CN105176998A - 一种rna及其用途、包含该rna的组合物、重组表达载体和宿主细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种RNA及其用途、包含该RNA的组合物、重组表达载体和宿主细胞。该RNA能有效抑制Hsa-miR-221的表达水平，增强TRAIL对肿瘤的杀伤活性。本发明提供的重组病毒是有生物学活性的，有希望成为肿瘤基因治疗的候选病毒。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种RNA及其用途、包含该RNA的组合物、重组表达载体和宿主细胞。
背景技术
肿瘤是威胁人类健康的头号杀手之一，并且目前并没有十分有效的手段来治疗肿瘤。传统的治疗方法，如化疗、放疗、手术和靶向药物，尽管最初能成功控制住肿瘤，但往往又会反过来诱导宿主细胞产生一系列其他的行为，进而最终导致肿瘤的复发、扩散和转移。基因治疗由于其针对性强、靶向性好、有效和基本无毒副作用等优点，这些年正在越来越受到人们的青睐和关注。TRAIL(tumornecrosisfactor-relatedapoptosisinducingligand)属于肿瘤坏死因子(TNF)家族成员，因其可以选择性地杀死肿瘤细胞，但对绝大多数正常组织没有毒性而成为癌症基因治疗的研究热点之一。研究表明静脉多次注射重组可溶性TRAIL可诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤的生长和形成，延长实验动物的生存时间的同时却不引起可监测到的毒性发生。尽管它可以诱导多种肿瘤细胞凋亡，但不同的肿瘤细胞对TRAIL的敏感性不同，因此增强抗性细胞对TRAIL的敏感性具有良好的临床应用前景。
目前研究表明，TRAIL抗性的机制在不同细胞中是不同的，有诸如假受体占位、细胞内部抗凋亡分子的高表达等假说，但是有些假说验证困难，且目前并没有十分有效的方法来改善TRAIL抗性问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种RNA及其用途、包含该RNA的组合物、重组表达载体和宿主细胞。该RNA能有效抑制miR-221的表达水平，增强TRAIL对HepG2的杀伤活性。本发明提供的重组病毒是有生物学活性的，有希望成为肿瘤基因治疗的候选病毒。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种RNA，其特征在于，其具有：
(Ⅰ)、如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；或
(Ⅱ)、如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列的互补序列；或
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的序列；或
(Ⅳ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)所述序列至少有70％同源性的序列。
本发明还提供了所述RNA用于抑制Hsa-miR-221的用途。
本发明还提供了一种组合物，包括TRAIL95-281和所述的RNA。
本发明还提供了所述组合物的制备方法：
步骤1：将编码TRAIL95-281与所述RNA的核苷酸序列连接到载体中，构建表达载体；
步骤2：将所述表达载体转化宿主细胞，表达，收集表达产物，即得。
本发明还提供了一种重组表达载体，包括：
(1)编码TRAIL95-281的核苷酸序列；和/或
(2)编码本发明所述RNA的核苷酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述重组表达载体的构建方法，将编码TRAIL95-281与所述RNA的核苷酸序列连接到载体中，构建表达载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述重组表达载体的构建方法中的载体为质粒或病毒。
在本发明的一些具体实施方案中，所述重组表达载体的构建方法中病毒为腺相关病毒。
本发明还提供了一种宿主细胞，包括所述的重组表达载体。
所述重组表达载体的结构为pAM-CAG-pL-INS-TRAIL95-281-polyA-U6-miR-221-zip-WPRE-BGHpolyA的AAV重组表达载体,简称AAV-TRAIL-miR-221-zip。
所述重组表达载体包括:pAM(theabbreviationoftheplasmidofanti-ampcilinconstruction)、ITR(adeno-associatedvirus2invertedterminalrepeatsequence)、CAG(cytomegalovirusimmediated-earlyenhancer/chickenβ-actinhybrid)、INS(humanInsulin)secretionsignalpeptide、pL(poly-linker)、TRAIL95-281(编码TRAIL第95至281位氨基酸)、polyA(多聚腺苷酸)、U6、miR-221-zip、WPRE(WoodchuckHeptitisVirusPosttranscriptionalRegulatoryElement)、BGH(Bostaurusgrowthhormone)、polyA(多聚腺苷酸)和ITR(adeno-associatedvirus2invertedterminalrepeatsequence)。
其中，ITRsequence(PatentWO0220748)的序列如SEQIDNo.5所示；CAGsequence的序列如SEQIDNo.6所示；INSsecretionsignalpeptidesequence(Genbankaccessionno.NM000207)的序列如SEQIDNo.7所示；WPREsepuence(Genbankaccessionno.J04514)的序列如SEQIDNo.8所示；BGH(Bostaurusgrowthhormone)pAsequence的序列如SEQIDNo.9所示；TRAIL95-281aminoacidsequence(PatentZL03138357.2)的序列如SEQIDNo.10所示。在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主细胞为细胞株，所述细胞株选自HeLa细胞、A549细胞、Bel-7402细胞、CNE-2Z细胞、EC109细胞、MGC-803细胞、SW1990细胞、DU145细胞、U251细胞、A875细胞、HCT116细胞、MCF7细胞或SK-OV-3细胞。
本发明还提供了所述组合物、所述重组表达载体、所述宿主细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述肿瘤为原发性、继发性或转移性的肿瘤。
在本发明的一些具体实施方案中，所述肿瘤包括肺癌、肝癌、鼻咽癌、食管癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌或卵巢癌。
本发明的实验证明，在HeLa细胞、A549细胞、Bel-7402细胞、CNE-2Z细胞、EC109细胞、MGC-803细胞、SW1990细胞、DU145细胞、U251细胞、A875细胞、HCT116细胞、MCF7细胞、SK-OV-3细胞中转染了Hsa-miR-221的mimics以后能增强细胞对TRAIL的抗性，而转染了Hsa-miR-221的inhibitor以后能增强细胞对TRAIL的敏感性(图1)。人工设计的miR-221特异性抑制剂miR-Zip(图2A)，并在原有pAM/CAG-TRAIL载体基础上加入polyA以终止II类启动子CAG，然后插入一个新的III类启动子U6来表达miR-221-zip(图2B)。将共表达质粒转入HepG2中，用AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒流式检测细胞凋亡，可以看到，miR-221-zip能增强TRAIL对HepG2的杀伤活性(图2C)。
采用辅助病毒缺陷包装系统进行该重组共表达载体的包装，病毒用碘克沙醇密度梯度超速离心纯化，超滤浓缩，Real-timePCR确定其最终滴度。同样方法制备和包装编码绿色荧光蛋白(EGFP)的AAV重组病毒(AAV-EGFP)作为阴性对照，只编码TRAIL蛋白的AAV-TRAIL作为阳性对照。将AAV-EGFP病毒侵染293细胞和A549细胞72h后，观察细胞的荧光表达情况，可以看到细胞被成功侵染并表达了绿色荧光蛋白(图3)。在HepG2裸鼠体内移植瘤实验中，由于HepG2本身对TRAIL并不敏感，经AAV-TRAIL治疗后，肿瘤大小没有明显改变，但在AAV-TRAIL+miR-221-zip联合治疗组可以看到明显的生长抑制(图4)，并且miR-221-zip是通过靶向抑制miR-221间接促进其靶基因p27Kip1来发挥作用(图5)，表明得到的重组病毒是有生物学活性的，有希望成为肿瘤基因治疗的候选病毒。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示miR-221对TRAIL抗性的影响；转染了miR-221的mimics和inhibitors以后，再用TRAIL蛋白刺激人宫颈癌细胞Hela、人肺腺癌细胞A549、人肝癌细胞Bel-7402、人鼻咽癌细胞CNE-2Z、人食管癌细胞EC109、人胃癌细胞MGC-803、人胰腺癌细胞SW1990、人前列腺癌细胞DU145、人神经胶质瘤细胞U251、人黑色素瘤细胞A875、人乳腺癌细胞MCF7、人结直肠癌细胞HCT116、人卵巢癌细胞SK-OV-3对细胞的杀伤作用；
图2示pAM/CAG-TRAIL-U6-miR-221-zip共表达质粒的构建及功能验证；图2(A)：miR-221-zip的序列设计；图2(B)：pAM/CAG-TRAIL-polyA-U6-miR-221-zip共表达载体的表达结构；图2(C)：流式检测共表达质粒转染HepG2细胞后对细胞凋亡的影响；
图3示重组病毒的生物学活性，图3AAV-EGFP可以成功侵染293细胞和A549细胞并使其表达绿色荧光蛋白；
图4示HepG2荷瘤小鼠经重组AAV-TRAIL和AAV-TRAIL+miR-221-zip处理后，AAV-TRAIL+miR-221-zip能明显抑制肿瘤生长；其中图4(A)示皮下瘤受抑制的形态学观察；图4(B)示给药后瘤体积变化的动态观察；图4(C)示处死时瘤重的差异；
图5示miR-221-zip通过调节靶基因p27Kip1的变化水平发挥作用；其中图5(A)p27Kip1是miR-221靶基因；图5(B)示miR-221-zip在体内可以上调p27Kip1表达水平。
具体实施方式
本发明公开了一种RNA及其用途、包含该RNA的组合物、重组表达载体和宿主细胞，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的第一个目的在于提供Hsa-miR-221在不同细胞系中对TRAIL抗性的影响。
所述不同细胞系为HeLa细胞、A549细胞、Bel-7402细胞、CNE-2Z细胞、EC109细胞、MGC-803细胞、SW1990细胞、DU145细胞、U251细胞、A875细胞、HCT116细胞、MCF7细胞、SK-OV-3细胞。
本发明的第二个目的在于提供一种载体，所述载体表达TRAIL95-281(编码TRAIL第95至281位氨基酸)蛋白。
本发明的第三个目的在于设计Hsa-miR-221特异性抑制剂miRZip，其序列如SEQIDNO.1所示。
所述特异性抑制剂miRZip以反竞争性结合自身miRNA方式靶向抑制其功能。
本发明的第四个目的在于提供一种分泌型的可溶性人TRAIL95-281和miR-221的抑制剂miRZip共表达载体的制备方法，此表达载体的结构为pAM-CAG-pL-INS-TRAIL95-281-polyA-U6-miR-221-zip-WPRE-BGHpolyA的AAV重组表达载体,简称AAV-TRAIL-miR-221-zip。
所述载体包括:pAM(theabbreviationoftheplasmidofanti-ampcilinconstruction)、ITR(adeno-associatedvirus2invertedterminalrepeatsequence)、CAG(cytomegalovirusimmediated-earlyenhancer/chickenβ-actinhybrid)、INS(humanInsulin)secretionsignalpeptide、pL(poly-linker)、TRAIL95-281(编码TRAIL第95至281位氨基酸)、polyA(多聚腺苷酸)、U6、miR-221-zip、WPRE(WoodchuckHeptitisVirusPosttranscriptionalRegulatoryElement)、BGH(Bostaurusgrowthhormone)、polyA(多聚腺苷酸)和ITR(adeno-associatedvirus2invertedterminalrepeatsequence)。
其中，ITRsequence(PatentWO0220748)的序列如SEQIDNo.5所示；CAGsequence的序列如SEQIDNo.6所示；INSsecretionsignalpeptidesequence(Genbankaccessionno.NM000207)的序列如SEQIDNo.7所示；WPREsepuence(Genbankaccessionno.J04514)的序列如SEQIDNo.8所示；BGH(Bostaurusgrowthhormone)pAsequence的序列如SEQIDNo.9所示；TRAIL95-281aminoacidsequence(PatentZL03138357.2)的序列如SEQIDNo.10所示。
所述载体为质粒或病毒，所述病毒为腺相关病毒。
本发明的第五个目的在于提供一种组合物，包括TRAIL95-281和抑制Hsa-miR-221的RNA。
所述组合物中，所述抑制Hsa-miR-221的RNA为miRZip，其DNA序列如SEQIDNO.2所示。
本发明的第六个目的在于提供上述任一项的载体、组合物或细胞株在治疗癌症或肿瘤中的用途。
所述癌症或肿瘤为原发性、继发性或转移性的肿瘤。
所述的用途中，所述肿瘤包括宫颈癌、肺癌、肝癌、鼻咽癌、食管癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌。
在本发明中，采用基因工程等现代生物学技术和方法，提供了编码人TRAIL95-281和miR-221-zip重组AAV共表达载体和病毒的制备、包装、及其应用。
本发明提供了RNA及其用途、包含该RNA的组合物、重组表达载体和宿主细胞。其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到；如无特殊说明，实施例中涉及的具体操作参见《分子克隆实验指南第三版》。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1miR-221对TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡活性的影响采用CCK-8法检测
分别取2×105的HeLa细胞、A549细胞、Bel-7402细胞、CNE-2Z细胞、EC109细胞、MGC-803细胞、SW1990细胞、DU145细胞、U251细胞、A875细胞、HCT116细胞、MCF7细胞、SK-OV-3细胞(体积为2ml)接种到6孔板中，分别转染由Invitrogen公司人工合成的模拟物对照、miR-221模拟物、抑制剂对照、miR-221抑制剂48h以后，将细胞消化下来接种于96孔板中，每孔8000个细胞，加入TRAIL蛋白至终浓度100ng/ml，刺激24h，去掉培养基，每孔加入110μl含CCK-8的培养基(100μl培养基加10μlCCK-8)，37℃温育，每隔一小时于MD/SPECTRAMAX340分光光度仪上读取450nm处光吸收值，计算细胞成活率(细胞成活率＝实验组光吸收值/对照组光吸收值×100％)。每一组设定五个样品孔，每组实验重复三次。
miR-221过表达能够引起细胞对TRAIL的抗性，具体见图1(A)～图1(C)。
图1示miR-221对TRAIL抗性的影响；转染了miR-221的模拟物和抑制剂以后，再用TRAIL蛋白刺激人宫颈癌细胞Hela、人肺腺癌细胞A549、人肝癌细胞Bel-7402、人鼻咽癌细胞CNE-2Z、人食管癌细胞EC109、人胃癌细胞MGC-803、人胰腺癌细胞SW1990、人前列腺癌细胞DU145、人神经胶质瘤细胞U251、人黑色素瘤细胞A875、人乳腺癌细胞MCF7、人结直肠癌细胞HCT116、人卵巢癌细胞SK-OV-3对细胞的杀伤作用。
实施例2pAM/CAG-TRAIL-polyA-U6-miR-221-zip共表达质粒的构建
将U6启动子(如SEQIDNo.3所示)用PCR扩出来以后用Taq酶加a，切胶回收，连入到T载体中。同时人工合成polyA尾序列GGCCGCAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTT(如SEQIDNo.4所示)，退火，用EcoRV单酶切连入了U6启动子的T载体(EcoRV酶切位点在U6启动子的上游)，将polyA序列以平端方式连入T载体中，得到polyA和U6启动子串联的序列。人工合成miR-221-zip序列，并在上游加上SpeI酶切位点黏末端，在下游加上HindIII酶切位点和SacI酶切位点黏末端，同时用SpeI和SacI双酶切连有polyA和U6的T载体(SpeI和SacI在U6的下游)，将miR-221-zip序列连入其中，得到polyA-U6-miR-221-zip串联的序列。这样一来，在polyA上游的T载体上有一个原本存在的HindIII酶切位点，而在miR-221-zip的下游，有一个引入的HindIII酶切位点，用HindIII单酶切该重组T载体，切胶纯化得到我们的目的序列，同时HindIII单酶切已预先存在的pAM/CAG-TRAIL的rAAV2包装载体(HindIII酶切位点在TRAIL的下游)，将两部分用T4连接酶连接在一起，测序鉴定正反向，得到目的重组质粒。
经验证功能，TRAIL和miR-221-zip联合应用的治疗效果很好，因而采用辅助病毒缺陷包装系统进行该重组AAV-TRAIL-miR-221-zip载体的包装，病毒分别采用碘克沙醇密度梯度超速离心纯化，超滤浓缩，Real-timePCR确定其最终滴度。
pAM/CAG-TRAIL-U6-miR-221-zip共表达质粒的构建及功能验证结果：
(1)miR-221-zip序列设计，见图2(A)；
(2)pAM/CAG-TRAIL-polyA-U6-miR-221-zip共表达载体的表达结构，见图2(B)；
(3)流式检测共表达质粒转染HepG2细胞后对细胞凋亡的影响，见图2(C)。
实施例3重组AAV-TRAIL+miR-221-zip及其生物学活性测定
人胚肾细胞HEK293T在DMEM完全培养基(DMEM培养基添加10％的胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中培养6h以上，1×PBS洗涤后加入2×109Gps实施例2制备的重组病毒(培养基为DMEM未添加胎牛血清，剂量为1×104Gps/细胞)，2-4小时后添加DMEM完全培养基继续培养。在转导带绿色荧光蛋白的重组病毒AAV-EGFP后观察荧光表达情况。
重组AAV病毒的生物学活性检测结果：
AAV-EGFP侵染293T和A549细胞后荧光表达情况，见图3。
实施例4WesternBlot
分别注射了AAV-EGFP、AAV-TRAIL、AAV-TRAIL+miR-221-zip的肿瘤组织或细胞经裂解液(含1％NonidetP-40、0.35mg/mlPMSF、9.5μg/mlleupeptin和13.7μg/mlpepstatinA的1×PBS)裂解后，12000rpm离心去沉淀，上清液经BCA蛋白分析试剂盒(PierceChemicalCompany)测定蛋白浓度后进行SDS-PAGE凝胶电泳，转移至PVDF膜后4℃封闭过夜，经一抗(抗p27Kip1多克隆抗体，1:1000稀释于封闭液中，室温2h)、二抗(HRP标记的羊抗兔抗体1:10000稀释于封闭液中，室温1h)孵育后，彻底洗涤，然后利用ECL系统(AmershamPharmaciaBiotechCo.)进行蛋白显色。检测p27Kip1在肿瘤内表达情况，可以看到在AAV-TRAIL+miR-221-zip组p27Kip1表达上调。
miR-221-zip通过调节靶基因p27Kip1的变化水平发挥作用结果：
(A)p27Kip1是miR-221的预测靶基因，见图5(A)；
(B)注射AAV-TRAIL+miR-221-zip组的肿瘤组织内p27Kip1表达水平上调，见图5(B)。
实施例5AnnexinV-FITC/PI双染法流式测定细胞凋亡
按照细胞凋亡试剂盒(BD-FITCAnnexinVApoptosisDetectionKitI)说明书进行。HepG2细胞经0.25％EDTA消化处理后，离心，用冰的PBS洗两次，用1×BindingBuffer重悬为1×106cells/ml，取100μl细胞悬液(1×105cells)，加入5μlFITCAnnexinV和5μlPI，轻柔混匀，室温避光孵育15分钟。加入400μl1×BindingBuffer，1小时内用流式细胞仪检测。
双染法流式测定细胞凋亡结果：
转染单独表达TRAIL的质粒并不能引起HepG2细胞凋亡，而转染了TRAIL与miR-221-zip的共表达质粒后，HepG2的凋亡明显升高，见图2(D)。
实施例6小鼠动物模型的建立
取5至6周龄、体重约20g的Balb/c裸鼠，皮下接种2×106人肺癌细胞HepG2，每三或四天测量一次肿瘤的长短径，计算瘤体积(体积＝1/2×长径×短径2)。实验结束时断颈处死裸鼠，肿瘤或各组织样品称重后经液氮冷冻后贮存在-70℃或在4％paraformaldehyde固定。
实施例7荷瘤小鼠的实验治疗与观察
取5至6周龄、体重约20g的Balb/c裸鼠，皮下接种2×106人肺癌细胞HepG2，(1×PBS悬液100μl)，即实施例6简历的小鼠动物模型。肿瘤长至100mm3时，将实验动物分成三组：a)AAV-EGFP阴性对照组；b)AAV-TRAIL阳性对照组；c)AAV-TRAIL+miR-221-zip重组病毒(病毒滴度1011)治疗组。每组5只，通过瘤内多点注射。每周观察不同组动物肿瘤的生长情况和生存时间。做3批重复实验。
HepG2荷瘤小鼠经重组AAV-TRAIL和AAV-TRAIL+miR-221-zip处理后，皮下瘤的生长受到抑制，并且AAV-TRAIL+miR-221-zip能明显抑制肿瘤生长：
(A)皮下瘤受抑制的形态学观察，见图4(A)；
(B)给药后瘤体积变化的动态观察，见图4(B)；
(C)处死时瘤重的差异，见图4(C)。
不同肿瘤细胞对TRAIL的敏感性是不同的，有一些细胞对TRAIL是敏感的，在受到TRAIL刺激后能够诱发细胞凋亡，而另一些细胞对TRAIL是有抗性的，受到TRAIL刺激后并不能引起细胞凋亡，称为组成性耐受(congenitalresistance)。而那些本来对TRAIL敏感的细胞，在经过TRAIL处理一段时间之后，对TRAIL的敏感性也可能会下降，称为获得性耐受(acquiredresistance)。这其中的耐受机制是复杂多样的，和受体的表达水平、分布、功能状态、重分布、细胞内抗凋亡分子表达水平等多种因素有关。
HepG2就属于对TRAIL有组成性耐受的细胞，在用高剂量的TRAIL处理以后，细胞是不发生凋亡的，因此TRAIL可能无法单独用于HepG2这种肿瘤的治疗。由上一个专利可知，在对TRAIL敏感的细胞A549中，TRAIL和miR-222-TuD的联用可以明显增强TRAIL单独使用的治疗效果，那么在组成性耐受中，是否还能发挥作用呢？在实验结果1中可以看到，miR-221在多种细胞系中都可以对TRAIL的抗性产生影响，而且过表达以后能减少细胞的凋亡，即对TRAIL抗性增加，抑制miR-221以后，可以增加细胞的凋亡，即降低对TRAIL的抗性。在将对照质粒、只表达TRAIL质粒、TRAIL+miR-221-zip共表达质粒转入HepG2细胞以后，可以看到和对照质粒相比，转了只表达TRAIL的质粒后细胞的凋亡率几乎没有改变，符合HepG2组成性耐受的特征，但是在TRAIL+miR-221-zip共表达质粒组，细胞凋亡发生了明显了增强。在将其进行了病毒包装以后，在细胞系水平，能表现出相应的功能，在动物实验水平，注射了AAV-TRAIL组的肿瘤和注射了AAV-EGFP对照组的肿瘤相比，没有明显差异，可是在AAV-TRAIL+miR-221-zip联合治疗组，肿瘤生长受到了明显的抑制，表现出良好的功能。
既然miR-221-zip能在这个过程中发挥功能，对hsa-miR-221的靶基因进行了预测，发现有多个可能的选择，并且在不同的肿瘤细胞中靶基因也可能是不同的。在体系中对多个靶基因进行了验证，最后发现，p27Kip1上有两个miR-221的结合位点，并真实参与了miR-221-zip调节TRAIL抗性的过程。将各个组的肿瘤组织取出来以后提取蛋白，进行Westernblot验证，发现p27Kip1在AAV-TRAIL+miR-221-zip联合治疗组的体内水平是明显上调的，因为miRNA是通过靶向序列结合来抑制靶基因的，而miR-221-zip是miR-221的特异性抑制剂，因此在AAV-TRAIL+miR-221-zip组检测到其靶基因的上调，又和结果相一致。总之，AAV-TRAIL+miR-221-zip的联合应用，可以通过上调p27Kip1来增强组成性耐受细胞HepG2对TRAIL的敏感性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (12)
1.一种RNA，其特征在于，其具有：
(Ⅰ)、如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；或
(Ⅱ)、如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列的互补序列；或
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的序列；或
(Ⅳ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)所述序列至少有70％同源性的序列。
2.根据权利要求1所述的RNA用于抑制Hsa-miR-221的用途。
3.一种组合物，其特征在于，包括TRAIL95-281和如权利要求1所述的RNA。
4.一种重组表达载体，其特征在于，包括：
(1)编码TRAIL95-281的核苷酸序列；和/或
(2)编码如权利要求1所述的RNA的DNA。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，将编码TRAIL95-281的核苷酸序列与编码如权利要求1所述的RNA的DNA连接到载体中，构建表达载体。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述载体为质粒或病毒。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述病毒为腺相关病毒。
8.一种宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求4所述的重组表达载体。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为细胞株，所述细胞株选自HeLa细胞、A549细胞、Bel-7402细胞、CNE-2Z细胞、EC109细胞、MGC-803细胞、SW1990细胞、DU145细胞、U251细胞、A875细胞、HCT116细胞、MCF7细胞或SK-OV-3细胞。
10.根据权利要求3所述的组合物、权利要求5所述的重组表达载体、权利要求8或9所述的宿主细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为原发性、继发性或转移性的肿瘤。
12.根据权利要求10或11所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括肺癌、肝癌、鼻咽癌、食管癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌或卵巢癌。
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| CN201510382700.6A CN105176998A (zh) | 2015-07-02 | 2015-07-02 | 一种rna及其用途、包含该rna的组合物、重组表达载体和宿主细胞 |
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Cited By (1)
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| WO2010056737A3 (en) * | 2008-11-11 | 2010-09-16 | Mirna Therapeutics, Inc. | Methods and compositions involving mirnas in cancer stem cells |
| CN102803511A (zh) * | 2009-11-23 | 2012-11-28 | 俄亥俄州立大学 | 用于影响肿瘤细胞生长、迁移和侵袭的材料和方法 |
-
2015
- 2015-07-02 CN CN201510382700.6A patent/CN105176998A/zh active Pending
Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| WO2010056737A3 (en) * | 2008-11-11 | 2010-09-16 | Mirna Therapeutics, Inc. | Methods and compositions involving mirnas in cancer stem cells |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN110982789B (zh) * | 2019-12-13 | 2022-03-25 | 山东大学齐鲁医院 | miRNA在调控胶质瘤干细胞前神经元型-间充质型转化中的应用 |
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