CN105168571B - 一种五子衍宗方乙酸乙酯部位的提取方法及其应用 - Google Patents

Abstract

取干燥药材适量，用75%乙醇提取3次，过滤，减压浓缩，石油醚脱脂后，乙酸乙酯萃取至无色，减压浓缩即得五子衍宗方的乙酸乙酯部位（WPEAE）。取注射CTX 12小时后处死小鼠的肝脏，经与正常对照组比较，模型对照组小鼠肝脏系数显著增加（P＜0.01），模型对照组小鼠肝损伤严重，血清ALT、AST水平和肝脏MDA水平明显提高（P<0.05），血清SOD含量明显降低（P<0.05）；WPEAE低、高剂量组可显著改善CTX所致肝脏指数增加和肝脏损伤，明显降低血清ALT和AST水平和MDA水平（P<0.05），明显升高肝脏SOD水平。WPEAE对CTX所致肝损伤具有良好的保护作用。

Description

一种五子衍宗方乙酸乙酯部位的提取方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种五子衍宗方的乙酸乙酯部位的提取方法及其应用，属于生物医药领域。

背景技术

五子衍宗方为补肾益精、壮阳起痿之良方，最早记载于唐代《悬解录》一书，该方由枸杞子、五味子、菟丝子、覆盆子、车前子五种药材组成。现代药理学研究显示，五子衍宗方对生殖系统有明显的改善作用，如可改善小鼠生精功能，提高小鼠睾丸的抗氧化损伤能力，减轻隐睾对生殖功能的损害，改善精子质量。研究报道，五子衍宗方还有神经系统改善作用，如提高小鼠记忆功能，缓解阿尔茨海默病症状等；五子衍宗方还能增强免疫低下小鼠脾脏功能，提高免疫系统功能，还可以促进机体代谢，保护胎儿等。

有研究显示，五子衍宗方对乙醇性肝损伤、脂肪肝等有一定的保护作用李育浩等人通过建立乙醇性肝损伤大鼠模型，五子衍宗方可能是通过降低血、肝LPO水平，纠正肝内脂质代谢继而减少组织细胞的损伤来保护肝脏。五子衍宗方对肝脏影响作用研究较少，具体机制也不清楚。肝脏疾病较多，五子衍宗方是否能对所有肝脏损伤都能起到预防和治疗作用仍需深入研究。

已知，黄酮类化合物和多糖是五子衍宗方的主要活性成分，天然黄酮类化合物有广泛的生理活性，现代药理学研究表明黄酮类化合物具有抗氧化、清除自由基、抗菌、抗病毒等广泛的药理作用。多项研究表明，天然黄酮类化合物对肝脏有保护作用。总黄酮对肝损伤的保护作用越来越受到关注，因此本课题组也在进行相关方面的研究。我们前期研究结果也显示，五子衍宗方对环磷酰胺所致肝损伤具有保护作用，但其有效成分及其作用机制目前尚不十分清楚。有资料显示，黄酮类成分易溶于乙酸乙酯中，因此，本实验旨在研究WPEAE对环磷酰胺所致肝损伤的保护作用及初步作用机制。

发明内容

在以上研究理论的基础上，本课题欲探究WPEAE是否对环磷酰胺(CTX)致肝损伤有保护作用，并通过计算肝脏指数，石蜡包埋，HE染色观察病理学改变，ELISA法检测血清中ALT、AST水平和肝脏组织中SOD、MDA水平来研究其作用机制。

实验动物

SPF级Balb/C雄性小鼠，8周龄，体质量22-25g，湖北省实验动物中心提供。分笼饲养，环境温度(20±2)℃，相对湿度55％～65％，12h光照，啮齿类动物饲料喂养，自由饮水。

药品与试剂

菟丝子、覆盆子、枸杞子、五味子、车前子(均购自本草堂大药房)；注射用环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司；谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、超氧化歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

WPEAE的提取与药物制备

1)将枸杞子，菟丝子，五味子，覆盆子，车前子分别经粉碎、混合，再加入75％乙醇浸泡过夜，第二天回流提取3次，第一次1.5h，第二次1.5h，第三次1h，合并提取液，在旋转蒸发仪上，75℃浓缩至1000ml，得到提取液；

2)将提取液与石油醚依次按体积比1:1、1:1、2:1进行脱脂，直到出现乳化层，超声4min后采用乙酸乙酯按体积比1:1萃取3次，回收乙酸乙酯，提取物干燥后即得五子衍宗方乙酸乙酯部位。

肝损伤模型制备及分组给药

将SPF级的8周龄的Balb/C雄性小鼠随机分为四组：正常对照组、模型对照组、低剂量组和高剂量组。给药组提前3天给药，第3天开始，除正常组注射等量生理盐水外，其余各组均腹腔注射环磷酰胺(CTX)50mg/kg造模，每隔2天给1次，共10次，给药组继续给药。最后一次注射环磷酰胺(CTX)后，禁食不禁水，12小时后处死小鼠。小鼠肝脏系数测定

末次给药12h后，称小鼠体质量，眼球取血后脱颈椎处死，取出肝脏，计算肝脏系数(肝脏系数＝肝脏质量(mg)/体质量(g))。

肝组织组织形态学观察

每只小鼠于肝左叶同一部位取相同大小的肝组织，10％甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜观察小鼠肝组织受损程度。

ALT、AST测定

眼球采血后静置30分钟，低温(4℃)以4000r/min转速离心10分钟，取上清，按试剂盒要求进行测定。

SOD、MDA测定

冰浴条件下用4℃生理盐水冲洗干净，用滤纸吸干称重，加4℃生理盐水制成10％的组织匀浆，将匀浆以3000r/min低温(4℃)离心3次，取上清。按试剂盒要求进行的测定。

统计学处理

数据以平均值±标准偏差(x±S)表示，组间差异采用t-检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

经过灌胃五子衍宗方乙酸乙酯提取物，小鼠的血清ALT、AST活性明显降低，表明五子衍宗方乙酸乙酯提取物能显著降低CTX导致的肝损伤小鼠血清ALT、AST的升高；同时还能减少肝组织中MDA的过量产生，明显增强受损肝组织SOD活性。

五子衍宗方乙酸乙酯提取物对环磷酰胺诱导的肝损伤具有良好的防治作用，其机制可能与提高体内自由基清除剂水平和抗氧化酶的活性有关，以保护机体免受氧自由基的攻击。

附图说明

图1为环磷酰胺对小鼠肝脏系数的影响，注：*P<0.05；**P<0.01(与正常对照组比较)；^#P<0.05，^##P<0.01(与模型对照组比较)。

图2为WPEAE对小鼠肝组织损伤的影响，其中，A为正常组，B为模型组，C为低剂量组，D为高剂量组。

具体实施方式

实施例1

称取4副药材(一副药为：枸杞子40g，菟丝子40g，五味子5g，覆盆子20g，车前子10g)，总重460g，加4000ml 75％乙醇浸泡过夜，第二天回流提取3次，第一次1.5h，第二次1.5h，第三次1h。合并提取液，在旋转蒸发仪(75℃)上浓缩至1000ml。石油醚脱脂，提取液与石油醚体积比1:1开始，根据颜色调整比例，第二次1:1，第三次2:1。出现乳化层，超声4min后再分液，之后乙酸乙酯萃取，1:1萃取3次。回收乙酸乙酯，提取物干燥后计算提取率为0.729％。

一副五子衍宗方总重115g，成年人平均体重60kg，人给生药量为1.92g/kg，小鼠用量约为人的10倍，所以小鼠给生药量为19.2g/kg，按提取率算，低剂量应为140mg/kg，高剂量为280mg/kg。

采用发明内容中的方法对小鼠进行试验得出以下结论：

WPEAE对小鼠肝脏系数的影响

与正常对照组比较可以看出，模型组能非常显著地增大肝脏系数(P＜0.01)，与模型组比较可以看出，不同剂量的WPEAE能不同程度的改善环磷酰胺的这种作用，其中高剂量组的作用极其显著(P＜0.01)，低剂量组的作用较轻微(P＜0.05)(结果见图1)。

WPEAE对小鼠肝组织损伤的影响

从图2A可以看出，正常对照组小鼠肝小叶结构完整、清晰可辨，肝细胞以中央静脉为中心，呈放射状排列，且大小形态无异常；中央静脉及肝血窦未见出血、充血和水肿；肝汇管区没有见到纤维组织增生及炎性细胞浸润，未见明显肝细胞变性。模型对照组小鼠肝小叶和肝索排列混乱，难以分辨；肝细胞肿胀明显、胞浆很疏松、细胞结构辨识不清，有肝细胞坏死(如图2B)。低剂量组小鼠的肝小叶观察到有损伤，但仍有一部分肝小叶排列整齐，肝细胞有炎性细胞浸润，肝细胞肿胀和胞浆疏松(如图2C)。高剂量组肝小叶排列较整齐，肝细胞肿胀和胞浆疏松程度较模型组明显减轻，肝细胞形态均匀，排列规整，与正常组相比无明显差异(如图2D)。

WPEAE对小鼠血清中ALT和AST水平的影响

与正常小鼠相比，注射环磷酰胺的小鼠血清ALT、AST活性及其显著地升高(P<0.01)，说明肝损伤模型建立成功；与模型对照组相比，低剂量组小鼠血清ALT、AST活性显著下降(P<0.05)，高剂量组小鼠可及其显著地降低环磷酰胺所致的小鼠血清ALT、AST活性升高(P<0.01)，结果见表1。

表1 WPEAE对小鼠血清中ALT和AST水平的影响(x±S)

注：*P<0.05；**P<0.01(与正常对照组比较)；^#P<0.05，^##P<0.01(与模型对照组比较)。

WPEAE对小鼠肝组织中SOD、MDA水平的影响

与正常对照组比较，模型对照组能够及其显著地降低肝组织中SOD水平(P<0.01)和极其显著地升高MDA水平(P<0.01)。给药后，与模型对照组相比，低剂量组能显著升高SOD水平和降低MDA水平(P<0.05)；高剂量组能及其显著地升高SOD水平和降低MDA水平(P<0.05)，结果见表2。

表2 WPEAE对小鼠肝组织中SOD、MDA水平的影响(x±S)

注：*P<0.05；**P<0.01(与正常对照组比较)；^#P<0.05，^##P<0.01(与模型对照组比较)。

环磷酰胺(CTX)是一种很强的氮芥类烷化剂，具有广泛的抗肿瘤活性。临床常用于恶性淋巴瘤、急慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤，对乳腺癌、卵巢癌、睾丸肿瘤、肺癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤及骨肉瘤均有一定的疗效。因其属于细胞周期非特异性药物，所以在抑制肿瘤细胞增长的同时，也会对正常细胞产生毒性作用。因此，人们正在研究各种可以抵消或拮抗其毒副作用的方法，以使CTX能在肿瘤的治疗中发挥最大的疗效。据报道，在临床使用CTX过程中出现了严重的肝损伤。并且在实验室中人们也常用CTX以建立肝损伤模型。

CTX诱导的肝脏损伤机制可能与氧化应激有关，氧化应激是机体内氧化、抗氧化平衡稳态被打破，体内活性氧浓度不断升高的一种状态。引起氧化应激反应的机制主要有两种：一种是活性氧增多，另一种是抗氧化防御系统功能降低。据报道，CTX经肝微粒体P450酶系代谢可生成有毒的亲电子物质丙烯醛，其可与体内大分子如蛋白质、核酸和脂质等结合，导致某些功能酶活性改变甚至丧失，使细胞内环境稳态遭到破坏，即造成氧化应激性肝损伤。

当血清中抗氧化防御系统防御能力降低时，使得肝组织中MDA水平升高，较轻者出现脂肪变性，严重者则出现点状或小块状坏死。本实验中，腹腔注射CTX 50mg/kg可使模型组小鼠肝组织中MDA水平显著升高，肝脏组织切片中可见点片状坏死。

丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)在肝脏疾病的诊断中具有重要意义。因为当肝脏有实质性损害时，如肝细胞变性坏死，分布在胞浆中的AST、AST释放入血，故血清中酶含量增高。因此，测定血清中ALT、AST水平可以反应出肝脏的受损伤程度。模型组小鼠注射环磷酰胺后，血清ALT、AST水平明显升高，表明造模成功。经过灌胃五子衍宗方乙酸乙酯提取物，小鼠的血清ALT、AST活性明显降低，表明五子衍宗方乙酸乙酯提取物能显著降低CTX导致的肝损伤小鼠血清ALT、AST的升高；同时还能减少肝组织中MDA的过量产生，明显增强受损肝组织SOD活性。

五子衍宗方乙酸乙酯提取物对环磷酰胺诱导的肝损伤具有良好的防治作用，其机制可能与提高体内自由基清除剂水平和抗氧化酶的活性有关，以保护机体免受氧自由基的攻击。

Claims (1)

1.一种五子衍宗方的乙酸乙酯部位在制备预防和治疗环磷酰胺致肝细胞损伤的药物上的应用，其中治疗过程中五子衍宗方的乙酸乙酯部位的剂量为280mg/kg；所述的五子衍宗方的乙酸乙酯部位的提取方法，包括如下步骤：

1)将枸杞子 40g，菟丝子 40g，五味子 5g，覆盆子 20g，车前子 10g分别经粉碎、混合，再加入75%乙醇浸泡过夜，第二天回流提取3次，第一次1.5 h，第二次1.5 h，第三次1 h，合并提取液，在旋转蒸发仪上，75℃浓缩至1000 ml，得到提取液；

2)将提取液与石油醚依次按体积比1:1、1:1、2:1进行脱脂，直到出现乳化层，超声4min后采用乙酸乙酯按体积比1:1萃取3次，回收乙酸乙酯，提取物干燥后即得五子衍宗方乙酸乙酯部位。