CN105176921A - 穗花杉双黄酮在制备骨组织工程种子细胞中的试验方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种穗花杉双黄酮(AME)在制备骨组织工程种子细胞中的试验方法，首先对骨髓基质干细胞(Mesenchymal？stem？cells,MSCs)进行培养，分别加入成骨诱导液(OIM)或含不同浓度穗花杉双黄酮的成骨诱导液，然后采用MTT法检测细胞的增殖；细胞完全融合后加入成骨诱导液或含不同浓度穗花杉双黄酮的成骨诱导液进行培养，再加入细胞裂解液，采用试剂盒检测碱性磷酸酶活性，Bio-Rad法测定蛋白浓度；对细胞进行碱性磷酸酶染色，并在显微镜下观察拍照；细胞完全融合后，每孔分别加入成骨诱导液或含不同浓度穗花杉双黄酮的成骨诱导液，采用骨钙素检测试剂盒进行骨钙素水平测定。

Description

穗花杉双黄酮在制备骨组织工程种子细胞中的试验方法

技术领域

本发明涉及骨组织细胞培养领域，具体是一种穗花杉双黄酮在制备骨组织工程种子细胞中的试验方法。

背景技术

感染、肿瘤或创伤所致的骨缺损是临床常见的病症。临床上常用的修复骨缺损的方法有骨移植和人工骨等，但都存在一定的缺陷，难以满足临床需要。骨组织工程为骨缺损修复提供了较好的前景。骨组织工程必须要有合适的种子细胞和支架材料。骨组织工程的种子细胞应满足以下要求：取材方便，来源充足，对机体损伤小；具有成骨潜能；易于体外大量扩增和良好的生物相容性。MSCs作为骨组织工程种子细胞已经广泛应用，但是如何定向诱导MSCs成骨分化是解决骨组织工程中种子细胞的一个重要前提。

骨组织工程是指将种子细胞经体外培养扩增后，种植于一种具有优良细胞相容性并可被机体降解吸收的生物材料上，在生物材料逐渐被机体降解吸收的同时，细胞不断增殖、分化，达到修复骨组织缺损的目的。种子细胞是骨组织工程中最重要的环节之一。如何获得适合临床应用需要的种子细胞是目前研究的热点之一。

骨髓基质干细胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)是近年来发现的一种易于扩增、具有多种分化潜能的细胞，在不同诱导条件下，能够向成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞及基质细胞等不同的细胞系分化。MSCs来源方便，取材相对简单，对患者造成的损伤较小。此外，采用自体间充质干细胞可以避免产生免疫反应。因此，MSCs作为骨组织工程种子细胞已经广泛应用，但是如何获取数量充足、功能良好并向成骨细胞定向分化的种子细胞是目前制约骨组织工程的瓶颈之一。

穗花杉双黄酮在很多种中草药如甘草，银杏叶，贯叶连翘，卷柏中均存在。现代药理研究表明穗花杉双黄酮具有抗肿瘤，抗病毒，抑菌抗炎，抗氧化和舒张血管等多种药理活性。但穗花杉双黄酮是否能促进MSCs成骨分化，国内外均未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种穗花杉双黄酮在制备骨组织工程种子细胞中的试验方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种穗花杉双黄酮在制备骨组织工程种子细胞中的试验方法，具体实验试验步骤如下：

(1)MSCs细胞培养

将MSCs置于含8～12％胎牛血清的α-MEM培养液，37℃、5％CO₂孵箱内培养，每2～3d换液1次，细胞达80％融合时，0.25％胰蛋白酶消化传代培养；

(2)细胞增殖检测

MSCs细胞接种于96孔培养板，细胞增殖检测采用MTT法；各实验组处理后，加入MTT使其终浓度为0.45～0.55mg/mL，37℃培养箱内孵育4～5h，弃培养液，加入140～160μLDMSO使甲瓒颗粒完全溶解，酶标仪波长570nm测定吸光度值；

(3)碱性磷酸酶活性测定

细胞完全融合后，每孔分别加入成骨诱导液；成骨诱导液由内含0.01mmol·L^-1地塞米松、50μmol·L^-1维生素C和10mmol·L^-1β-磷酸甘油α-MEM完全培养基组成，或成骨诱导液为含不同浓度穗花杉双黄酮的成骨诱导液；隔天换液，6～8d后吸出各孔培养液，各孔加入45～55μL细胞裂解液，采用试剂盒检测碱性磷酸酶活性，Bio-Rad法测定蛋白浓度；

(4)碱性磷酸酶染色

PBS洗涤细胞表面两次，小心吸去PBS；每孔加入70％乙醇固定细胞8～12min，小心吸去乙醇，加入碱性磷酸酶缓冲液480～520μl平衡5min，重复两次；小心吸去碱性磷酸酶缓冲液，每孔加入280～320μLNBT/BCIP染色液，37℃下暗室里孵育25～35min；小心吸去染色液；加入0.8～1.2ml蒸馏水终止反应；显微镜下观察，拍照；

(5)骨钙素测定

细胞完全融合后，每孔分别加入成骨诱导液或含不同浓度穗花杉双黄酮的成骨诱导液，每3天更换一次培养液，12天后收集上清液，采用骨钙素检测试剂盒进行骨钙素水平测定。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明试验方法研究显示穗花杉双黄酮在5μmol·L^-1至50μmol·L^-1范围内可显著促进MSCs增殖；

2、本发明试验方法中穗花杉双黄酮可剂量依赖性地增加MSCs中碱性磷酸酶活性，穗花杉双黄酮对MSCs的早期成骨分化具有明显的促进作用；

3、本发明试验方法中穗花杉双黄酮显著提高细胞骨钙素的分泌，穗花杉双黄酮对MSCs的晚期成骨分化亦具有明显的促进作用。

因此，本发明试验方法的方案其在骨组织工程种子细胞制备中具有重要作用。

附图说明

图1为穗花杉双黄酮对MSCs碱性磷酸酶染色的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种穗花杉双黄酮在制备骨组织工程种子细胞中的试验方法，。

(1)MSCs培养

将MSCs置于含10％胎牛血清的α-MEM培养液，37℃、5％CO₂孵箱内培养，每2～3d换液1次，细胞达80％融合时，0.25％胰蛋白酶消化传代培养；

(2)细胞增殖检测

MSCs细胞接种于96孔培养板，细胞增殖检测采用MTT法；各实验组处理后，加入MTT使其终浓度为0.5mg/mL，37℃培养箱内孵育4h，弃培养液，加入150μLDMSO使甲瓒颗粒完全溶解，酶标仪波长570nm测定吸光度值；

(3)碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性测定

细胞完全融合后，每孔分别加入成骨诱导液(由内含0.01mmol·L^-1地塞米松、50μmol·L^-1维生素C和10mmol·L^-1β-磷酸甘油α-MEM完全培养基组成)或含不同浓度穗花杉双黄酮的成骨诱导液，隔天换液，7d后吸出各孔培养液，各孔加入50μL细胞裂解液；采用试剂盒检测ALP活性，Bio-Rad法测定蛋白浓度；

(4)碱性磷酸酶染色

PBS洗涤细胞表面两次，小心吸去PBS；每孔加入70％乙醇固定细胞10min，小心吸去乙醇，加入碱性磷酸酶缓冲液500μl平衡5min，重复两次。小心吸去碱性磷酸酶缓冲液，每孔加入300μlNBT/BCIP染色液，37℃下暗室里孵育30min；小心吸去染色液；加入1ml蒸馏水终止反应。显微镜下观察，拍照。

(5)骨钙素测定

细胞完全融合后，每孔分别加入成骨诱导液或含不同浓度穗花杉双黄酮的成骨诱导液，每3天更换一次培养液，12天后收集上清液，采用骨钙素检测试剂盒进行骨钙素水平测定。

统计学处理：数据以表示，采用专用的软件进行统计学分析，数据分析采用单因素方差检验，P<0.05为差异有统计学意义。

实验结果

(1)穗花杉双黄酮对MSCs增殖的影响

穗花杉双黄酮在0.1μmol·L^-1～1μmol·L^-1对MSCs增殖无显著影响，5μmol·L^-1～50μmol·L^-1穗花杉双黄酮可促进MSCs增殖，结果如表1，

表1穗花杉双黄酮对MSCs增殖的影响

^**P<0.01

(2)穗花双黄酮对MSCs碱性磷酸酶(ALP)活性的影响

与空白组比较，穗花双黄酮可浓度依赖性地增强MSCsALP活性，结果见表2，

表2穗花杉双黄酮对MSCs碱性磷酸酶的影响

^**P<0.01

(3)穗花杉双黄酮对MSCs碱性磷酸酶染色的影响

成骨诱导剂可使MSCs碱性磷酸酶染色显著加深，穗花杉双黄酮可进一步增强成骨诱导剂作用(p<0.01)；

结果见图1，为穗花杉双黄酮对MSCs碱性磷酸酶染色的影响(×10)

(4)穗花杉双黄酮对MSC分泌骨钙素的影响

与成骨诱导组比较，穗花杉双黄酮可显著促进MSCs分泌骨钙素(p<0.01)，结果见表3，

表3穗花杉双黄酮对MSCs分泌骨钙素的影响

本实验观察了穗花杉双黄酮对MSCs增殖的影响，研究显示穗花杉双黄酮在5μmol·L^-1至50μmol·L^-1范围内可显著促进MSCs增殖。在MSCs成骨过程中，其首先分化为前成骨细胞，再分化为成骨细胞，最后发生矿化。碱性磷酸酶为MSCs成骨分化的早期标志物，可分解焦磷酸为磷酸，后者为羟基磷灰石形成所必须的原料。因此，碱性磷酸酶在骨形成中起重要作用。本研究结果表明穗花杉双黄酮可剂量依赖性地增加MSCs中碱性磷酸酶活性，说明穗花杉双黄酮对MSCs的早期成骨分化具有明显的促进作用。

骨由有机质及无机质构成，有机质中主要为骨胶原纤维和非胶原蛋白。骨钙素是骨基质中的主要非胶原蛋白，主要由成熟成骨细胞分泌合成，为MSCs成骨分化的晚期标志物。本实验结果显示，穗花杉双黄酮显著提高了细胞骨钙素的分泌。说明穗花杉双黄酮对MSCs的晚期成骨分化亦具有明显的促进作用。

总之，穗花杉双黄酮可促进MSCs增殖，并可促进MSCs成骨分化。因此，其在骨组织工程种子细胞制备中将具有重要作用。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (1)

1.穗花杉双黄酮在制备骨组织工程种子细胞中的试验方法，其特征在于，具体实验试验步骤如下：

(1)MSCs细胞培养

将MSCs置于含8～12％胎牛血清的α-MEM培养液，37℃、5％CO₂孵箱内培养，每2～3d换液1次，细胞达80％融合时，0.25％胰蛋白酶消化传代培养；

(2)细胞增殖检测

MSCs细胞接种于96孔培养板，细胞增殖检测采用MTT法；各实验组处理后，加入MTT使其终浓度为0.45～0.55mg/mL，37℃培养箱内孵育4～5h，弃培养液，加入140～160μLDMSO使甲瓒颗粒完全溶解，酶标仪波长570nm测定吸光度值；

(3)碱性磷酸酶活性测定

细胞完全融合后，每孔分别加入成骨诱导液(OIM)；成骨诱导液由内含0.01mmol·L^-1地塞米松、50μmol·L^-1维生素C和10mmol·L^-1β-磷酸甘油α-MEM完全培养基组成，或成骨诱导液为含不同浓度穗花杉双黄酮的成骨诱导液；隔天换液，6～8d后吸出各孔培养液，各孔加入45～55μL细胞裂解液，采用试剂盒检测碱性磷酸酶活性，Bio-Rad法测定蛋白浓度；

(4)碱性磷酸酶染色

PBS洗涤细胞表面两次，小心吸去PBS；每孔加入70％乙醇固定细胞8～12min，小心吸去乙醇，加入碱性磷酸酶缓冲液480～520μl平衡5min，重复两次；小心吸去碱性磷酸酶缓冲液，每孔加入280～320μLNBT/BCIP染色液，37℃下暗室里孵育25～35min；小心吸去染色液；加入0.8～1.2ml蒸馏水终止反应；显微镜下观察，拍照；

(5)骨钙素测定

细胞完全融合后，每孔分别加入成骨诱导液或含不同浓度穗花杉双黄酮的成骨诱导液，每3天更换一次培养液，12天后收集上清液，采用骨钙素检测试剂盒进行骨钙素水平测定。