CN105198984A - 邻苯二甲酸二甲酯人工免疫原及其制备和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种邻苯二甲酸二甲酯人工免疫原及其制备和用途;所述邻苯二甲酸二甲酯人工免疫原DMP-BSA的结构式为:其制备方法为通过重氮化法将DMP半抗原与蛋白质分子BSA偶联制备获得。本发明免疫原制备方法简单,稳定性好,成本低,易于工业化生产。邻苯二甲酸二甲酯人工免疫原DMP-BSA通过免疫动物后制备成特异性抗体,为建立免疫检测方法奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种邻苯二甲酸二甲酯人工免疫原DMP-BSA及其制备和用途,具体是一种用于新兴持久性有机污染物——塑化剂类免疫检测的邻苯二甲酸二甲酯人工免疫原DMP-BSA及其制备方法和用途。
背景技术
邻苯二甲酸酯类塑化剂(缩写为PAEs),又称酞酸酯类,是一类由邻苯二甲酸与含有4-15个碳的醇发生费歇尔(Fischer)酯化反应所形成的酯的重要衍生物的统称。这类物质有特殊性气味,毒性较大,一般情况下状态为粘稠液体;液态条件下温度范围宽,流动性大,挥发性低,不溶于水,易溶于大多数有机溶剂。这类物质用途广泛,它不仅可作为食品包装材料、玩具、农药载体、驱虫剂、润滑剂、乙烯地板和壁纸、去泡剂、清洁剂、医用材料(如人工心脏瓣膜等人工器官、血袋、注射器和胶管)和个人护理用品(主要有化妆品、香味品、指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液)等近千种产品的生产原材料,还常作为塑料增塑剂被用于改造塑料制品性能。
邻苯二甲酸二甲酯(英文名称:Dimethylphthalate,简称DMP),又名酞酸二甲酯、避蚊酯、驱蚊油等,CAS号为131-11-3,分子式为C10H10O4,分子量为194.19,无色透明微黄色油状液体,稍具芳香味,能与乙醇、乙醚等一般有机溶剂混溶,不溶于水和石油醚;高度易燃,遇明火、高热、氧化剂有燃烧的危险。该物质微毒,对眼睛粘膜有较强的刺激性;可能对胎儿造成伤害,对水生生物有极高毒性;有损害生育能力的危险性;吸入、皮肤接触及吞食有毒;人体组织内可蓄积,从而抑制中枢神经系统。由于其具备良好的塑膜性、粘着性和防水性,故常被用于制作醋酸纤维素的薄膜、清漆涂料、透明纸和成模塑料粉等;还可用作驱蚊油、聚氟乙烯涂料以及杀虫剂的溶剂]。近些年来,由于频频发现该物质在食品、水体中的含量过高,因此,该物质含量的检测便备受关注。
目前,关于邻苯二甲酸二甲酯的研究主要集中在水体、沉积物、大气等环境领域和生物体的毒性方面,但样品的检测方法方面研究较少。目前对邻苯二甲酸二甲酯的检测手段主要为气相色谱和高效液相色谱等仪器检测方法,这些方法虽然准确可靠,但对样品的预处理方法和操作人员的专业性有很高的要求。正因为这些方法的处理复杂、耗时、仪器价格昂贵而不适合推广使用,也不利于在环境污染事故现场快速检测。为克服这些缺点,寻求一种快速、简便、灵敏且经济实用的分析方法就成为环境监测领域的主要研究方向。
20世纪60年代发展起来的免疫分析(Immunoassay,IA)是基于抗原和抗体的特异性、可逆性结合反应的分析技术。免疫分析具有常规理化分析技术无可比拟的选择性和高灵敏性,非常适合复杂介质中痕量组分的分析。因此免疫分析具有的特异性强、灵敏度高、方法快捷简单、分析通量大、检测成本低等优点,使得该类方法可以满足简单、快速、灵敏地检测持久性有机污染物的要求。1985年美国Cetus公司的K.B.Mullis和R.K.Saiki等发明了一种特异性DNA体外扩增技术,成为PolymeraseChainReaction,简称PCR,即聚合酶链式反应。1992年Sano等将免疫分析技术与PCR技术结合,发展出荧光免疫PCR技术。荧光免疫PCR技术兼具了免疫分析的特异性强和PCR技术的灵敏度高(检测限高达10-11~10-12g/L)的特点,可用于检测环境中痕量污染物。
目前,尚无用荧光免疫PCR技术检测DMP的相关报道。而制备合格的DMP人工免疫原是生物免疫得到高特异性抗DMP抗体的前提,更是建立DMP荧光免疫PCR检测分析方法的关键,这将具有重要的应用价值和理论研究意义。
发明内容
针对上述现有技术中的缺陷,本发明的目的是提供一种步骤简单,速度快,产率高的邻苯二甲酸二甲酯人工免疫原(DMP-BSA)及其制备和用途,为免疫得到特异性抗体和利用人工抗原、抗体建立免疫检测方法奠定基础。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
第一方面,本发明涉及一种邻苯二甲酸二甲酯的人工免疫原DMP-BSA,其结构式如式(Ⅰ)所示:
BSA为牛血清蛋白。
第二方面,本发明涉及一种邻苯二甲酸二甲酯的人工免疫原DMP-BSA的制备方法,所述方法包括采用重氮化法将DMP半抗原与牛血清蛋白BSA偶联制备人工免疫原DMP-BSA。
优选的,所述方法具体包括如下步骤:
S1、将所述DMP半抗原溶于呈强酸性的水溶液中,形成DMP半抗原溶液;
S2、向所述DMP半抗原溶液中滴加(逐滴加入,就是一滴一滴的滴入,每滴之间没有间隔;加入速度过快容易导致重氮盐制备效率降低)亚硝酸钠溶液(1M),控制pH为2.0~3.0,反应(20~40min,优选30min)结束后去除未反应的亚硝酸钠,生成重氮盐溶液;
S3、将牛血清蛋白BSA溶于0.01~0.05MpH9.18(pH过高或过低,均不利于本发明人工免疫原的制备)硼酸钠缓冲液中,形成牛血清蛋白溶液;
S4、在所述重氮盐溶液中滴加所述牛血清蛋白溶液,发生偶联反应,即得所述人工免疫原DMP-BSA。
本发明采用重氮化法合成邻苯二甲酸二甲酯人工免疫原,其反应方程式如下:
上述反应方程式中,中间产物重氮盐与牛血清蛋白BSA结合,偶联脱氯,生成了DMP人工免疫原
优选的,所述DMP半抗原、强酸、亚硝酸钠、牛血清蛋白BSA的摩尔比为1:3~4:8~10:0.001~0.005。
优选的,步骤S1中,所述强酸性的水溶液中的强酸选自浓盐酸、浓硫酸或浓硝酸。
优选的,步骤S1中,所述去除未反应的亚硝酸钠是加入尿素以去除未反应的亚硝酸钠,所述尿素与DMP半抗原的摩尔比为300~350:1。
优选的,步骤S4中,所述偶联反应是在0~4℃、搅拌的条件下进行,所述搅拌时间为2~3小时。所有需要保持蛋白活性的长时间反应都需要在低温情况下进行,经验表明0~4℃最合适。此外,为充分反应,根据经验,当半抗原与强酸、亚硝酸钠、尿素、BSA的摩尔比为1:3:8:300:0.001时搅拌反应2小时就可以,当半抗原与强酸、亚硝酸钠、尿素、BSA的摩尔比为1:4:10:350:0.005时反应就需要3小时。
优选的,所述步骤S4还包括偶联反应结束后,离心分离,将上清液装入透析袋中透析,离心分离沉淀即得所述人工免疫原DMP-BSA的步骤。
优选的,所述DMP半抗原是由包括如下步骤的方法制备而得:
4-硝基邻苯二甲酸与甲醇在浓盐酸或浓硫酸的催化下回流反应,生成4-硝基邻苯二甲酸二甲酯;
以苯或甲苯为溶剂,所述4-硝基邻苯二甲酸二甲酯和锌粉、浓盐酸或浓硫酸发生还原反应,生成所述DMP半抗原。DMP半抗原化学名称为4-氨基邻苯二甲酸二甲酯,分子式为C10H11NO4,分子量209.20。
所述4-硝基邻苯二甲酸、甲醇、浓盐酸或浓硫酸的摩尔比为1:5~6.5:0.6~0.7;所述4-硝基邻苯二甲酸二甲酯、浓盐酸或浓硫酸、苯或甲苯和锌粉的摩尔比为1:20~22:550~570:20~22。(其中苯或甲苯作为基质溶液并不参与反应)
理想状态下,4-硝基邻苯二甲酸、甲醇的摩尔比是1:2,但为了反应顺利进行,一般甲醇的用量是4-硝基邻苯二甲酸的摩尔量的5倍以上,但不能超过4-硝基邻苯二甲酸的摩尔量的6.5倍;此外,强酸作为酯化反应的催化剂,所用量一般是原料4-硝基邻苯二甲酸摩尔量的0.5倍以上,但不超过原料4-硝基邻苯二甲酸摩尔量的0.7倍;甲醇在80℃处于沸腾状态,那么100℃更处于沸腾状态,反应向右进行。
所述回流反应的温度为80~100℃,反应时间为5~6小时。
所述还原反应的温度为25~28℃,反应时间为12~15小时。
4-硝基邻苯二甲酸二甲酯的制备中,还包括回流反应结束后蒸馏除去未反应的甲醇和生成的水;此时将液体趁热倒入冰水中,析出固体;过滤后得到的固体粗品用10%Na2CO3溶液洗涤至水层呈无色,固体粗品用无水乙醇重结晶,得到纯化后的4-硝基邻苯二甲酸二甲酯的步骤。
DMP半抗原的制备中,还包括还原反应结束后用冰水和强碱溶液以终止反应,向反应液中加入苯,分离并干燥有机相,将干燥后的有机相去溶剂,硅胶柱层析分离纯化,得到纯化后的邻苯二甲酸二甲酯半抗原的步骤。
第三方面,本发明还涉及一种邻苯二甲酸二甲酯的人工免疫原DMP-BSA在用于痕量塑化剂邻苯二甲酸二甲酯检测中的用途,所述检测采用免疫检测法。
优选的,所述检测体系的建立包括:
所述人工免疫原通过生物体免疫反应法制备得到抗邻苯二甲酸二甲酯的特异性抗体;
所述邻苯二甲酸二甲酯半抗原偶联载体蛋白制得人工包被原;检测时,该人工包被原和邻苯二甲酸二甲酯与抗邻苯二甲酸二甲酯特异性抗体免疫球蛋白IgG发生特异性识别的反应,形成直接竞争关系,进而实现对痕量塑化剂邻苯二甲酸二甲酯检测。
本发明的邻苯二甲酸二甲酯人工免疫原DMP-BSA的应用,通过免疫动物制备抗邻苯二甲酸二甲酯特异性抗体,能与邻苯二甲酸二甲酯发生特异性免疫反应的免疫球蛋白IgG反应,用于水体、土壤、大气等环境样品和各类食品中痕量塑化剂邻苯二甲酸二甲酯的检测。
由于邻苯二甲酸二甲酯是小分子物质,只具有反应原性而没有免疫原性,而且该分子上没有能与蛋白质分子直接结合的氨基、仲氨基等官能团。本发明通过选择4-硝基邻苯二甲酸为原料,经两步反应制备带有氨基活性基团的DMP半抗原,然后用重氮化法将这个含氨基的半抗原与蛋白质分子偶联制备人工免疫原,在将制备的免疫原对新西兰大白兔免疫,得到高特异性的抗邻苯二甲酸二甲酯多克隆抗体,此抗体将用于建立针对邻苯二甲酸二甲酯的荧光免疫PCR分析方法。
与现有技术相比,本发明具有如下的有益效果:
(1)抗原实用性强:邻苯二甲酸二甲酯抗原制备和抗体制备具有重要的实用价值和现实意义。利用本专利中的方法,首次成功制备了邻苯二甲酸二甲酯人工免疫原DMP-BSA。该人工免疫原保留了邻苯二甲酸二甲酯的结构,具有针对邻苯二甲酸二甲酯的抗原决定簇,为制备特异性好、效价高的抗体和建立荧光免疫PCR方法提供了保障。
(2)抗原稳定性好:此法合成的邻苯二甲酸二甲酯人工抗原具有较好的稳定性,在0~4℃环境下可保存1年不变性,-20℃环境下可保存3年。
(3)抗原制备技术简便可行:抗原的整个制备过程无需特别的仪器设备,成本低廉,容易工业化规模生产。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
图1为邻苯二甲酸二甲酯半抗原和邻苯二甲酸二甲酯人工免疫原的合成路线图;
图2为邻苯二甲酸二甲酯半抗原红外光谱;
图3为邻苯二甲酸二甲酯半抗原的核磁共振谱图;
图4为邻苯二甲酸二甲酯半抗原、载体蛋白和人工免疫原紫外吸收光谱图;
图5为免疫新西兰大白兔产生的抗DMP抗体效价的变化;
图6为直接竞争法检测邻苯二甲酸二甲酯免疫PCR方法的扩增曲线;
图7为直接竞争免疫PCR方法检测邻苯二甲酸二甲酯的标准工作曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1、邻苯二甲酸二甲酯半抗原的合成
邻苯二甲酸二甲酯半抗原的合成路线图如图1所示:
(1)邻苯二甲酸二甲酯半抗原中间体的合成
称取10g(0.0474mol)4-硝基邻苯二甲酸加入到圆底烧瓶中,随后缓慢加入11.5mL(0.2850mol)甲醇,边搅拌边加入1.65mL(0.0304mol)浓H2SO4催化,逐渐升温至90℃回流加热5小时,直至薄板层析法(TLC)检测原料点消失为止(显色剂:丙酮溶剂中溶解少量的高锰酸钾;展开剂,正己烷:乙酸乙酯=5:1);反应结束后将反应液转移至旋转蒸发仪中减压蒸馏除去未反应的甲醇和生成的水,再趁热将液体倒入冰水中,析出固体;随后固体粗品用10%Na2CO3溶液洗涤至水层呈无色(pH7.0-8.0),固体粗品用无水乙醇重结晶,得浅黄色针状晶体4-硝基邻苯二甲酸二甲酯即DMP半抗原中间体。4-硝基邻苯二甲酸二甲酯分子式:C10H9NO6;分子量:239.18;产率:53.8%;熔点:64~66℃,纯度98%。
(2)邻苯二甲酸二甲酯半抗原的合成
称取1.5g(0.0063mol)DMP半抗原中间体(4-硝基邻苯二甲酸二甲酯)装入容积为500mL三口圆底烧瓶底部,随后向瓶底边搅拌边加入315mL(3.5432mol)苯,待4-硝基邻苯二甲酸二甲酯被苯溶解后再加入4.1g(0.0630mol)纯锌粉,搅拌均匀后分次加入11.25mL浓HCl(0.1350mol),25℃搅拌15min后再次加入4.1g(0.0630mol)纯锌粉,搅拌反应15h,薄板层析法(TLC)监测反应直至反应完全;反应结束后,将410mL冷水加入反应体系,并用1MNaOH溶液中和至弱碱性(pH7.0-8.5);静置1h后分离并保留苯层,再用苯萃取水层,合并萃取液,有机相经水洗后用无水Na2SO4脱水干燥以除去多余的水分;有机相减压蒸馏以除去苯,得到的粗品再用硅胶柱层析(洗脱剂为乙酸和正己烷的混合液(V/V=1:8))后减压蒸馏,得到淡黄色晶体4-氨基邻苯二甲酸二甲酯即DMP半抗原。邻苯二甲酸二甲酯半抗原分子式:C10H11NO4;分子量209.20;产率52.6%;熔点:79~81℃,纯度99%。
实施例2、邻苯二甲酸二甲酯半抗原的合成
邻苯二甲酸二甲酯半抗原的合成路线图如图1所示:
(1)邻苯二甲酸二甲酯半抗原中间体的合成
称取10g(0.0474mol)4-硝基邻苯二甲酸加入到圆底烧瓶中,随后缓慢加入9.6mL(0.2370mol)甲醇,边搅拌边加入1.67mL(0.0308mol)浓H2SO4催化,逐渐升温至80℃回流加热6小时,直至薄板层析法(TLC)检测原料点消失为止(显色剂:丙酮溶剂中溶解少量的高锰酸钾;展开剂,正己烷:乙酸乙酯=5:1);反应结束后将反应液转移至旋转蒸发仪中减压蒸馏除去未反应的甲醇和生成的水,再趁热将液体倒入冰水中,析出固体;随后固体粗品用10%Na2CO3溶液洗涤至水层呈无色(pH7.0-8.0),固体粗品用无水乙醇重结晶,得浅黄色针状晶体4-硝基邻苯二甲酸二甲酯即DMP半抗原中间体。4-硝基邻苯二甲酸二甲酯分子式:C10H9NO6;分子量:239.18;产率:53.8%;熔点:64~66℃,纯度98%。
(2)邻苯二甲酸二甲酯半抗原的合成
称取1.5g(0.0063mol)DMP半抗原中间体(4-硝基邻苯二甲酸二甲酯)装入容积为500mL三口圆底烧瓶底部,随后向瓶底边搅拌边加入315mL(3.5432mol)苯,待4-硝基邻苯二甲酸二甲酯被苯溶解后再加入4.51g(0.0693mol)纯锌粉,搅拌均匀后分次加入11.03mL浓HCl(0.1323mol),28℃搅拌15min后再次加入4.51g(0.0693mol),搅拌反应12h,薄板层析法(TLC)监测反应直至反应完全;反应结束后,将410mL冷水加入反应体系,并用1MNaOH溶液中和至弱碱性(pH7.0-8.5);静置1h后分离并保留苯层,再用苯萃取水层,合并萃取液,有机相经水洗后用无水Na2SO4脱水干燥以除去多余的水分;有机相减压蒸馏以除去苯,得到的粗品再用硅胶柱层析(洗脱剂为乙酸和正己烷的混合液(V/V=1:8))后减压蒸馏,得到淡黄色晶体4-氨基邻苯二甲酸二甲酯即DMP半抗原。邻苯二甲酸二甲酯半抗原分子式:C10H11NO4;分子量209.20;产率54.8%;熔点:79~81℃,纯度99%。
实施例3、邻苯二甲酸二甲酯半抗原的合成
邻苯二甲酸二甲酯半抗原的合成路线图如图1所示:
(1)邻苯二甲酸二甲酯半抗原中间体的合成
称取10g(0.0474mol)4-硝基邻苯二甲酸加入到圆底烧瓶中,随后缓慢加入12.4mL(0.3081mol)甲醇,边搅拌边加入1.80mL(0.0332mol)浓H2SO4催化,逐渐升温至100℃回流加热5小时,直至薄板层析法(TLC)检测原料点消失为止(显色剂:丙酮溶剂中溶解少量的高锰酸钾;展开剂,正己烷:乙酸乙酯=5:1);反应结束后将反应液转移至旋转蒸发仪中减压蒸馏除去未反应的甲醇和生成的水,再趁热将液体倒入冰水中,析出固体;随后固体粗品用10%Na2CO3溶液洗涤至水层呈无色(pH7.0-8.0),固体粗品用无水乙醇重结晶,得浅黄色针状晶体4-硝基邻苯二甲酸二甲酯即DMP半抗原中间体。4-硝基邻苯二甲酸二甲酯分子式:C10H9NO6;分子量:239.18;产率:53.8%;熔点:64~66℃,纯度98%。
(2)邻苯二甲酸二甲酯半抗原的合成
称取1.5g(0.0063mol)DMP半抗原中间体(4-硝基邻苯二甲酸二甲酯)装入容积为500mL三口圆底烧瓶底部,随后向瓶底边搅拌边加入315mL(3.5432mol)苯,待4-硝基邻苯二甲酸二甲酯被苯溶解后再加入4.31g(0.0662mol)纯锌粉,搅拌均匀后分次加入11.25mL浓HCl(0.1350mol),27℃搅拌15min后再次加入.31g(0.0662mol),搅拌反应13h,薄板层析法(TLC)监测反应直至反应完全;反应结束后,将410mL冷水加入反应体系,并用1MNaOH溶液中和至弱碱性(pH7.0-8.5);静置1h后分离并保留苯层,再用苯萃取水层,合并萃取液,有机相经水洗后用无水Na2SO4脱水干燥以除去多余的水分;有机相减压蒸馏以除去苯,得到的粗品再用硅胶柱层析(洗脱剂为乙酸和正己烷的混合液(V/V=1:8))后减压蒸馏,得到淡黄色晶体4-氨基邻苯二甲酸二甲酯即DMP半抗原。邻苯二甲酸二甲酯半抗原分子式:C10H11NO4;分子量209.20;产率55.1%;熔点:79~81℃,纯度99%。
实施例4、邻苯二甲酸二甲酯半抗原的表征
获得的DMP半抗原,其结构通过核磁共振、红外光谱、紫外光谱等检测手段分析鉴定,DMP半抗原中间体的红外光谱如图2所示,其特征如下:IR(KBr)ν/cm-1:3565.49(-NH2),1715.69(C=O),1299.00,1069.76(C-O-C),2923.28(-CH3),1436.56(d-OCH3),1631.05,1605.36(C=C),1193.53,960.27,709.58(C-H,Ar)。分析结果可知4-氨基邻苯二甲酸二甲酯的伯胺的N-H键的不对称伸缩振动(νasN-H)的吸收带出现在3565.49cm-1附近,这已充分证实硝基已经被还原成氨基;此外,芳酸酯νc=o吸收峰明显出现在在1715.69cm-1处,邻苯二甲酸酯的伸缩振动的双带出现在1299.00和1069.76cm-1处;芳核的两个νc=c吸收带出现在1631.05和1605.36cm-1处,这说明反应产物中具备苯环、甲氧基、氨基官能团的结构特征。
DMP半抗原的核磁共振氢谱图如图3所示,其特征如下:1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.67(d,1H,ArH),6.67(dd,1H,ArH),6.62(d,1H,ArH),4.28(d,2H,-NH2),3.86(s,3H,-O-CH3),3.79(s,3H,-O-CH3)ppm。从中可明显看出:苯环上引入氨基偶联臂后,δ4.17处出现氨基氢,波谱图中出现的氢原子的位置和个数与所合成的半抗原4-氨基邻苯二甲酸二甲酯结构相符。
实施例5、邻苯二甲酸二甲酯人工免疫原的合成
邻苯二甲酸二甲酯人工免疫原的合成路线图如图1所示:
采用重氮化法制备DMP免疫原DMP-BSA,具体合成步骤:将0.0209g(0.1mmol)DMP半抗原装入容积为25mL的锥形瓶中,边滴加0.75mLH2O边搅拌,混合后再加入0.025mL浓HCl(0.3mmol),待混合物加热溶解后置冰浴中冷却;随后,在4℃低温搅拌的情况下,逐滴滴加1M亚硝酸钠溶液(0.8mmol),用pH试纸控制反应酸度为2.0-3.0,同时用淀粉碘化钾试纸显色,显色时间为滴加后的1-3s,试纸由白色瞬间变成灰蓝色时停止滴加,再继续反应30min,加2.0g(0.0333mol)尿素以去除未反应的亚硝酸钠;然后,向上述重氮盐中逐滴加入0.08mM2.375mLBSA溶液(0.01MpH9.18硼酸钠缓冲液溶解)(0.00019mmol),直至溶液逐渐呈橙红色,继续反应2h后,将得到的抗原粗品装入透析袋,置于0.01MpH7.40磷酸盐缓冲液中透析3d,每隔8h换水1次,最后将终产物4000r·min-1离线15min,取其上清液即DMP免疫原DMP-BSA。免疫原经紫外-可见分光光度计鉴定后,小量分装,-20℃冷冻干燥、分装并于-20℃保存。
实施例6、邻苯二甲酸二甲酯人工免疫原的合成
邻苯二甲酸二甲酯人工免疫原的合成路线图如图1所示:
采用重氮化法制备DMP免疫原DMP-BSA,具体合成步骤:将0.0209g(0.1mmol)DMP半抗原装入容积为25mL的锥形瓶中,边滴加0.75mLH2O边搅拌,混合后再加入0.033mL浓HCl(0.4mmol),待混合物加热溶解后置冰浴中冷却;随后,在4℃低温搅拌的情况下,逐滴滴加1M亚硝酸钠溶液(1.0mmol),用pH试纸控制反应酸度为2.0-3.0,同时用淀粉碘化钾试纸显色,显色时间为滴加后的1-3s,试纸由白色瞬间变成灰蓝色时停止滴加,再继续反应30min,加2.1g(0.0350mol)尿素以去除未反应的亚硝酸钠;然后,向上述重氮盐中逐滴加入0.08mM6.25mLBSA溶液(0.01MpH9.18硼酸钠缓冲液溶解)(0.0005mmol),直至溶液逐渐呈橙红色,继续反应2.5h后,将得到的抗原粗品装入透析袋,置于0.01MpH7.40磷酸盐缓冲液中透析3d,每隔8h换水1次,最后将终产物4000r·min-1离线15min,取其上清液即DMP免疫原DMP-BSA。免疫原经紫外-可见分光光度计鉴定后,小量分装,-20℃冷冻干燥、分装并于-20℃保存。
实施例7、邻苯二甲酸二甲酯人工免疫原的合成
邻苯二甲酸二甲酯人工免疫原的合成路线图如图1所示:
采用重氮化法制备DMP免疫原DMP-BSA,具体合成步骤:将0.0209g(0.1mmol)DMP半抗原装入容积为25mL的锥形瓶中,边滴加0.75mLH2O边搅拌,混合后再加入0.029mL浓HCl(0.35mmol),待混合物加热溶解后置冰浴中冷却;随后,在4℃低温搅拌的情况下,逐滴滴加1M亚硝酸钠溶液(0.9mmol),用pH试纸控制反应酸度为2.0-3.0,同时用淀粉碘化钾试纸显色,显色时间为滴加后的1-3s,试纸由白色瞬间变成灰蓝色时停止滴加,再继续反应30min,加1.8g(0.03mol)尿素以去除未反应的亚硝酸钠;然后,向上述重氮盐中逐滴加入0.08mM2.5mLBSA溶液(0.01MpH9.18硼酸钠缓冲液溶解)(0.0001mmol),直至溶液逐渐呈橙红色,继续反应3h后,将得到的抗原粗品装入透析袋,置于0.01MpH7.40磷酸盐缓冲液中透析3d,每隔8h换水1次,最后将终产物4000r·min-1离线15min,取其上清液即DMP免疫原DMP-BSA。免疫原经紫外-可见分光光度计鉴定后,小量分装,-20℃冷冻干燥、分装并于-20℃保存。
实施例8、邻苯二甲酸二甲酯人工免疫原的鉴定
可进行人工免疫原鉴定的方法有色谱法、红外光谱法、紫外光谱法、SDS-PAGE凝胶电泳等。其中最常用的方法是紫外可见光谱法。一般来说,只要人工免疫原的紫外-可见光谱与载蛋白和半抗原的紫外光谱不同,即可间接说明半抗原成功与蛋白质偶联,人工免疫原合成成功。因为根据朗伯-比尔定律,当波长一定时,混合物的紫外吸收具有加合性。采用全波长紫外分光光度计对半抗原、载体蛋白和人工免疫原进行扫描,根据特征吸收峰的位置确定偶联是否成功。元素分析结果进一步证明了产物的结构和所设计的路线一致。
涉及的人工免疫原的表征:
将制备的人工免疫原适当稀释,使其吸光度在0.1~2之间,以PBS为空白对照,用紫外分光光度计在200~500nm分别测定DMP半抗原和DMP-BSA吸光值,绘制紫外吸收光谱图,并根据以下公式计算偶联比:
式中:ODconjugate——偶联物吸光度;ODprotein——蛋白质吸光值;ODhapten——半抗原吸光值;Chapten——半抗原浓度;Cprotein——蛋白质浓度;Mhapten——半抗原分子量;Mprotein——蛋白质分子量。
由图4的紫外光谱图可知,DMP半抗原4-氨基邻苯二甲酸二甲酯有一个紫外吸收峰,位于310nm处;BSA有两个紫外吸收峰,分别位于227nm和278nm处,其中278nm吸收峰处的吸收值很低;DMP人工免疫原有两个紫外吸收峰,分别位于219nm和332nm处。此外,我们可以清晰发现,半抗原在310nm处的紫外吸收峰发生红移后转移到332nm处,这说明半抗原上的氨基发生了重氮化后已经成功与BSA相互偶联结合;而BSA紫外吸收峰有所偏移,由227nm处移至219nm处,这说明有一部分氨基酸与DMP半抗原发生了偶联反应,从而使DMP半抗原、BSA与人工免疫原的紫外吸收光谱既有区别又有联系,综合得知:免疫原包含了DMP半抗原和蛋白质BSA的吸收特征,说明DMP半抗原已顺利偶联到载体蛋白表面,人工免疫原的合成制备成功。计算DMP-BSA中DMP与BSA的结合比为39.9:1。
实施例9、邻苯二甲酸二甲酯免疫原蛋白质浓度的测定
根据考马斯亮蓝G250法测定免疫原蛋白质浓度。考马斯亮蓝G250在游离时为红色,与蛋白质结合后为青蓝色,前者最大吸收值在465nm,后者在595nm处。以BSA为标准物质配置不同浓度标准溶液,与一定量考马斯亮蓝G250反应后,分别在595nm处测定溶液吸光度值。标准溶液在0-150μg/mL范围内线性关系良好。在稀释一定倍数的免疫原溶液中加入考马斯亮蓝染色,在相同波长处测量吸光度值,后与标准曲线比较,得制备的免疫原蛋白质浓度为3.11mg/mL。这些DMP人工免疫原既可以用于免疫动物,通过动物产生的免疫反应得到可以用来做免疫分析的单克隆或多克隆抗体,又可以作为免疫竞争对象而使用。
实施例10、动物免疫实验验证
选择2只成年健康雄性新西兰白兔,合成出的人工免疫原经过与弗氏完全佐剂充分混合后,对大白兔进行颈部和背部点状注射免疫,经过7次加强免疫后,采用间接酶联免疫分析法测定抗血清效价,其抗血清效价均已达到100000,具体效价变化见图5。试验显示交叉反应均不明显,说明其特异性较好。
实施例11、直接竞争免疫PCR方法检测邻苯二甲酸二甲酯
为了增强PCR管的吸附性,用0.8%的戊二醛对PCR管进行预处理,每孔加入20μL戊二醛溶液,37℃下温育5小时,然后用超纯水洗涤3次,甩干备用;用包被缓冲液(0.05MpH9.18碳酸盐缓冲液)将人工包被原稀释至适当浓度,加入到经过戊二醛处理的PCR管中进行包被,每孔20μL,4℃下包被过夜;倒掉包被原,每孔加入200μL洗涤液(0.01MpH7.40PBST)进行洗涤,振荡3分钟后甩干,洗三遍后加入200μL封闭液(含3%卵清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液),37℃下温育1小时;洗板三次,将生物素化抗DMP多克隆抗体稀释至适当浓度,每孔加入10μL生物素化抗体及10μLDMP小分子,空白对照孔中加入20μLPBS,37℃下温育30分钟;洗板三次并甩干,用0.01MpH7.40PBS将亲和素稀释至适当倍数,每孔加入20μL,37℃下温育30分钟;洗板三次并甩干,用0.01MpH7.40PBS将生物素化DNA稀释至适当倍数,每孔加入20μL,37℃下温育30分钟;倒掉溶液后用洗脱液重复洗涤五次,再用超纯水重复洗涤五次;最后加入扩增引物和荧光物质,采用20μL的扩增体系,每孔加入10μLPCR试剂盒mixture,上下游引物各加入0.25μL,超纯水9.5μL;在加入PCR扩增试剂时,在荧光PCR反应仪中进行扩增(PCR扩增程序:94℃预变性4min;94℃20s,55℃20s,72℃20s,以此进行30个循环;72℃延伸3min)。测定的Ct值与待测抗原的量成反比。根据加入已知浓度的抗原和相应的Ct值作标准曲线,从而可以得到相应待测样品中邻苯二甲酸二甲酯的浓度。其测定的扩增曲线与建立的标准曲线如图6和图7所示。
实验所用到的生物素化DNA(双链DNA详情如下:5’-Bio-GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT-3’和5’-Bio-AAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC-3’)以及相对应的上游引物(5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’)和下游引物(5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’)均由生工生物工程(上海)股份有限公司制备合成。
当DMP浓度在10pg/L-100ng/L时线性相关性较好,线性方程为Ct=0.33LgCDMP+13.00(R2=0.9846,n=5),检测下限为5.12pg/L。与传统仪器分析方法相比,灵敏度提高了10000-50000倍。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是,本发明并不局限于上述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改,这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种邻苯二甲酸二甲酯的人工免疫原DMP-BSA,其特征在于,结构式如式(I)所示:
2.一种如权利要求1所述的邻苯二甲酸二甲酯的人工免疫原DMP-BSA的制备方法,其特征在于,所述方法包括采用重氮化法将DMP半抗原与牛血清蛋白BSA偶联制备人工免疫原DMP-BSA。
3.如权利要求2所述的邻苯二甲酸二甲酯的人工免疫原DMP-BSA的制备方法,其特征在于,所述方法具体包括如下步骤:
S1、将所述DMP半抗原溶于呈强酸性的水溶液中,形成DMP半抗原溶液;
S2、向所述DMP半抗原溶液中滴加亚硝酸钠溶液,控制pH为2.0~3.0,反应结束后去除未反应的亚硝酸钠,生成重氮盐溶液;
S3、将牛血清蛋白BSA溶于0.01~0.05MpH9.18硼酸钠缓冲液中,形成牛血清蛋白溶液;
S4、在所述重氮盐溶液中滴加所述牛血清蛋白溶液,发生偶联反应,即得所述人工免疫原DMP-BSA。
4.如权利要求3所述的邻苯二甲酸二甲酯的人工免疫原DMP-BSA的制备方法,其特征在于,所述DMP半抗原、强酸、亚硝酸钠、牛血清蛋白BSA的摩尔比为1:3~4:8~10:0.001~0.005;所述强酸为强酸性的水溶液中的强酸。
5.如权利要求3所述的邻苯二甲酸二甲酯的人工免疫原DMP-BSA的制备方法,其特征在于,步骤S1中,所述强酸性的水溶液中的强酸选自浓盐酸、浓硫酸或浓硝酸。
6.如权利要求3所述的邻苯二甲酸二甲酯的人工免疫原DMP-BSA的制备方法,其特征在于,步骤S1中,所述去除未反应的亚硝酸钠是加入尿素以去除未反应的亚硝酸钠,所述尿素与DMP半抗原的摩尔比为300~350:1。
7.如权利要求3所述的邻苯二甲酸二甲酯的人工免疫原DMP-BSA的制备方法,其特征在于,步骤S4中,所述偶联反应是在0~4℃、搅拌的条件下进行,所述搅拌时间为2~3小时。
8.如权利要求3所述的邻苯二甲酸二甲酯的人工免疫原DMP-BSA的制备方法,其特征在于,所述步骤S4还包括偶联反应结束后,离心分离,将上清液装入透析袋中透析,离心分离沉淀即得所述人工免疫原DMP-BSA的步骤。
9.如权利要求2或3所述的邻苯二甲酸二甲酯的人工免疫原DMP-BSA的制备方法,其特征在于,所述DMP半抗原是由包括如下步骤的方法制备而得:
4-硝基邻苯二甲酸与甲醇在浓盐酸或浓硫酸的催化下回流反应,生成4-硝基邻苯二甲酸二甲酯;
以苯或甲苯为溶剂,所述4-硝基邻苯二甲酸二甲酯和锌粉、浓盐酸或浓硫酸发生还原反应,生成所述DMP半抗原。
10.一种如权利要求1所述的邻苯二甲酸二甲酯的人工免疫原DMP-BSA在用于痕量塑化剂邻苯二甲酸二甲酯检测中的用途,其特征在于,所述检测采用免疫检测法。
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