CN105210865A - 美国野豌豆高频再生体系建立的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业栽培生物技术领域，特别涉及一种美国野豌豆高频再生体系建立的方法。选取美国野豌豆的幼茎为外植体，消毒后蘸取愈伤培养基S1，外植体转入生根培养基S2中处理20-26小时生根培养，再插入生苗生根培养基S3浸拌处理的湿沙基质中，置于20-25℃恒温条件育苗，得到的幼苗最终炼苗、移栽。本发明高频再生体系具有生长繁殖快、重复性高、操作简单、条件易于控制等特点，本发明生根率可达100％，移栽成活率也可达100％。不仅可以迅速地获得大量优质的美国野豌豆，还可以为以后用作生物技术和基因工程方法对植物进行遗传改良。美国野豌豆的种植也可以满足生态环境建设的需要，更是促进畜牧业可持续发展的重要措施。

Description

美国野豌豆高频再生体系建立的方法

技术领域

本发明属于农业栽培生物技术领域，特别涉及一种美国野豌豆高频再生体系建立的方法。

背景技术

美国野豌豆(ViciasepiumLinn)，植物界，双子叶植物纲，豆科，多年生草本，多花，是一种良好的蜜源植物，以全草入药。夏季采，晒干或鲜用。根可以生吃，煮熟后味道更好。种子含油。叶及花果药用有清热、消炎解毒之效。植株秀美、花色艳丽，可作观赏花卉。现蕾期出现较早，这时分枝甚少，茎枝低矮、细嫩柔软，其营养成分粗蛋白质高达26.9％，而此时产草量也高。开春以后，随着气温升高，植株开始迅猛生长，4月14日进入结荚期，植株高达83.5cm，茎叶虽尚为绿色，这时叩割产草量高，但营养成分却降低了，粗纤维增加，粗蛋白质则降低为18.55％。从植株分枝情况来看，秋播时在结实期的分枝数可达30–40个，而春播时在结荚期分枝仅20个左右。因而最适宜收刈时期应在结荚期，从收刈时期来看也较同属植物早20天左右，这在南方水稻区推广，对缓解前后茬矛盾上是很有利的。在我国南方旱作区推广尚可解决收种和牧草的矛盾；因此，野豌豆可望培育成南方农田推广的绿肥新品种。野豌豆茎叶含钙、磷比较丰富，用作青饲、青贮和调制干草。美国野豌豆的种植既可以满足生态环境建设的需要，更是促进畜牧业可持续发展的重要措施。

植物的高频再生体系是以植物幼茎扦插技术为主要手段，在整个体系上需要保证再生体系的培养能够完整实施，主要的技术手段一是选择恰当植物外植体材料，二是对各阶段培养基生根组分的选择与优化。

专利号为CN102144559A的专利公布了一种扁穗牛鞭草高频再生体系建立方法，以扁穗牛鞭草幼茎或幼叶为外植体建立高频再生体系，依照愈伤组织诱导、愈伤组织继代培养、愈伤组织分化培养、再生苗增殖培养、再生苗生根培养、再生苗炼苗移栽的操作流程建立扁穗牛鞭草高频再生体系。

专利号为CN103947548A的专利公布了一种百子莲高频再生体系建立的方法，以百子莲幼小花蕾为外植体建立高频再生体系。

虽然目前已有植物愈高频再生体系研究的报道，但目前关于美国野豌豆高频再生体系建立的方法还未有研究和专利公布。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种美国野豌豆(ViciasepiumLinn)高频再生体系建立的方法，该方法重复性好、再生率高，不仅可以迅速地获得大量优质的美国野豌豆，还可以为以后用作生物技术和基因工程方法对植物进行遗传改良。美国野豌豆的种植也可以满足生态环境建设的需要，更是促进畜牧业可持续发展的重要措施。为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

美国野豌豆高频再生体系建立的方法，包括以下步骤：

1)外植体的选取与处理：选取美国野豌豆的幼茎为外植体，消毒后蘸取愈伤培养基S1；

2)生根培养：将步骤1)处理后的外植体转入生根培养基S2中处理20-26小时；

3)生苗生根培养：将步骤2)处理后的外植体插入生苗生根培养基S3浸拌处理的湿沙基质中，置于20-25℃恒温条件育苗，得到幼苗。

外植体选取材料几乎包括了植物体的各个部位，如茎尖、茎段、花瓣、根、叶、子叶、鳞茎、胚珠和花药等。不同种类的植物以及同种植物不同的器官对诱导条件的反应是不一致的。选取材料时要对所培养植物各部位的诱导及分化能力进行比较，从中筛选出合适的、最易表达全能性的部位作为植体。本发明选取性美国野豌豆的幼茎为外植体，其生长速度快，繁殖率高，不容易发生变异，是获得脱毒苗木的有效途径。

进一步，步骤1)所述消毒的处理的试剂包括75％的酒精和0.1％的氯化汞，所述外植体在中0.1％的氯化汞中消毒时间为4-7分钟。

作为一种优选，将所述外植体置于75％的酒精中灭菌20-35秒，取出后用无菌水冲洗3次，再浸于0.1％的氯化汞中灭菌4-7分钟，取出后用无菌水冲洗4-6次。不同消毒方法对外植体的影响不同，0.1％的氯化汞消毒效果随灭菌时间的增加而加强，外植体消毒10min污染率为0，消毒7min外植体出现枯死，消毒10min枯死数量明显增加。所以本发明外植体在中0.1％的氯化汞中消毒时间为4-7分钟效果较好。

进一步，步骤1)所述愈伤培养基S1包含蜂蜜原液。蜂蜜原液由于含有高浓度葡萄糖和果糖等单糖，具有较高的渗透压，可防止植株伤口流失水分，促进伤口愈合的作用。

进一步，步骤2)所述生根培养基S2包含100-1000mg/L的α-萘乙酸钠和100-1000mg/L吲哚丁酸钾的水溶液，pH为5-9。

a-萘乙酸钠为生长素类植物生长调节剂，是光谱性的植物生长调节剂，促进细胞分裂和组织分化，用于果实膨大及块根块茎的膨大。诱导根和不定根的形成，用于加快扦插枝条生根和种子发根。还可以用于保花保果，提高产量，增强抗逆能力等，是一种广谱、高效、低毒的植物生长调理剂。吲哚丁酸钾是一种促生根类植物生长调节剂，主要用于插条生根剂，诱导作物形成不定根，具有长效性与专一性的特点，并集中在生长点部位，促进细胞分裂，诱导形成不定根，表现为根多，根直，根粗，根毛多。易溶于水，活性比吲哚乙酸高，稳定性好，使用安全。

进一步，步骤2)所述生根培养基S2包含100-600mg/L的α-萘乙酸钠和100-600mg/L吲哚丁酸钾的水溶液，pH为5-9。

进一步，步骤3)所述生苗生根培养基S3包含100-1000mg/L的α-萘乙酸钠、100-1000mg/L吲哚丁酸钾和100-1000mg/L磷酸二氢钾的水溶液，pH为5-9。

磷酸二氢钾是一种培养剂，可用于配制培养基，植物生长需要磷和钾，磷酸二氢钾做为缓冲剂，在培养基中可提供增加K和P元素。培养基中含有外植体生长所需要的营养物质，是组织培养中外植体赖以生存和发展的基础。外在组织培养的各个阶段，基本培养基都是最重要的因素，因此选择合适的培养基是组织培养成功与否的关键因素。

进一步，步骤3)中所述外植体插入基质中的1cm。

进一步，步骤3)所述育苗的日光照度为2000-3000lx，时间为16-22天，16小时/天。

进一步，美国野豌豆高频再生体系建立的方法，还包括步骤：

4)将步骤3)所述幼苗进行炼苗培养和移栽。

进一步，所述炼苗培养的时间为5-15天，所述移栽基质为沙土。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种美国野豌豆高频再生体系建立的方法，所建立的美国野豌豆高频再生体系具有更良好的技术效果，具有生长繁殖快、重复性高、操作简单、条件易于控制等特点。在优选条件下，上述方法可以通过对各培养阶段中培养基组分的优化提高美国野豌豆高频再生体系在各阶段的产出率与产物品质。试验数据显示，蘸取S1培养基，再在S2培养基上处理24小时后，插入以S3培养基浸拌处理的湿沙基质中1CM，置于20-25℃恒温条件育苗，10天后生根率可达100％，移栽成活率也可达100％。不仅可以迅速地获得大量优质的美国野豌豆，还可以为以后用作生物技术和基因工程方法对植物进行遗传改良。美国野豌豆的种植也可以满足生态环境建设的需要，更是促进畜牧业可持续发展的重要措施。

附图说明

图1为用本发明方法建立再生体系系统移栽后的美国野豌豆示意图。

具体实施方式

以下将结合附图，对本发明作详细的说明。为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以，熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

美国野豌豆高频再生体系的建立

材料

(1)植物外植体材料：以美国野豌豆的幼茎为外植体材料。

(2)主要试剂：

取α-萘乙酸钠0.1-1g和吲哚丁酸钾0.1-1g，用少量无水乙醇溶解后，加蒸馏水配成1mg/L的母液，于4℃下保存待用。

磷酸二氢钾母液：磷酸二氢钾0.1-1g，用少量蒸馏水溶解后，加蒸馏水配成1mg/L的母液，于4℃下保存待用。

实施例一

(1)步骤1

将外植体材料置于75％的酒精中灭菌30秒，取出后用无菌水冲洗3次，再浸于0.1％的氯化汞中灭菌约5分钟，取出后用无菌水冲洗5次；在无菌环境下，将外植体材料蘸取S1培养基上进行愈伤。S1培养基：蜂蜜。

(2)步骤2

S2培养基：100mg/L的α-萘乙酸钠和100mg/L吲哚丁酸钾的水溶液。

将步骤S1中得到的愈伤组织向根端浸于S2培养基中处理24小时。

(3)步骤3

S3培养基：100mg/L的α-萘乙酸钠、100mg/L吲哚丁酸钾和100mg/L磷酸二氢钾的水溶液。

将步骤2得到的生长质量良好的插条插入以S3培养基浸拌处理的湿沙基质中1cm；培养条件为20℃、2000lx、16小时/天。

(4)步骤S4再生苗移栽

将生长20天的幼苗进行移栽，具体为：幼苗在小心洗净基部残留培养基后移栽至小盆内，移栽基质为沙土。

实施例二

(1)步骤1

将外植体材料置于75％的酒精中灭菌30秒，取出后用无菌水冲洗3次，再浸于0.1％的氯化汞中灭菌约5分钟，取出后用无菌水冲洗5次；在无菌环境下，将外植体材料蘸取S1培养基上进行愈伤。S1培养基：蜂蜜。

(2)步骤2

S2培养基：200mg/L的α-萘乙酸钠和200mg/L吲哚丁酸钾的水溶液。

将步骤S1中得到的愈伤组织向根端浸于S2培养基中处理24小时。

(3)步骤3

S3培养基：100mg/L的α-萘乙酸钠、100mg/L吲哚丁酸钾和100mg/L磷酸二氢钾的水溶液。

将步骤2得到的生长质量良好的插条插入以S3培养基浸拌处理的湿沙基质中1cm；培养条件为20℃、3000lx、16小时/天。

(4)步骤S4再生苗移栽

将生长20天的幼苗进行移栽，具体为：幼苗在小心洗净基部残留培养基后移栽至小盆内，移栽基质为沙土。

实施例三

(1)步骤1

将外植体材料置于75％的酒精中灭菌30秒，取出后用无菌水冲洗3次，再浸于0.1％的氯化汞中灭菌约5分钟，取出后用无菌水冲洗6次；在无菌环境下，将外植体材料蘸取S1培养基上进行愈伤。S1培养基：蜂蜜。

(2)步骤2

S2培养基：400mg/L的α-萘乙酸钠和400mg/L吲哚丁酸钾的水溶液。

将步骤S1中得到的愈伤组织向根端浸于S2培养基中处理24小时。

(3)步骤3

S3培养基：100mg/L的α-萘乙酸钠、100mg/L吲哚丁酸钾和100mg/L磷酸二氢钾的水溶液。

将步骤2得到的生长质量良好的插条插入以S3培养基浸拌处理的湿沙基质中1cm；培养条件为20℃、3000lx、16小时/天。

(4)步骤S4再生苗移栽

将生长20天的幼苗进行移栽，具体为：幼苗在小心洗净基部残留培养基后移栽至小盆内，移栽基质为沙土。

实施例四

(1)步骤1

将外植体材料置于75％的酒精中灭菌30秒，取出后用无菌水冲洗3次，再浸于0.1％的氯化汞中灭菌约5分钟，取出后用无菌水冲洗6次；在无菌环境下，将外植体材料蘸取S1培养基上进行愈伤。S1培养基：蜂蜜。

(2)步骤2

S2培养基：500mg/L的α-萘乙酸钠和500mg/L吲哚丁酸钾的水溶液。

将步骤S1中得到的愈伤组织向根端浸于S2培养基中处理24小时。

(3)步骤3

S3培养基：100mg/L的α-萘乙酸钠、100mg/吲哚丁酸钾和100mg/磷酸二氢钾的水溶液。

将步骤2得到的生长质量良好的插条插入以S3培养基浸拌处理的湿沙基质中1cm；培养条件为20℃、3000lx、16小时/天。

(4)步骤S4再生苗移栽

将生长20天的幼苗进行移栽，具体为：幼苗在小心洗净基部残留培养基后移栽至小盆或田地内，移栽基质为沙土。

以上高频再生体系实施例中，移栽15天左右开始出现分蘖，见图1，观察统计可知，移栽成活率为100％，而采用传统扦插技术繁殖移栽成活率不足10％。结果表明，成活的群体生长整齐、旺盛、当年开花结果，保持了美国野豌豆的植物学性状。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.美国野豌豆高频再生体系建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)外植体的选取与处理：选取美国野豌豆的幼茎为外植体，消毒后蘸取愈伤培养基S1；

2)生根培养：将步骤1)处理后的外植体转入生根培养基S2中处理20-26小时；

3)生苗生根培养：将步骤2)处理后的外植体插入生苗生根培养基S3浸拌处理的湿沙基质中，置于20-25℃恒温条件育苗，得到幼苗。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述消毒的处理的试剂包括75％的酒精和0.1％的氯化汞，所述外植体在中0.1％的氯化汞中消毒时间为4-7分钟。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述愈伤培养基S1包含蜂蜜原液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述生根培养基S2包含100-1000mg/L的α-萘乙酸钠和100-1000mg/L吲哚丁酸钾的水溶液，pH为5-9。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述生根培养基S2包含100-600mg/L的α-萘乙酸钠和100-600mg/L吲哚丁酸钾的水溶液，pH为5-9。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)所述生苗生根培养基S3包含100-1000mg/L的α-萘乙酸钠、100-1000mg/L吲哚丁酸钾和100-1000mg/L磷酸二氢钾的水溶液，pH为5-9。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述外植体插入基质中的1cm。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述育苗的日光照度为2000-3000lx，时间为16-22天，16小时/天。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤：

4)将步骤3)所述幼苗进行炼苗培养和移栽。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述炼苗培养的时间为5-15天，所述移栽基质为沙土。