
实施例15:[Ru(bpy)2pEPIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(bpy)2pEPIP](ClO4)2(图15A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图15B)。
实施例16:[Ru(phen)2pEPIP](ClO 4 ) 2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(bpy)2pEPIP](ClO4)2(图16A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米管结构(图16B)。
实施例17:[Ru(bpy)2oBEPIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(bpy)2oBEPIP](ClO4)2(图17A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图17B)。
实施例18:[Ru(bpy)2mBEPIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(bpy)2mBEPIP](ClO4)2(图18A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图18B)。
实施例19:[Ru(phen)2oBEPIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(phen)2oBEPIP](ClO4)2(图19A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图19B)。
实施例20:[Ru(phen)2mBEPIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(phen)2mBEPIP](ClO4)2(图20A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图20B)。
实施例21:[Ru(phen)2pBEPIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(phen)2pBEPIP](ClO4)2(图21A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图21B)。
实施例22:[Ru(bpy)2PIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：10mM[Ru(bpy)2PIP](ClO4)2(图22A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按10:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图22B)。
实施例23:[Ru(phen)2PIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：10mM[Ru(phen)2PIP](ClO4)2(图23A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按10:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图23B)。
实施例24:[Ru(bpy)2oBrPIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(bpy)2oBrPIP](ClO4)2(图24A)与10mMc-mycpu22DNA溶液按1:10均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图24B)。
实施例25:[Ru(bpy)2mBrPIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(bpy)2mBrPIP](ClO4)2(图25B)与10mMc-mycpu22DNA溶液按1:10均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图25B)。
实施例26:[Ru(bpy)2pBrPIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(bpy)2pBrPIP](ClO4)2(图26A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图26B)。
实施例27:[Ru(phen)2oBrPIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(phen)2oBrPIP](ClO4)2与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图27)。
实施例28:[Ru(phen)2mBrPIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(phen)2mBrPIP](ClO4)2与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图28)。
实施例29:[Ru(phen)2pBrPIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(phen)2pBrPIP](ClO4)2与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图29)。
实施例30:[Ru(bpy)2oMOPIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(bpy)2oMOPIP](ClO4)2与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图30)。
实施例31[Ru(bpy)2mMOPIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(bpy)2mMOPIP](ClO4)2与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图31)。
实施例32:[Ru(bpy)2pMOPIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(bpy)2pMOPIP](ClO4)2与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图32)。
实施例33:[Ru(phen)2oMOPIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(phen)2oMOPIP](ClO4)2(图33A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图33B)。
实施例34:[Ru(phen)2mMOPIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(phen)2mMOPIP](ClO4)2(图34A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图34B)。
实施例35[Ru(phen)2pMOPIP](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(phen)2pMOPIP](ClO4)2(图35A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图35B)。
实施例36[Ru(bpy)2DPPZ](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(bpy)2DPPZ](ClO4)2(图36A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图36B)。
实施例37[Ru(phen)2DPPZ](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(phen)2DPPZ](ClO4)2(图37A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图37B)。
实施例38[Ru(bpy)23-BrDPPZ](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(bpy)23-BrDPPZ](ClO4)2(图38A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图38B)。
实施例39[Ru(phen)23-BrDPPZ](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(phen)23-BrDPPZ](ClO4)2(图39A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图39B)。
实施例40[Ru(bpy)23-BEDPPZ](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(bpy)23-BEDPPZ](ClO4)2(图40A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图40B)。
实施例41[Ru(phen)23-BEDPPZ](ClO4)2 与c-myc启动区DNA纳米复合物的制备
实验方法：1mM[Ru(phen)23-BEDPPZ](ClO4)2(图41A)与1mMc-mycpu22DNA溶液按1:1均匀混合，微波辐射加热至90℃维持0.5～10min，然后自然冷却至室温，4℃静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌(II)配合物，得多吡啶钌(II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序列发生自组装形成了类似纳米球结构(图41B)。
外消旋炔基钌配合物Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2 （实施例1的复合物）与c-mycDNA形成的纳米复合物对HepG2细胞吸收与分布
取对数生长周期的细胞种植于2cm的细胞培养皿中，密度为2×105个/孔。加入1mL含5μM钌配合物-核酸（FAM荧光标记）复合物(Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2:FAM-c-mycpu22DNA=1:1)的DMEM在5%CO2培养箱中37℃下孵育2h，孵育后的细胞放置于荧光显微镜下观察，结果如图42所示。从图中发现手性炔基钌配合物可以将核酸运转运转进入活细胞内，并分布在整个细胞中。
外消旋炔基钌配合物Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2 （实施例1的复合物）与c-mycDNA形成的纳米复合物对Hela细胞的吸收和分布
取对数生长周期的细胞种植于2cm的细胞培养皿中，密度为2×105个/孔。加入1mL含5μM钌配合物-核酸（FAM荧光标记）复合物(Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2:FAM-c-mycpu22DNA=1:1)的DMEM在5%CO2培养箱中37℃下孵育2h，孵育后的细胞放置于荧光显微镜下观察，结果如图43所示。从图中发现外消旋炔基钌配合物可以将核酸运转进入活细胞内，并分布在整个细胞中。
外消旋炔基钌配合物Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2 （实施例1的复合物）与c-mycDNA形成的纳米复合物对MCF-7细胞的吸收和分布
取对数生长周期的细胞种植于2cm的细胞培养皿中，密度为2×105个/孔。加入1mL含5μM钌配合物-核酸（FAM荧光标记）复合物(Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2:FAM-c-mycpu22DNA=1:1)的DMEM在5%CO2培养箱中37℃下孵育2h，孵育后的细胞放置于荧光显微镜下观察，结果如图44所示。从图中发现外消旋炔基钌配合物可以将核酸运转进入活细胞内，并分布在整个细胞中。
左旋炔基钌配合物Λ -Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2 （实施例10的复合物）与c-mycDNA形成的纳米复合物对HepG2细胞的吸收和分布
取对数生长周期的细胞种植于2cm的细胞培养皿中，密度为2×105个/孔。加入1mL含5μM钌配合物-核酸（FAM荧光标记）复合物(Λ-Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2:FAM-c-mycpu22DNA=1:1)的DMEM在5%CO2培养箱中37℃下孵育2h，孵育后的细胞放置于荧光显微镜下观察，结果如图45所示。从图中发现左旋炔基钌配合物可以将核酸运转进入活细胞内，并分布在细胞核中。
左旋炔基钌配合物Λ -Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2 （实施例10的复合物）与c-mycDNA形成的纳米复合物对MCF-7细胞的吸收和分布
取对数生长周期的细胞种植于2cm的细胞培养皿中，密度为2×105个/孔。加入1mL含5μM钌配合物-核酸（FAM荧光标记）复合物(Λ-Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2:FAM-c-mycpu22DNA=1:1)的DMEM在5%CO2培养箱中37℃下孵育2h，孵育后的细胞放置于荧光显微镜下观察，结果如图46所示。从图中发现左旋炔基钌配合物可以将核酸运转进入活细胞内，并分布在细胞核中。
右旋炔基钌配合物Δ -Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2 （实施例11的复合物）与c-mycDNA形成的纳米复合物对HepG2细胞的吸收和分布
取对数生长周期的细胞种植于2cm的细胞培养皿中，密度为2×105个/孔。加入1mL含5μM钌配合物-核酸（FAM荧光标记）复合物(Δ-Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2:FAM-c-mycpu22DNA=1:1)的DMEM在5%CO2培养箱中37℃下孵育2h，孵育后的细胞放置于荧光显微镜下观察，结果如图47所示。从图中发现右旋炔基钌配合物可以将核酸运转进入活细胞内，并分布在细胞质中。
左旋炔基钌配合物Λ -Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2 （实施例11的复合物）与AS1411DNA形成的纳米复合物对MCF-7细胞的吸收和分布
取对数生长周期的细胞种植于2cm的细胞培养皿中，密度为2×105个/孔。加入1mL含5μM钌配合物-核酸（FAM荧光标记）复合物(Δ-Ru(bpy)2pBEPIP](ClO4)2:FAM-AS1411DNA=1:1)的DMEM在5%CO2培养箱中37℃下孵育2h，孵育后的细胞放置于荧光显微镜下观察，结果如图48所示。从图中发现右旋炔基钌配合物可以将核酸运转进入活细胞内，并分布在细胞核中。
<110>广东药学院
<120>钌配合物作为靶向细胞核核酸载体的应用
<130>
<160>7
<170>PatentInversion3.5
<210>1
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<213>人工序列
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tgagggtggggagggtggggaa22
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<212>RNA
<213>人工序列
<400>7
agauuagucuccaucaua18
Claims (10)
1.钌配合物作核酸载体的应用，所述钌配合物具有如下结构通式：
、、或，
式中，
L为辅助配体，其结构式为、、或；
R独立选自取代烷基、取代苯基、取代吡啶基、取代呋喃基、取代噻唑和取代吡咯的取代基任选自羟基、硝基、卤素、氨基、羧基、氰基、巯基、碳原子数为3～8的环烷基、SO3H、碳原子数为1～6的烷基、碳原子数为2～6的链烯基、碳原子为2～6的链炔基、羟基(C1-C6)烷基、氨基(C1-C6)烷基、CO2R’、CONR’R’、COR’、SO2R’R’、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷硫基、-N=NR’、NR’R’或三氟(C1-C6)烷基；其中，所述R’选自H、碳原子数为1～6的烷基或苯基；
R1独立选自氢，羟基，三甲基硅基，碳原子数为1～6的烷基或碳原子为1～6的取代烷基，苯基或取代苯基，吡啶基或取代吡啶基，呋喃基或取代呋喃基，吡咯基或取代吡咯基，噻唑或取代噻唑基；式中R1取代的乙炔基位置可以位于苯环的邻位、间位或者对位；取代乙炔基的数量为1个，2个或者是多个；
R2独立的选自甲基、甲氧基、硝基、卤素；
Y为使钌(II)配合物整体呈电中性的离子或者酸根离子，n为使钌(II)配合物整体呈电中性的离子或者酸根离子的数目；
核酸序列的长度至少为4bp。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：钌配合物选自、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：钌配合物为其单一手性异构体。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：核酸的长度不超过3000bp。
5.根据权利要求1或4所述的应用，其特征在于：核酸上标记有荧光基团。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：核酸选自c-myc启动区DNA,C-kit启动区DNA,bcl-2启动区DNA,miR-21，AS1411的DNA、SiRNA、microRNA、核酸适配体以及mRNA。
7.钌配合物-核酸复合物作为荧光探针的应用，其中钌配合物如权利要求1～3任意一项所述。
8.钌配合物-核酸复合物的制备方法，包括如下步骤：将钌配合物与核酸溶液混合均匀，加热至70～100℃并维持30S～30min；冷却后去除游离的钌配合物，得到钌配合物-核酸复合物；其中，钌配合物的结构式如权利要求1～3任意一项所述，核酸的长度不低于4bp。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：核酸上标记有荧光基团。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：使用微波进行加热。
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 510240 40 Haizhuqu District, Guangdong, Guangzhou. Applicant after: Guangdong Pharmaceutical University Address before: 510006 No. 280 East Ring Road, Guangzhou City University, Guangdong Applicant before: Guangdong Pharmaceutical University |
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| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |