CN105169385B

CN105169385B - 一种用于疫苗的非载体佐剂、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN105169385B
Application number: CN201510408560.5A
Authority: CN
Inventors: 蒋兴宇; 刘野; 耶库尼·巴拉钱德兰
Original assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Current assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Priority date: 2015-07-13
Filing date: 2015-07-13
Publication date: 2019-03-12
Anticipated expiration: 2035-07-13
Also published as: CN105169385A

Abstract

本发明涉及一种用于疫苗的非载体佐剂、其制备方法及应用，所述的非载体佐剂为表面经免疫调节分子修饰的银纳米棒。本发明所述非载体佐剂可有效增强HIV蛋白疫苗的抗体IgG与IgG3和细胞CD107a，IL‑2，IL‑4与TNF‑α免疫反应水平；且所述非载体佐剂的细胞毒性极低，几乎不被细胞摄取，不影响细胞的正常生长；本发明所述非载体佐剂还具有更好的生物相容性，具有重要的应用价值。

Description

一种用于疫苗的非载体佐剂、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种用于疫苗的非载体佐剂、其制备方法及应用。

背景技术

疫苗是预防和控制传染性疾病发生及发展的重要手段。免疫佐剂(又称非特异性免疫增生剂)则是疫苗中不可或缺的组成成分，能够有效地促进疫苗诱导的特异性免疫反应。随着疫苗研究的飞速发展，新型的基因工程疫苗正被广泛用于疫苗的研制开发。这种疫苗具有纯度高、特异性强等优点，但是由于其分子小，免疫原性相对较差，迫切需要结合有效的免疫佐剂，以提高疫苗的免疫效力。过去的数十年来，人们在研究中发现和研制了各种新型的免疫佐剂，然而潜在的安全性及稳定性等因素大大制约了免疫佐剂的推广使用。

纳米银具有抗菌、除臭及吸收部分紫外线的功能，可应用于医药行业和化妆品行业，在化纤中加入少量的纳米银，可以改变化纤品的某些性能，并赋予很强的杀菌能力。人们均将纳米材料作为载体，高效负载疫苗抗原，增强抗原进入细胞的能力，最终诱导更强的免疫反应。但这样的策略通常也会因为纳米疫苗载体的过多进入细胞，而造成过强的细胞毒性，不利于纳米佐剂的进一步临床应用。

CN 102068698 A公开了一种纳米疫苗及其制备方法，采用新的甘露糖基化的阳离子脂质体复合物，可以作为疫苗载体及应用于疫苗，这种新的脂质体复合物在阳离子脂中掺入中性磷脂和甘露糖。该发明作为一种高效无副作用的新型疫苗载体和佐剂，显著增强疫苗的免疫效果。CN 101972477 A公开了一种磷酸锌疫苗佐剂及其应用，所述磷酸锌作为疫苗佐剂与疫苗联合应用，能够有效增强疫苗的体液免疫应答，其免疫增强效果优于铝佐剂和氢氧化锌佐剂。但上述的纳米疫苗和佐剂都能被细胞摄取，影响细胞的正常代谢。

许立耕等研究了金纳米棒经CTAB、PDDAC和PEI修饰后，作为DNA疫苗佐剂，在治疗HIV中的作用(参见Ligeng Xu,et al.,Surface-Engineered Gold Nanorods:PromisingDNA Vaccine Adjuvant for HIV-1Treatment.Nano Letters,2012,12(4):2003-2012)，尽管其首次公开了将金纳米棒作为载体佐剂用于增强HIV免疫反应，然而，其存在以下缺陷：金纳米棒佐剂，对细胞的毒性更强，且刺激免疫反应的能力相对较差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于疫苗的非载体佐剂、其制备方法及应用，所述非载体佐剂增强免疫反应的同时，不会进入细胞，且毒性极低。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种用于疫苗的非载体佐剂，所述的非载体佐剂为表面经免疫调节分子修饰的银纳米棒。

目前来看，载体佐剂通常要作为抗体的载体，伴随抗体一起进入细胞内，会对细胞产生毒性，然而本发明所述的非载体佐剂于载体佐剂有着本质的不同，其不与抗体结合，几乎不会被细胞摄取，因而对细胞只有极低的细胞毒性，不会影响细胞的正常代谢和正常生长，这类具有良好生物相容性的纳米佐剂可有效增强蛋白疫苗所引发的免疫反应，包括抗体反应和T细胞反应等。

本发明所采用的银纳米棒不同于现有技术中的金纳米棒，其不同主要体现在：表面修饰的免疫调节分子和组成成分不同，银纳米棒和金纳米棒的尺寸也存在差异，这就导致了细胞对银纳米棒和金纳米棒的摄取程度不同和对细胞的免疫效果不同；其相对于金纳米棒，具有以下优势：银纳米棒作为非载体佐剂，能显著增强免疫反应，几乎不被细胞吸收，对细胞的毒性相较于金纳米棒低得多。。

优选地，所述的免疫调节分子为聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯亚胺或二甲基二烯丙基氯化铵中的任意一种或是至少两种的组合。

作为优选技术方案，所述的非载体佐剂为表面经聚乙二醇(PEG)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)修饰的银纳米棒。

本发明中，非载体佐剂经PEG和PVP修饰，PEG修饰可以更好的保护纳米银的稳定性，同时PVP可以作为免疫刺激剂发挥作用。

优选地，所述银纳米棒的长度为150-300nm，例如可以是150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm或300nm，优选为180-260nm，进一步优选为200nm。

优选地，所述银纳米棒的直径为10-120nm，例如可以是10nm、11nm、20nm、30nm、50nm、60nm、80nm、90nm、100nm、110nm、115nm或120nm，优选为20-80nm，进一步优选为50nm。

第二方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的非载体佐剂的方法，包括以下步骤：

(1)向持续搅拌的PEG溶液中加入PVP和硝酸银，继续不断搅拌至试剂完全溶解；

(2)将步骤(1)得到的溶液加热至75-85℃，恒温0.5-3h；

(3)将步骤(2)得到的溶液继续加热至85-95℃，恒温15-30h；

(4)将步骤(3)得到的溶液冷却后用乙醇或水沉淀，再加入水溶解沉淀经20℃水浴超声得到银纳米棒。

优选地，步骤(1)所述PVP的浓度为0.1-1mol/L，例如可以是0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L或1mol/L，优选为0.15-0.3mol/L。

优选地，步骤(1)所述硝酸银的浓度为0.01-1mol/L，例如可以是0.01mol/L、0.02mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L或1mol/L，优选为0.05-0.3mol/L。

优选地，步骤(1)所述的PEG浓度为1-50nM，例如可以是1nM、1.1nM、1.2nM、2nM、3nM、5nM、8nM、10nM、12nM、15nM、16nM、18nM、20nM、22nM、24nM、25nM、26nM、28nM、30nM、32nM、35nM、36nM、38nM、40nM、42nM、44nM、45nM、46nM、48nM或50nM，优选为3-30nM，进一步优选为10nM。

优选地，步骤(2)所述的加热温度为80℃，恒温1h。

优选地，步骤(3)所述的加热温度为90℃，恒温20h。

优选地，所述制备方法包括如下步骤：

(1)向持续搅拌的PEG溶液中加入浓度为0.1-1mol/L PVP和浓度为0.01-1mol/L硝酸银，继续不断搅拌至试剂完全溶解；

(2)将步骤(1)得到的溶液加热至75-85℃，恒温0.5-3h；

(3)将步骤(2)得到的溶液继续加热至85-95℃，恒温15-30h；

第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的非载体佐剂在增强疫苗和细胞免疫反应中的应用。

优选为在增强HIV蛋白疫苗的抗体和细胞免疫反应中的应用。

本发明的纳米非载体佐剂可有效增强HIV蛋白疫苗的抗体(IgG，IgG3)和细胞(CD107a，IL-2，IL-4，TNF-α)免疫反应水平。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明非载体佐剂可有效增强HIV蛋白疫苗的抗体IgG与IgG3和细胞CD107a，IL-2，IL-4与TNF-α免疫反应水平；

(2)本发明非载体佐剂的细胞毒性极低，几乎不会进入细胞，不影响细胞的正常生长；

(3)本发明非载体佐剂相比于其他纳米材料有更好的生物相容性。

附图说明

图1是本发明非载体佐剂(银纳米棒)结合HIV蛋白疫苗在小鼠体内引发的体液和细胞免疫反应的示意图。

图2是本发明银纳米棒的表征图，其中(A)为银纳米棒FTIR结果图；(B)为银纳米棒TEM结果图；(C)为银纳米棒DLS粒径分布结果图；(D)为银纳米棒DLS电荷强度结果图；(E)为银纳米棒修饰后的FTIR结果图。

图3是本发明银纳米棒和银纳米球的结果对比图，其中(A)和(B)为银纳米棒和银纳米颗粒对Hela和HUVEC细胞的毒性结果对比；(C)和(D)为银纳米棒和银纳米颗粒被Hela和HUVEC细胞摄取的强度对比；(E)和(F)为银纳米棒和银纳米颗粒在Hela和HUVEC细胞中，摄取强度和毒性强度的关系图；其中，浅色为银纳米棒，深色为银纳米颗粒。

图4是本发明非载体佐剂(银纳米棒)增强HIV蛋白疫苗引发的抗体反应，其中(A)为lgG抗体反应；(B)为lgA抗体反应；(C)为lgM抗体反应；其中，组1、组2和组3分别代表PBS注射小鼠组、单独HIV蛋白疫苗注射小鼠组和“HIV蛋白疫苗+银纳米棒”注射小鼠组。

图5是本发明非载体佐剂(银纳米棒)增强HIV蛋白疫苗引发的细胞反应，其中(A)为CD107a细胞反应；(B)为IFN-γ细胞反应；(C)为IL-2细胞反应；(D)为IL-4细胞反应；(E)为TNF-α细胞反应，其中，组1、组2和组3分别代表PBS注射小鼠组、单独HIV蛋白疫苗注射小鼠组和“HIV蛋白疫苗+银纳米棒”注射小鼠组。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

本申请实施例所用材料及试剂购自：AgNO₃(纯度99.9％)购自Alfa Aesar；PEG600购自中国西龙化学试剂公司；PVP(分子量40K)、PBS、BSA、聚甲醛和TMB显色液购自Sigma公司；HRP标记抗体购自Santa Cruz；细胞因子标记物购自Invitrogen公司；配制试剂使用电阻率大于18.0mΩ的超纯水；其余化学/生物试剂均可由商品化购得，所有化学试剂均在保质期内使用。所有动物实验经国家纳米科学中心动物伦理委员会批准，严格按照北京实验室动物福利与伦理委员会规定操作。

实施例中的仪器：

酶联免疫检测仪 Thermo Life Sciences；

FACS Calibur流式细胞仪 Becton Dickinson。

实施例1：银纳米棒的合成及特性表征

银纳米棒的制备：

室温条件下，0.5ml 3M AgNO₃和2.5ml 2M PVP加入持续搅拌的25mL聚乙二醇中，加热之前再持续搅拌5min。混合物加热至80℃，维持1h，继续加热至90℃持续20h。冷却后用大量乙醇或水沉淀，缓慢倒出上层液体，加入水溶解沉淀经20℃水浴超声，即获得银纳米棒。

通过FIRT、TEM和DLS表征制备的银纳米棒，结果如图2(A)、(B)、(C)、(D)和(E)所示。

从图2(A)FIRT图可以看出银纳米棒在400nm和900nm处拥有2个不同的峰值，表明属于棒状结构；从图2(B)的TEM图可以看出银纳米棒直径约50nm，长度约200nm；从图2(C)的DLS测量图可以看出银纳米棒的整体水合粒径接近300nm，表面带负电(-10V)；从图2(D)的FIRT图可以看出银纳米棒表面已被成功修饰上PVP和PEG。

对比例1

银纳米颗粒的制备：

室温条件下，100ml PEG中加入1g PVP，然后加入0.9g AgNO3，期间不断搅拌直至试剂完全溶解，烧瓶加热至90℃，保持20h。反应后可以看到灰褐色胶状物，冷却至室温。加入大量乙醇和水离心可获得纳米颗粒，固体沉淀物可加少量水利用水浴超声，即获得银纳米颗粒。

纳米颗粒典型的紫外吸收光谱在430nm处呈现等离子体振子峰。

实施例2

银纳米棒的制备：

室温条件下，0.5ml 1M AgNO₃和2.5ml 0.5M PVP加入持续搅拌的25mL聚乙二醇中，加热之前再持续搅拌5min。混合物加热至80℃，维持1h，继续加热至90℃持续20h。冷却后用大量乙醇或水沉淀，缓慢倒出上层液体，加入水溶解沉淀经20℃水浴超声，即获得银纳米棒。

制备得到的银纳米棒直径约10nm，长度约150nm。

实施例3

银纳米棒的制备：

室温条件下，0.5ml 5M AgNO₃和2.5ml 6M PVP加入持续搅拌的25mL聚乙二醇中，加热之前再持续搅拌5min。混合物加热至80℃，维持1h，继续加热至90℃持续20h。冷却后用大量乙醇或水沉淀，缓慢倒出上层液体，加入水溶解沉淀经20℃水浴超声，即获得银纳米棒。

制备得到的银纳米棒直径约120nm，长度约300nm。

实施例4-7均采用实施例1和对比例1制备的银纳米棒和银纳米颗粒作性能测试及对比。

实施例4：细胞活性和细胞摄取能力分析

(1)24孔板中接种HeLa或Huvec细胞100000个，37℃，5％CO₂条件下培养过夜。加入5μg银纳米材料，培养24h，PBS洗3次，去掉游离的银纳米材料，再加入酸溶解，通过ICP-OES检测银浓度。

(2)对比例1的银纳米颗粒和实施例1的银纳米棒对细胞活性的影响使用CCK-8试剂盒检测。本研究选用HeLa和Huvec细胞进行活性检测。每孔10000个细胞接种到96孔板，37℃，5％CO₂条件下培养过夜，使用不同浓度的银纳米溶液重悬，其中浓度梯度为低浓度：0μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml和2.5μg/ml；中浓度：5μg/ml和7.5μg/ml；高浓度：10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml和25μg/ml，培养24h。去掉含银纳米材料的培养基，加入10％CCK-8溶液的培养基孵育1h。

使用全自动酶标仪检测460nm波长下的吸光度值，未处理细胞作为对照。结果以百分比表示：含纳米材料的培养基中活细胞数与不含纳米材料培养基中活细胞数的比值。

从图3(A)和(B)可以看出细胞与银纳米棒共培养的活力明显强于银纳米颗粒，从图(C)和(D)可以看出细胞摄取银纳米颗粒的浓度明显高于摄取银纳米棒的浓度。从图3(E)和(F)细胞对银纳米棒的摄取较少，导致更低的细胞毒性；而对银纳米颗粒的摄取较多，导致更高的细胞毒性。

实施例5：疫苗的制备和接种

无病原体感染的BALB/c小鼠，6～8周龄，在无菌环境下饲养。实验分为两部分，每部分包含3组，每组5只小鼠。

(1)蛋白疫苗免疫策略：接种HIV包膜蛋白gp120疫苗，gp120是HIV包膜蛋白的一部分。3组分别接种PBS(空白对照)、HIV包膜蛋白gp120(剂量为每只10μg)、HIV包膜蛋白gp120与银纳米棒混合物(两种剂量均为每只10μg)，共免疫3次，间隔30天。

(2)DNA疫苗prime—蛋白疫苗boost免疫策略：prime阶段，3组小鼠分别接种PBS、表达HIV包膜蛋白gp120的HIV DNA疫苗(剂量为每只50μg)、银纳米棒与HIV DNA vaccine混合物(剂量分别为10μg和50μg)，共免疫3次，间隔30天；2个月后boost阶段，3组小鼠分别接种PBS、HIV包膜蛋白gp120(剂量为每只10μg)、HIV包膜蛋白gp120与银纳米棒混合物(两种剂量均为每只10μg)，共免疫2次，间隔2周。boost阶段末次免疫后，检测小鼠体液和细胞免疫相关指标。

实施例6：ELISA检测

按配方0.012mol/L Na₂CO₃，0.038mol/L NaHCO₃，pH 9.6配置稀释液，稀释HIV包膜蛋白gp120包被于96孔板，终浓度为0.01μg/ml，4℃，孵育过夜。PBST洗板5次，用含3％BSA的PBST封闭，37℃，孵育2h。用封闭液稀释小鼠血清，100μl/孔，37℃孵育1h。PBST洗板5次，按1:5000比例加入HRP标记的抗鼠IgG、IgA、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3的二抗，37℃孵育1h。PBST洗板5次，加入TMB显色液，100μl/孔，显色5min。用2M H₂SO₄终止反应，25μl/孔。在波长450nm和630nm下，用酶联免疫检测仪检测OD值。

cut-off值确定：(1)1:100稀释后OD值(OD450与OD630之间的差值)大于0.1，低于0.1为阴性。(2)检测孔OD值比阴性对照大于2.1倍以上为阳性。最终效价以Log10浓度表示。

通过对多个抗体滴度的检测，从图4(A)、(B)和(C)可以看出银纳米棒作为疫苗佐剂可有效增强IgG免疫反应水平，但IgM和IgA的免疫反应水平没有明显增强。

实施例7：流式细胞仪分析

提取新鲜脾细胞，用PBS洗两次，调整细胞悬液终浓度为1×10⁶个/ml。加入100μLgp120、DMSO和葡萄球菌B型肠毒素，37℃、5％CO2条件下孵育过夜，加入布雷菲德菌素A和莫能菌素终止细胞因子转运；用4种抗鼠表面标记抗体CD3e FITC、CD8a Alexa700、CD4780和CD107a(LAMP-1)710(eBioscience)，对细胞进行染色，4℃条件下，2％多聚甲醛将细胞固定，PBS洗两次；再用4种抗鼠胞内细胞因子的抗体IFN-γAPC、TNF-αPE-Cyanine7、450和IL-4PE进行染色，并加入皂素使细胞通透性增加，4℃孵育30min；PBS洗两次，细胞重悬后立即用FACS Calibur流式细胞仪检测。数据分析使用flowjo软件，每个样品至少获取10⁵个细胞进行散点图圈门。

通过对多个细胞因子的检测，从图5(A)、(B)、(C)、(D)和(E)可以看出银纳米棒作为疫苗佐剂可有效增强CD107a、IL-2和IL-4的分泌水平，但IFN-gamma和TNF-alpha的分泌水平没有明显增强。

综上所述，本发明非载体佐剂可有效增强HIV蛋白疫苗的抗体IgG与IgG3和细胞CD107a，IL-2，IL-4与TNF-α免疫反应水平；且所述非载体佐剂的细胞毒性极低，几乎不会进入细胞，不影响细胞的正常生长；本发明非载体佐剂相比于其他纳米材料具有更好的生物相容性。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种用于疫苗的非载体佐剂，其特征在于，所述的非载体佐剂为表面经聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮修饰的银纳米棒，所述的银纳米棒的长度为150-300nm，所述的银纳米棒的直径为20-120nm；

所述非载体佐剂的制备方法包括以下步骤：

（1）向持续搅拌的聚乙二醇溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮和硝酸银，继续不断搅拌至试剂完全溶解；

（2）将步骤（1）得到的溶液加热至75-85℃，恒温0.5-3h；

（3）将步骤（2）得到的溶液继续加热至85-95℃，恒温15-30h；

（4）将步骤（3）得到的溶液冷却后用乙醇或水沉淀，再加入水溶解沉淀经20℃水浴超声得到银纳米棒。

2.根据权利要求1所述的非载体佐剂，其特征在于，所述的银纳米棒的长度为180-260nm。

3.根据权利要求2所述的非载体佐剂，其特征在于，所述的银纳米棒的长度为200nm。

4.根据权利要求1所述的非载体佐剂，其特征在于，所述的银纳米棒的直径为50nm。

5.一种制备如权利要求1-4中任一项所述的非载体佐剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（2）将步骤（1）得到的溶液加热至75-85℃，恒温0.5-3h；

（3）将步骤（2）得到的溶液继续加热至85-95℃，恒温15-30h；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述聚乙二醇的浓度为1-50nM。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述聚乙二醇的浓度为3-30 nM。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述聚乙二醇的浓度为10nM。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述聚乙烯吡咯烷酮的浓度为0.1-1mol/L。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述聚乙烯吡咯烷酮的浓度为0.15-0.3 mol/L。

11.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述硝酸银的浓度为0.01-1mol/L。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述硝酸银的浓度为0.05-0.3mol/L。

13.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述的加热温度为80℃，恒温1h。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述的加热温度为90℃，恒温20h。

15.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）向持续搅拌的聚乙二醇溶液中加入浓度为0.1-1mol/L聚乙烯吡咯烷酮和浓度为0.01-1 mol/L硝酸银，继续不断搅拌至试剂完全溶解；

（2）将步骤（1）得到的溶液加热至75-85℃，恒温0.5-3h；

（3）将步骤（2）得到的溶液继续加热至85-95℃，恒温15-30h；

16.一种如权利要求1-4中任一项所述的非载体佐剂在制备增强疫苗和细胞免疫反应的药物中的应用。

17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述非载体佐剂在制备增强HIV蛋白疫苗的抗体和细胞免疫反应的药物中的应用。