CN105175418A - 抑制细胞自噬的五环吲哚喹嗪、其合成、抗肿瘤活性和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抑制细胞自噬的五环吲哚喹嗪，即(6S)-3-乙酰基-6-(N-苯乙酰氨基酰基)-氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪，公开了它们的合成、活性及应用。

Description

抑制细胞自噬的五环吲哚喹嗪、其合成、抗肿瘤活性和应用

发明领域

本发明涉及抑制细胞自噬的五环吲哚喹嗪，即3-乙酰基-6-(N-苯乙酰氨基酰基)-氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪，涉及它们的合成，涉及它们的抗细胞增殖活性，进一步涉及它们在小鼠移植性肿瘤模型上的抗肿瘤活性及作为细胞自噬抑制剂的临床应用前景。

背景技术

自噬是细胞的重要功能。自噬中，细胞用双层膜包裹胞内的有害物质或无用物质，例如受损的细胞器或者变异的蛋白，形成自噬体。然后自噬体与溶酶体结合形成自噬溶酶体，降解里面的有害物质或无用物质。通过自噬细胞可以完成本身需要的代谢和更新细胞器，维持细胞稳态，保护细胞健康。因为整个过程在同一细胞中完成，所以称为自噬.。

当缺乏营养及缺氧时，细胞通过自噬降解细胞质成分，合成ATP，维持细胞正常生长所需。自噬对肿瘤生存具有重要作用。无节制增殖的肿瘤细胞通常处在营养不良状态，通过自噬降解细胞质成分，合成ATP，维持生长所需营养。这种机理，使得抑制肿瘤细胞自噬成为抗肿瘤药物设计的重要靶点。与肿瘤细胞不同，非肿瘤细胞不会因为无节制增殖而处在营养不良状态。于是，以肿瘤细胞自噬为靶点的抗肿瘤药物不伤及非肿瘤细胞。也就是说，以肿瘤细胞自噬为靶点的抗肿瘤药物不损伤正常组织，即不会有明显毒性。不过，至今没有肿瘤细胞自噬剂的成功案例。按照这些理解，发明人提出了五环吲哚喹嗪，即(6S)-3-乙酰基-6-(N-苯乙酰氨基酰基)-氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪，作为肿瘤细胞自噬抑制剂的发明。

发明内容

本发明的第一个内容是下式代表的化合物7a-f，

7a中AA为L-对甲氧苄基半胱氨酰基，7b中AA为L-单苄酯天冬氨酰基，7c中AA为L-单苄酯谷氨酰基，7d中AA为L-苄基-丝氨酰基，7e中AA为L-苯乙酰赖氨酰基，7f中AA为L-苄基-酪氨酰基。

本发明的第二个内容是按照图1的路线制备(6S)-3-乙酰基-6-(N-苯乙酰氨基酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(7a-f)，包括：

1)制备1-(2，2-二甲氧乙基)-3-羟甲基-1，2，3，4-四氢咔啉(3)；

2)制备(6S)-3-乙酰基-6-羟甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(6)；

3)制备(6S)-3-乙酰基-6-(N-苯乙酰氨基酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(7a-f)。7a中AA为L-对甲氧苄基半胱氨酰基，7b中中AA为L-单苄酯天冬氨酰基，7c中AA为L-单苄酯谷氨酰基，7d中AA为L-苄基-丝氨酰基，7e中AA为L-苯乙酰赖氨酰基，7f中AA为L-苄基-酪氨酰基。

本发明的第三个内容是评价3-乙酰基-6-(N-苯乙酰氨基酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(7a-f)的抗细胞增殖活性。

本发明的第四个内容是评价3-乙酰基-6-(N-苯乙酰氨基酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(7a-f)的抗肿瘤活性及在制备肿瘤疾病药物中的应用。

本发明的第五个内容是以其中一个化合物为代表评价3-乙酰基-6-(N-苯乙酰氨基酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(7a-f)通过抑制mTOR变构来诱导自噬从而抑制肿瘤细胞异常增殖的活性及作为制备诱导自噬剂的应用。

附图说明

图1.(6S)-3-乙酰基-6-(N-苯乙酰氨基酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(7a-f)的合成路线.(i)二氯亚砜/甲醇；(ii)1，1，3，3-四甲氧基丙烷，三氟乙酸/甲醇；(iii)LiAlH₄，THF；(iv)双乙烯酮，三乙胺/丙酮；(v)2NHCl/丙酮；(vi)K₂CO₃/甲醇；(vii)N-苯乙酰氨基酸，DCC/HOBt，NMM，THF。7a中AA为L-对甲氧苄基半胱氨酰基，7b中中AA为L-单苄酯天冬氨酰基，7c中AA为L-单苄酯谷氨酰基，7d中AA为L-苄基-丝氨酰基，7e中AA为L-苯乙酰赖氨酰基，7f中AA为L-苄基-酪氨酰基。

图2.A549细胞与生理盐水(阴性对照)，雷帕霉素(阳性对照)和7b孵育24小时后的激光共聚焦显微镜照片。A)与生理盐水孵育24小时后的A549细胞的激光共聚焦显微镜照片；B)与雷帕霉素孵育24小时后的A549细胞的激光共聚焦显微镜照片；C)与7b孵育24小时后的A549细胞的激光共聚焦显微镜照片。图中白色圆圈为自噬体。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备L-色氨酸甲酯盐酸盐(1)

50ml无水甲醇在冰浴下滴加3.75ml(50mmol)氯化亚砜，30min内滴加完毕后，分批加入9.20g(42mmol)L-色氨酸，室温搅拌24h，TLC(CHCl₃∶MeOH＝2∶3)监测至原料消失终止反应。水泵抽走未反应完的氯化亚砜SOCl₂和HCl，用乙醚反复研磨得白色固体，甲醇-乙醚重结晶，得L-色氨酸甲酯盐酸盐为无色固体。收率为99％。ESI-MS(m/e)219[M+H]⁺，熔点、旋光等物理常数与已报道的数据一致。

实施例2制备1-(2，2-二甲氧乙基)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉羧酸甲酯(2)

在250ml的圆底烧瓶中加入L-色氨酸甲酯盐酸盐20g(78.6mmol)，100ml甲醇，加入三氟乙酸20ml，活化半小时，再加入1，1，3，3-四甲氧基丙烷16ml(97.6mmol)，搅拌下升温到80℃，保温反应10小时，TLC监测原料斑点消失，将反应液降温至室温，滴加饱和NaHCO₃水溶液调节pH至中性，减压回收甲醇，残余物中加入100ml二氯甲烷，分液后水层用二氯甲烷萃取(50ml×3)，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，残余物用硅胶柱层析(石油醚∶丙酮＝2∶1)纯化得14.2g(57％)化合物2，为黄色油状物。ESI-MS(m/e)319[M+H]⁺。

实施例3制备1-(2，2-二甲氧乙基)-3-羟甲基-1，2，3，4-四氢咔啉(3)

在250ml的圆底烧瓶中加入50ml无水四氢呋喃，搅拌下分批加入LiAlH₄0.9g(23.6mmol)，活化半小时。将5g(15.7mmol)化合物(2)溶于50ml无水四氢呋喃中，再将其缓慢滴入反应瓶中，升温到40℃，保温反应3小时，TLC监测原料斑点消失。将反应液降温至室温，加入0.5ml15％的NaOH水溶液，卒灭反应，用布什漏斗过滤除去铝盐，滤液减压浓缩至干，加入乙酸乙酯，乙醚磨洗得到目2.52g(54％)合物3，为无色粉末。ESI-MS(m/e)291[M+H]⁺。

实施例4制备1-(2，2-二甲氧乙基)-2-(1，3-二羰基丁基)-3-(1，3-二羰基丁基)氧化甲基-1，2，3，4-四氢咔啉(4)

在100ml的圆底烧瓶中加入1.0g(3.8mmol)化合物(3)，再加入20ml丙酮搅拌溶解，在冰浴下加入双乙烯酮1ml(11.9mmol)，三乙胺0.4ml。反应液室温搅拌24小时，TLC监测原料斑点消失，加入0.2ml水卒灭未反应的双乙烯酮，减压回收溶剂。残余物中加入50ml二氯甲烷和50ml饱和NaCl水溶液，分液后水层用二氯甲烷萃取(30ml×3)，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，残余物用硅胶柱层析(石油醚∶丙酮＝6∶1)纯化得1.32g(76％)化合物4，为黄色粉末。ESI-MS(m/e)459[M+H]⁺。

实施例5制备3-乙酰基-6-(1，3-二羰基丁基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(5)

在100ml的圆底烧瓶中加入1.98g(4.3mmol)化合物(4)，加入50ml丙酮搅拌溶解，在冰浴下加入3ml盐酸水溶液(2mol/L)，室温反应12小时。TLC监测原料斑点消失，加入饱和NaHCO₃水溶液调节pH至中性，减压回收溶剂，残余物中加入50ml二氯甲烷，分液后水层用二氯甲烷萃取(30ml×3)，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，残余物用硅胶柱层析(石油醚∶丙酮＝6∶1)纯化得1.26g(75％)化合物5，为黄色粉末。ESI-MS(m/e)393[M+H]⁺。

实施例6制备3-乙酰基-6-羟甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(6)

在100ml的圆底烧瓶中加入1.06g(2.7mmol)化合物(5)，加入20ml甲醇搅拌溶解，再加入745mg(5.4mol/L)碳酸钾粉末，室温反应8小时，有固体生成。TLC监测原料斑点消失，过滤，滤饼用甲醇洗，得到黄色粉末338mg，即目标化合物(6)。滤液减压浓缩至干，加入丙酮溶解，过滤除盐，滤液用硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝40∶1)纯化得709mg(85％)化合物6，为黄色粉末。Mp：210-211℃；[α]_D ²⁵＝-42.7(c＝0.10，甲醇)；IR(KBr)：3321，2974，2922，1655，1551，1429，1364，1327，974，831，743cm^-1；ESI-MS(m/e)307[M-H]^-；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝11.83(s，1H)，8.10(d，J＝7.8Hz，1H)，7.65(d，J＝7.8Hz，1H)，7.45(d，J＝8.1Hz，1H)，7.28(t，J＝7.8Hz，1H)，7.11(t，J＝7.8Hz，1H)，6.82(d，J＝7.8Hz，1H)，5.40-5.46(m，1H)，5.18(t，J＝6.0Hz，1H)，3.54-3.60(m，1H)，3.28-3.41(m，2H)，3.11(dd，J＝6.9Hz，J＝17.1Hz，1H)，2.59(s，1H)；¹³C-NMR(75MHz，DMSO-d₆)：5/ppm＝196.62，160.68，142.75，142.51，139.64，126.79，126.21，125.43，123.90，120.53，120.41，114.07，112.60，100.36，59.24，51.43，31.18，19.70。

实施例7制备3-乙酰基-6-(N-苯乙酰-S-对甲氧苄基半胱氨酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(7a)

冰浴下，在100ml茄瓶中加入431mg(1.2mmol)N-苯乙酰-S-对甲氧苄基半胱氨酸，用无水四氢呋喃溶解，加入162mg(1.2mmol)HOBt，加入247mg(1.2mmol)DCC，活化半小时。将308mg(1.0mmol)3-乙酰基-6-羟甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(6)溶于无水四氢呋喃中，将混合液加入反应瓶内。再用NMM调PH至7-8，撤去冰浴，避光室温反应48小时。将反应液减压浓缩至干，用乙酸乙酯溶解，过滤，滤液用饱和碳酸氢钠溶液洗三次，再用饱和氯化钠溶液洗三次，酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干。残余物用薄层层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，再用乙醚磨洗，得258mg(46％)化合物7a，为黄色粉末。Mp68-69℃；[α]_D ²⁵＝-30.6(c＝0.09，甲醇)；IR(KBr)：2922，2841，1746，1661，1545，1433，1329，1248，1177，1030，839，743cm^-1；ESI-MS(m/e)650[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝11.92(s，1H)，8.52-8.56(m，1H)，8.14(d，J＝7.8Hz，1H)，7.52-7.59(m，1H)，7.45(d，J＝8.1Hz，1H)，7.06-7.31(m，9H)，6.85(t，J＝7.5Hz，3H)，5.67-5.74(m，1H)，4.36-4.43(m，1H)，4.16-4.24(m，1H)，3.97-4.10(m，1H)，3.73(s，3H)，3.59(s，2H)，3.47(s，2H)，3.37-3.40(m，1H)，3.13-3.24(m，1H)，2.61-2.64(m，2H)，2.58(s，3H)；¹³C-NMR(75MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝196.45，170.70，170.67，170.63，160.79，158.70，142.94，142.47，139.64，136.43，130.43(2C)，130.08，129.50(2C)，128.61(2C)，126.81，126.56，125.93，125.57，123.99，120.53，114.25(2C)，113.78，112.66，100.78，63.14，55.51，52.37，48.18，42.24，35.22，32.46，31.20，20.81。

实施例8制备3-乙酰基-6-(N-苯乙酰-4-苄酯基-天冬氨酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(7b)

冰浴下，在100ml茄瓶中加入432mg(1.3mmol)N-苯乙酰-4-苄酯基-天冬氨酸，用无水四氢呋喃溶解，加入170mg(1.3mmol)HOBt，加入260mg(1.3mmol)DCC，活化半小时。将324mg(1.1mmol)3-乙酰基-6-羟甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(6)溶于无水四氢呋喃中，将混合液加入反应瓶内。再用NMM调PH至7-8，撤去冰浴，避光室温反应48小时。将反应液减压浓缩至干，用乙酸乙酯溶解，过滤，滤液用饱和碳酸氢钠溶液洗三次，再用饱和氯化钠溶液洗三次，酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干。残余物用薄层层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，再用乙醚磨洗，得380mg(57％)化合物7b，为黄色粉末。Mp192-193℃；[α]_D ²⁵＝-58.3(c＝0.10，甲醇)；IR(KBr)：3304，2955，2924，1751，1661，1545，1360，1333，1175，743，696cm^-1；ESI-MS(m/e)632[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝11.91(s，1H)，8.56-8.60(m，1H)，8.14(d，J＝7.8Hz，1H)，7.57(d，J＝8.1Hz，1H)，7.44(d，J＝8.4Hz，1H)，7.17-7.39(m，11H)，7.08(t，J＝7.2Hz，1H)，6.85(d，J＝7.8Hz，1H)，5.66-5.70(m，1H)，5.04(s，2H)，4.52-4.60(m，1H)，3.96-4.23(m，2H)，3.44(s，2H)，3.09-3.28(m，2H)，2.63-2.77(m，2H)，2.58(s，3H)；¹³C-NMR(75MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝196.39，170.65，170.53，170.20，170.14，160.86，142.98，142.44，139.59，136.37，136.26，129.42(2C)，128.86(2C)，128.50(2C)，128.37(2C)，128.32(2C)，126.82，125.90，123.90，120.48，113.81，112.63，100.79，66.34，63.45，49.18，48.11，42.19，35.69，31.27，20.77。

实施例8制备3-乙酰基-6-(N-苯乙酰-4-苄酯基-谷氨酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(7c)

冰浴下，在100ml茄瓶中加入426mg(1.2mmol)N-苯乙酰-4-苄酯基-谷氨酸，用无水四氢呋喃溶解，加入162mg(1.2mmol)HOBt，加入247mg(1.2mmol)DCC，活化半小时。将308mg(1.0mmol)3-乙酰基-6-羟甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(6)溶于无水四氢呋喃中，将混合液加入反应瓶内。再用NMM调PH至7-8，撤去冰浴，避光室温反应48小时。将反应液减压浓缩至干，用乙酸乙酯溶解，过滤，滤液用饱和碳酸氢钠溶液洗三次，再用饱和氯化钠溶液洗三次，酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干。残余物用薄层层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，再用乙醚磨洗，得220mg(34％)化合物7c，为黄色粉末。Mp60-61℃；[α]_D ²⁵＝-43.4(c＝0.10，甲醇)；IR(KBr)：2926，2855，1738，1653，1589，1545，1331，1167，743，698cm^-1；ESI-MS(m/e)646[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝11.90(s，1H)，8.42-8.49(m，1H)，8.13(d，J＝7.8Hz，1H)，7.55(d，J＝7.8Hz，1H)，7.44(d，J＝8.1Hz，1H)，7.35(s，5H)，7.22-7.30(m，6H)，7.07(t，J＝7.2Hz，1H)，6.85(d，J＝7.8Hz，1H)，5.69-5.75(m，1H)，5.07(s，2H)，4.15-4.21(m，2H)，3.95-4.00(m，1H)，3.45(s，2H)，3.07-3.25(m，2H)，2.58(s，3H)，2.29-2.39(m，2H)，1.79-1.98(m，2H)；¹³C-NMR(75MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝196.42，172.28，172.23，171.54，170.83，160.79，142.90，142.43，139.64，136.58，136.51，129.43(2C)，128.87(2C)，128.61(2C)，128.45(2C)，128.37(2C)，126.80，125.94，123.97，120.52，113.63，112.64，100.78，66.00，62.83，51.71，48.07，42.28，31.20，30.27，26.29，20.70。

实施例9制备3-乙酰基-6-(N-苯乙酰-O-苄基-丝氨酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(7d)

冰浴下，在100ml茄瓶中加入754mg(2.4mmol)N-苯乙酰-O-苄基-丝氨酸，用无水四氢呋喃溶解，加入324mg(2.4mmol)HOBt，加入494mg(2.4mmol)DCC，活化半小时。将616mg(2.0mmol)3-乙酰基-6-羟甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(6)溶于无水四氢呋喃中，将混合液加入反应瓶内。再用NMM调PH至7-8，撤去冰浴，避光室温反应48小时。将反应液减压浓缩至干，用乙酸乙酯溶解，过滤，滤液用饱和碳酸氢钠溶液洗三次，再用饱和氯化钠溶液洗三次，酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干。残余物用薄层层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，再用乙醚磨洗，得215mg(18％)化合物7d，为黄色粉末。Mp79-80℃；[α]_D ²⁵＝-28.0(c＝0.10，甲醇)；IR(KBr)：2928，2857，1746，1661，1587，1547，1501，1433，1364，1333，1258，741，700cm^-1；ESI-MS(m/e)604[M+H]⁺；¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝11.93(s，1H)，8.56(d，J＝8.0Hz，1H)，8.14(d，J＝7.5Hz，1H)，7.49(d，J＝8.0Hz，1H)，7.46(d，J＝8.5Hz，1H)，7.19-7.35(m，11H)，7.06-7.11(m，1H)，6.87(d，J＝7.5Hz，1H)，5.68-5.72(m，1H)，4.45-4.51(m，1H)，4.42(s，2H)，4.20-4.25(m，1H)，4.02(q，J＝7.5Hz，1H)，3.37-3.45(m，2H)，3.14-3.29(m，2H)，2.62-2.80(m，2H)，2.58(s，3H)；¹³C-NMR(75MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝196.42，171.53，171.44，170.51，160.82，157.53，142.94，142.62，139.62，137.67，136.41，130.44，129.63(2C)，129.38(2C)，128.86(2C)，128.52(2C)，128.43(2C)，128.22(2C)，128.06，126.71，125.91，123.98，114.94(2C)，113.89，112.66，100.73，69.65，63.45，54.13，48.24，42.28，35.79，31.22，21.01。

实施例10制备3-乙酰基-6-(N，N-二苯乙酰-赖氨酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(7e)

冰浴下，在100ml茄瓶中加入458mg(1.2mmol)N，N-二苯乙酰-赖氨酸，用无水四氢呋哺溶解，加入162mg(1.2mmol)HOBt，加入247mg(1.2mmol)DCC，活化半小时。将308mg(1.0mmol)3-乙酰基-6-羟甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(6)溶于无水四氢呋喃中，将混合液加入反应瓶内。再用NMM调PH至7-8，撤去冰浴，避光室温反应48小时。将反应液减压浓缩至干，用乙酸乙酯溶解，过滤，滤液用饱和碳酸氢钠溶液洗三次，再用饱和氯化钠溶液洗三次，酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干。残余物用薄层层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，再用乙醚磨洗，得127mg(19％)化合物7e，为黄色粉末。Mp72-73℃；[α]_D ²⁵＝-49.7(c＝0.12，甲醇)；IR(KBr)：3063，2934，1748，1651，1545，1362，1331，1179，746cm^-1；ESI-MS(m/e)673[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝11.93(s，1H)，8.37(q，J＝7.5Hz，1H)，8.13(d，J＝7.8Hz，1H)，7.98-7.99(m，1H)，7.58(d，J＝8.1Hz，1H)，7.42(d，J＝8.1Hz，1H)，7.16-7.31(m，12H)，7.08(t，J＝7.8Hz，1H)，6.85(d，J＝7.8Hz，1H)，5.65-5.71(m，1H)，3.95-4.25(m，3H)，3.51(s，2H)，3.39(s，2H)，3.10-3.27(m，2H)，2.95-3.01(m，2H)，2.59(s，3H)，1.15-1.52(m，6H)；¹³C-NMR(75MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝196.45，172.13，170.75，170.39，160.75，142.89，142.55，139.60，137.02，136.58，129.42(2C)，129.38(2C)，128.60(2C)，126.76，126.64，125.90，125.54，123.97，120.53，115.69，113.88，112.62，100.69，63.05，52.43，48.28，42.91，42.21，38.80，31.22，30.57，29.03，23.24，21.01。

实施例11制备3-乙酰基-6-(N-苯乙酰-O-苄基-酪氨酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(7f)

冰浴下，在100ml茄瓶中加入934mg(2.4mmol)N-苯乙酰-O-苄基-酪氨酸，用无水四氢呋喃溶解，加入324mg(2.4mmol)HOBt，加入494mg(2.4mmol)DCC，活化半小时。将616mg(2.0mmol)3-乙酰基-6-羟甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(6)溶于无水四氢呋喃中，将混合液加入反应瓶内。再用NMM调PH至7-8，撤去冰浴，避光室温反应48小时。将反应液减压浓缩至干，用乙酸乙酯溶解，过滤，滤液用饱和碳酸氢钠溶液洗三次，再用饱和氯化钠溶液洗三次，酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干。残余物用薄层层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，再用乙醚磨洗，得317mg(23％)化合物7f，为黄色粉末。Mp89-90℃；[α]_D ²⁵＝-11.2(c＝0.12，甲醇)；IR(KBr)：2926，2857，1738，1657，1545，1335，1240，820，741cm^-1；ESI-MS(m/e)680[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝11.93(s，1H)，8.37-8.41(m，1H)，8.14(d，J＝7.5Hz，1H)，7.59(d，J＝7.5Hz，1H)，7.24-7.46(m，8H)，6.79-7.22(m，11H)，5.66-5.75(m，1H)，5.05(s，2H)，4.22-4.34(m，1H)，4.01-4.16(m，2H)，3.37-3.45(m，2H)，3.14-3.29(m，2H)，2.62-2.80(m，2H)，2.58(s，3H)；¹³C-NMR(75MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝196.42，171.53，171.44，170.51，160.82，157.53，142.94，142.62，139.62，137.67，136.41，130.44，129.63(2C)，129.38(2C)，128.86(2C)，128.52(2C)，128.43(2C)，128.22(2C)，128.06，126.71，125.91，123.98，114.94(2C)，113.89，112.66，100.73，69.65，63.45，54.13，48.24，42.28，35.79，31.22，21.01。

实施例12评价化合物7a-f抗细胞增殖活性

本发明的化合物7a-f用含1％DMSO的PBS配制，先用S180(小鼠肉瘤细胞)和HL60(人白血病细胞)筛选。然后选择化合物7b为代表考察它们对肿瘤细胞A549(人肺癌细胞)，Bel-7402(人肝癌细胞)，HepG2(人肝癌细胞)，SW480(人结肠癌细胞)和HCT-8(人回盲肠腺癌细胞)及非肿瘤细胞L02(人正常肝细胞)增殖的影响。

分别将生长状态良好，处于对数生长期的A549，Bel-7402，HCT-8，Haca-T，L02，HepG2，SW480，HL60和S180细胞按照5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μl。在37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时，按预设的浓度梯度100，50，25，10和5μM加入经灭菌处理的本发明的化合物7a-f，对照组加入等体积溶解样品的溶媒。继续培养48小时后，每孔加浓度为5mg/ml的MTT溶液25μl，置于37℃孵育4小时，小心除去上清液(悬浮细胞经离心后除去上清液)后每孔加入DMSO(二甲基亚砜)100μl，振荡15分钟溶解沉淀。立即于酶标仪上570nm波长下测定OD值(吸光度)。计算抑瘤率及IC₅₀。结果列入表1和表2。表1说明7a-f中大部分化合物对S180和HL60细胞增殖有较强抑制作用。于是选择活性好的7b进一步用肿瘤细胞A549、Bel7402、HepG2和HCT-8和非肿瘤细胞L02评价。表2说明，7c对肿瘤细胞A549、Bel7402、HepG2和HCT-8增殖有明显的抑制作用，而对非肿瘤细胞L02影响很小。

表17a-f抑制肿瘤细胞S180和HL60增殖的活性(IC₅₀±SDμM)

表27b抑制肿瘤细胞和非肿瘤细胞增殖的活性(IC₅₀±SDμM)

实施例13评价7a-f的抗肿瘤活性

测定前将本发明的化合物加吐温80助溶，溶于生理盐水。无菌条件下取接种于ICR小鼠7-10天的S180肉瘤，加入适量生理盐水配制成瘤细胞悬液，细胞数为2×10⁷/mL，接种于健康雄性ICR小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2ml。肿瘤接种24h后，治疗组小鼠每日腹腔注射0.2ml本发明化合物的水溶液，连续给药7天，剂量为0.1μmol/kg。空白组小鼠每日腹腔注射0.2ml生理盐水。以阿霉素(剂量为2μmol/kg)作阳性对照。实验进行至第8天，称小鼠体重，并剖取各组小鼠的肿瘤称重，最后统计各组动物的抑瘤率。实体瘤的疗效以瘤重抑制百分率表示，计算如下：瘤重抑制率％＝(1-给药组瘤重/空白组瘤重)×100％。结果列入表3。给药剂量在0.1μmol/kg下，化合物7a-f都有显著的抗肿瘤活性。其中化合物7b和7d的抗肿瘤活性强，与阿霉素相当(p＞0.05)。

表3化合物6和7a-f对S180荷瘤小鼠瘤重的影响结果

n＝12，a)与生理盐水及化合物6比p＜0.01，与阿霉素比p＞0.05；b)与生理盐水组比p＜0.01，与化合物6比p＞0.05。

实施例147b的剂量依赖实验

按照实施例10的方法，选择活性较强的7f测定0.01μmol/kg、0.1μmol/kg和1μmol/kg和10μmol/kg四种剂量下的活性，结果见表4。表4的数据表明，在0.1μmol/kg和1μmol/kg和10μmol/kg剂量下7b都具有明显的抗肿瘤活性。在0.01μmol/kg的剂量下7b不再显示抗肿瘤活性。四种剂量下的活性显示明显差异，呈现剂量依赖关系。

表4不同剂量7b对S180荷瘤小鼠瘤重的影响

n＝12，a)与生理盐水组相比p＜0.01；b)与0.1μmol/kg7b比p＜0.05；c)与0.1μmol/kg和1μmol/kg7b比p＜0.01.

实施例15评价7b对肿瘤细胞自噬的影响

将A549细胞消化制成单细胞悬液，以1×10⁵个/ml的密度均匀地接种到共聚焦培养皿内，移入培养箱中培养过夜贴壁，然后加生理盐水(阴性对照)，雷帕霉素(25μM，阳性对照)和7b(25μM)孵育24小时。小心吸除培养基，用试剂盒中的缓冲溶液洗两次。加入100μl试剂盒中的绿色染色液对自噬体避光染色30分钟，吸除上清，用试剂盒中的缓冲溶液洗两次。然后在激发波长488nm下用激光共聚焦显微镜观测生理盐水，雷帕霉素和7b对细胞自噬的影响。结果见图2。

哺乳动物上雷帕霉素的靶蛋白mTOR是细胞生长和增殖的重要调节因子，参与蛋白质、核糖体生物合成和细胞凋亡等多项生理过程。多数肿瘤与mTOR过度表达或突变有关。雷帕霉素是mTOR变构的抑制剂，通过诱导自噬抑制肿瘤细胞异常增殖。自噬体的特异性标记蛋白是LC3。肿瘤细胞自噬时，LC3-1通过脂质化形成LC3-II定位于自噬体膜上。自噬体膜上的LC3-II能和绿色荧光蛋白结合形成嵌合蛋白用激光共聚焦显微镜观测。

图2说明，生理盐水不引起A549细胞生成自噬体，雷帕霉素引起A549细胞生成自噬体的作用明显比7b引起A549细胞生成自噬体的作用弱(图中白色圆圈为自噬体)。可见，与雷帕霉素相似，7b代表的化合物7a-f的抗肿瘤作用是通过抑制mTOR变构诱导自噬抑制肿瘤细胞异常增殖来实现的。

Claims (4)

1.下式代表的化合物7a-f，

7a中AA为L-对甲氧苄基半胱氨酰基，7b中AA为L-单苄酯天冬氨酰基，7c中AA为L-单苄酯谷氨酰基，7d中AA为L-苄基-丝氨酰基，7e中AA为L-苯乙酰赖氨酰基，7f中AA为L-苄基-酪氨酰基。

2.制备权利要求1的化合物7a-f的方法，该方法包括用五个关键步骤制备四个关键中间体：

1)制备1-(2，2-二甲氧乙基)-3-羟甲基-1，2，3，4-四氢咔啉(3)；

2)制备1-(2，2-二甲氧乙基)-2-(1，3-二羰基丁基)-3-(1，3-二羰基丁基)氧化甲基-1，2，3，4-四氢咔啉(4)；

3)制备3-乙酰基-6-(1，3-二羰基丁基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(5)；

4)制备3-乙酰基-6-羟甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(6)；

5)往3-乙酰基-6-羟甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(6)引入苯乙酰氨基酸。

3.权利要求1的化合物7a-f制备抗肿瘤疾病药物中的应用。

4.权利要求1的化合物7a-f作为制备mTOR变构抑制剂诱导自噬的应用。