CN106822229B - 一种山豆根多糖有效部位的应用 - Google Patents

一种山豆根多糖有效部位的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种山豆根多糖有效部位的应用，所述的山豆根多糖有效部位，是对山豆根的水提液进行醇沉后分级干燥得到，其中含有总多糖的质量百分比≥65％，含有苦参碱的质量百分比＜0.5％，所述应用是指以所述的山豆根多糖有效部位作为活性成分用于制备治疗乙型肝炎的药物。实验表明：本发明提供的山豆根多糖有效部位，具有显著的抗HBV活性和免疫增强作用，并且安全低毒，因此可望用于制备治疗乙型肝炎的药物，具有明显的应用前景和临床应用价值。

Description

一种山豆根多糖有效部位的应用
技术领域
本发明涉及一种山豆根多糖有效部位的应用，属于医药技术领域。
背景技术
乙型肝炎是一种严重危害人类健康的全球性疾病，据估计全世界有3.5亿人为慢性HBV(乙型肝炎病毒)感染者，每年约有100万人死于因HBV感染所导致的相关疾病。我国是HBV的高流行地区，按2006年全国乙肝血清流行病学调查结果估计，HBV携带者达9300万人。临床实践证明，治疗慢性乙肝的主要环节是抗病毒、保护肝细胞、调控免疫和组织纤维化，其中最关键的问题是抗病毒，然而现在关于乙型肝炎的治疗仍然不是很理想。
山豆根为豆科植物越南槐(Sophora tonkinensis Gagnep)的干燥根和根茎，主要产于广西、广东、贵州等省，性味苦寒，归肺经。药典记载山豆根具有清热解毒，利咽喉，散肿痛的功效。山豆根的主要成分为：生物碱类、黄酮类、有机酸、皂苷和多糖类化合物。药理实验表明，山豆根具有抗肿瘤、抗病毒、抗肝炎、抗心律失常等多方面药理活性，且据研究报道其中所含的生物碱成分多为这些药理活性的物质基础。
但研究表明：山豆根具有肝脏毒性，给予大鼠16g/kg山豆根水煎液可导致明显的肝损伤，且其损伤机制与炎症因子的作用和脂质过氧化有关，与四氯化碳的肝毒性具有一定的相似性(中国实验方剂学杂志，第19卷第18期，2013年9月，第293-296页)。并且临床前研究发现：山豆根既溶于水又溶于乙醇的总提取物(生物碱及黄酮类为主)给小鼠灌胃(25g/kg)，出现呼吸抑制、超大型震颤、抽搐等症状，甚至导致动物死亡。因此，近期开始对山豆根非生物碱成分的活性进行研究，例如：中国专利CN1306854A提出了一种山豆根的水提醇沉部位，具体制备方法是：取山豆根，用水浸泡后加热提取，再经0～3次热水提取后，过滤，合并水提液，浓缩，加乙醇，取醇沉部分即得。”该专利指出山豆根中的水提醇沉物是以多糖等大分子物质为主的非生物碱部分；另外，该专利的实验表明：山豆根中的水提醇沉物可降低对CCL4所造成的急性肝损伤，可使大鼠死亡率由30％下降到10％，具有护肝和免疫调节作用。但至今未见关于山豆根多糖有效部位的急性毒性和肝脏毒性的研究报道及毒性降低后该部位的药用价值的研究报道。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种山豆根多糖有效部位的应用，以拓宽山豆根的应用范围。
本发明所述的山豆根多糖有效部位，是对山豆根的水提液进行醇沉后分级干燥得到，其中含有总多糖的质量百分比≥65％，含有苦参碱的质量百分比＜0.5％，本发明所述的山豆根多糖有效部位的应用，是指以所述的山豆根多糖有效部位作为活性成分用于制备治疗乙型肝炎的药物。
进一步说，以所述的山豆根多糖有效部位作为活性成分用于制备治疗由乙肝病毒(HBV)引起的病毒性乙型肝炎的药物。
作为优选方案，所述山豆根多糖有效部位中含有总多糖的质量百分比≥70％。
作为进一步优选方案，所述山豆根多糖有效部位中含有总多糖的质量百分比≥85％。
作为优选方案，所述的山豆根多糖有效部位的制备，包括如下具体步骤：
a)取山豆根药材，用水煎煮，制备山豆根水煎液；
b)在75～80℃，对山豆根水煎液进行减压浓缩至浓度为1～2kg/L，然后在95～100℃下进行常压加热1～2小时，再冷却至室温，制得山豆根水提液；
c)向步骤b)所得山豆根水提液中加入体积分数为90～100％的乙醇，边加边搅拌，至最终乙醇的体积分数为75～85％，静置，收集沉淀物；
d)对所得沉淀物进行分级减压干燥：先在80±2℃下减压干燥10～14小时，然后在75±2℃下减压干燥至全干，即得所述山豆根多糖有效部位。
作为进一步优选方案，所述山豆根水煎液的制备，包括如下操作：
将山豆根药材，加水浸泡后加热到95～100℃，进行1～3次煎煮，每次煎煮时间为0.5～1.5小时。
作为优选方案，每次煎煮，加水的重量为山豆根药材重量的4～8倍。
本发明所述药物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达体内的剂型都是可以的。比如可选自：片剂、胶囊剂、粉末、颗粒剂、糖浆、溶液、悬浮液、注射剂、酊剂、口服液、气雾剂、口含剂、冲剂、丸剂、散剂等常见剂型或纳米制剂等缓释剂型。
与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：
本发明的研究结果显示：本发明提供的山豆根多糖有效部位，具有显著的抗HBV活性和免疫增强作用，并且安全低毒，因此可望用于制备治疗乙型肝炎的药物，尤其是，可望用于制备治疗由乙肝病毒(HBV)引起的病毒性乙型肝炎的药物，具有明显的应用前景和临床应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例和对比例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例：山豆根多糖有效部位的制备
a)取山豆根饮片8kg，用48kg水浸泡60min，然后加热回流煎煮1h，煎煮液200目过滤，药渣再加入48kg水加热回流煎煮1h，煎煮液200目过滤，合并两次滤液，得到山豆根水煎液；
b)在75～80℃下，对山豆根水煎液进行减压浓缩至浓度为1.5kg/L，然后在98℃下进行常压加热1.5小时，再冷却至室温，制得山豆根水提液；
c)向步骤b)所得山豆根水提液中加入体积分数为95％的乙醇，边加边搅拌，至最终乙醇的体积分数为80％，静置，收集沉淀物；
d)对所得沉淀物进行分级减压干燥：先在80℃下减压干燥12小时，然后在75℃下减压干燥至全干，即得所述山豆根多糖有效部位728.8g，产率为9.11％。
采用苯酚—硫酸法，用分光光度法测定，以葡萄糖计，所述山豆根多糖有效部位中含糖量为88wt％。
经HPLC分析：所述山豆根多糖有效部位中含苦参碱(MT)的含量为0.46wt％，含氧化苦参碱(OMT)的含量为0.046wt％。
对比例：山豆根水提醇沉部位的制备
参照中国专利CN1306854A实施例1：
称取剪碎的山豆根8kg，用12倍剂量水浸泡过夜，加热提取2h，倾出水液，趁热离心(3000r/min，l0min)，药渣继续加10倍、8倍剂量水分别加热提取1.5h、1h，各自倾出水液趁热离心，将水液逆梯度浓缩至1：1(1g生药相当于1mL)，加入体积分数为95％的乙醇使含醇量达80％，低温静置过夜后离心，沉淀加1：50热水溶解后再离心，取水液加入体积分数为95％的乙醇使醇量达80％，低温静置过夜后离心，沉淀加95％乙醇搅拌再离心，沉淀真空干燥(40℃)，得山豆根水提醇沉部位257.6g，产率为3.20％。
采用苯酚—硫酸法，用分光光度法测定，以葡萄糖计，所述山豆根水提醇沉部位中含糖量为58wt％。
经HPLC分析：所述山豆根水提醇沉部位中含苦参碱(MT)的含量为0.65wt％，含氧化苦参碱(OMT)的含量为0.132wt％。
一、抗HBV活性试验
(1)HepG2.2.15细胞培养及上清收取
将HepG2.2.15细胞2×104/孔接种于96孔培养板中，37℃培养24小时，分别加入实施例制备的山豆根多糖有效部位和对比例制备的山豆根水提醇沉部位，终浓度分别为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL，每个浓度三复孔，并设无药物对照孔。培养四天后弃上清换药；第八天收取上清，冻存待测。于96孔培养板中加入MTT(5mg/mL，Sigma)，继续培养4小时后，加入MTT溶解液孵育过夜，酶标仪上570nm测定OD值。计算细胞生存率，观察药物对HepG2.2.15细胞的毒性。
Figure BDA0000865902170000041
(2)实时定量PCR法检测培养上清中乙型肝炎病毒DNA水平
培养上清50μL，加入等体积病毒DNA提取液，混匀后煮沸10min，然后于室温10，000rpm离心5分钟，取2μL上清加入含引物、荧光探针和聚合酶的PCR反应液中用于PCR扩增，同时设置标准样品，做标准曲线。
PCR primers：P1:'ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT3’；
P2：5’ACAGTGGGGAAAGCCCTACGAA3’.
The probe：5’TGGCTAGTTTACTAGTGCCATTTTG3’
根据HBV标准品DNA模板数测定样品中DNA模板数。药物对HepG2.2.15细胞培养上清中乙肝病毒DNA影响水平按下式计算：
Figure BDA0000865902170000042
实验结果见表1所示。
表1试样对HBV细胞的生存率和DNA抑制率
Figure BDA0000865902170000051
由表1可见：本发明的山豆根多糖有效部位对乙型肝炎病毒转染细胞株(HBV-HepG2.2.15细胞)的HBV-DNA的复制抑制率可达到64％，且具有浓度依赖性，而山豆根水提醇沉部位对HBV-DNA的复制抑制率最高达到46％，并且无浓度依赖性，这表明本发明的山豆根多糖有效部位相较于山豆根水提醇沉部位具有显著的抗乙型肝炎病毒(HBV)活性。
二、对正常小鼠淋巴细胞免疫调节活性的体外试验
通过观察实施例制备的山豆根多糖有效部位和对比例制备的山豆根水提醇沉部位，对丝裂原ConA诱导的小鼠T淋巴细胞增殖功能的影响，研究其免疫调节作用。
(1)脾淋巴细胞制备：BALB/C小鼠脱脊椎处死，无菌取其脾脏，制成单细胞悬液，去除红细胞后，用含10％FBS的RPMI-1640培养液调节细胞浓度；
(2)淋巴细胞增殖实验：于96孔细胞培养板中加入淋巴细胞悬液4×105个/孔，50μL ConA(终浓度5μg/mL)，取山豆根多糖有效部位和山豆根水提醇沉部位，分别配制成终浓度分别为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL的给药溶液；每个浓度三复孔，每孔总体积为200μL，并设相应的无ConA对照孔以及无药物对照孔；37度，5％CO2，培养48小时；培养结束前8小时，每孔加入25μL 3H-胸腺嘧啶核苷酸(10μCi/mL)；继续培养至实验结束；将细胞用细胞收集仪收集至玻璃纤维膜上，加入闪烁液后于Beta记数仪(MicroBeta Trilux,PerkinElmer)读取掺入细胞DNA的3H-TdR量，以cpm值代表细胞增殖的情况，试验结果见表2所示。
表2对ConA诱导小鼠T淋巴细胞增殖作用的影响比较
Figure BDA0000865902170000061
表中，与对照组比较，＊＊＊p<0.001。
由表2可见：山豆根多糖有效部位组对ConA诱导的正常小鼠T淋巴细胞的增殖作用较对照组具有显著性，且具有浓度依赖性；说明，本发明的山豆根多糖有效部位能促进ConA诱导的正常小鼠T淋巴细胞的增殖反应，对小鼠的细胞免疫功能具有显著的增强作用。
三、对免疫低下小鼠的体内试验
通过观察实施例制备的山豆根多糖有效部位和对比例制备的山豆根水提醇沉部位，对经辐照所致免疫低下的小鼠模型的调节功能，研究其在整体动物上的免疫增强作用。
BALB/C小鼠体重在18-22g时候照射X光，照射条件3GRADE.照射时间三分钟；照射后根据体重随机分成5组，分别为：正常组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组；给药两周，用0.3％的CMC-Na助悬提取物使其浓度分别为25mg/kg，50mg/kg和100mg/kg。试验结果如下：
(1)体征及体重
在造模十五天后，模型小鼠表现出明显的体重下降，毛色无光，倦怠少动少食；而给药组的各老鼠的上述症状相对于模型组来说均得到缓解和改善。
给药十五天后，模型组小鼠的体重与对照组相比，p<0.01，表明模型组与正常组有显著性差异，说明造模成功。但各给药组与模型组比较，p>0.05，都有体重恢复的趋势，详细结果见表3所示。
表3对免疫低下小鼠模型的体重影响
Figure BDA0000865902170000071
表中，与模型组比较，＊＊p<0.01。
由表3可见：山豆根多糖有效部位组对免疫低下小鼠模型的体重具有恢复作用，且作用效果略高于山豆根水提醇沉部位组。
(2)免疫器官的大小形态以及胸腺脾指数
将小鼠托颈椎处死，观察脾脏大小并称重，详细结果见表4所示。
表4对免疫低下小鼠脾脏重量的影响
Figure BDA0000865902170000072
表中，与模型组比较，＊p<0.05，＊＊p<0.01。
由表4可见：模型组脾脏较对照组小，并且p<0.01，说明造模成功；但山豆根多糖有效部位组和山豆根水提醇沉部位组与模型组相比有上升趋势，尤其是山豆根多糖有效部位的25mg/kg剂量组与模型组相比，p<0.05，具有显著性差异，说明山豆根多糖有效部位的25mg/kg剂量组具有明显的免疫增强作用。
摘取小鼠的胸腺和脾脏用滤纸吸干残血后测质量，然分别除以小鼠体质量再乘以10得到胸腺指数和脾脏指数，详细结果如表5所示。
表5对免疫低下小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响
Figure BDA0000865902170000081
表中，与模型组比较，＊p<0.05。
由表5可见：模型组的胸腺脾指数较对照组，p<0.05，说明免疫低下模型造模成功；但山豆根多糖有效部位组和山豆根水提醇沉部位组在给药后都能刺激小鼠脾脏胸腺质量的增加，并且山豆根多糖有效部位组胸腺指数增加更为明显，尤其25mg/kg山豆根多糖有效部位组的胸腺指数增加具有统计学差异，说明本发明的山豆根多糖有效部位对免疫低下小鼠具有显著免疫增强作用，且免疫增强作用明显高于山豆根水提醇沉部位。
四、ConA刺激小鼠脾脏细胞的增殖试验
为了证实山豆根多糖有效部位和山豆根水提醇沉部位的免疫增强能力是否存在浓度依赖性，进一步进行ConA刺激小鼠脾脏细胞的增殖实验：
给药一小时后，将不同组别的小鼠脱颈椎处死；取出脾脏磨脾，小鼠脾脏淋巴细胞4×105个/孔接种于96孔板中，同时加入ConA，使其终浓度为0.5μg/mL，每个样品三复孔，每孔总体积为200μL；5％CO2培养箱中培养48h，培养结束前8h掺入0.25μLCi3H-thymidine，培养结束时，将培养板冻存于-20℃冰箱；测定时将冻融的细胞用细胞收集仪收集至玻璃纤维膜上，加入闪烁液后于Beta计数仪读取掺入细胞DNA的3H-thymidine，以cpm值代表细胞增殖情况；详细结果如表6所示。
表6体内细胞增殖实验结果
Figure BDA0000865902170000091
表中，与模型组比较，＊p<0.05，＊＊p<0.01，＊＊＊p<0.001。
由表6可见：山豆根多糖有效部位组和山豆根水提醇沉部位组两组给药组与模型组相比较均能提高脾脏中免疫细胞的增殖能力，且具有浓度依赖关系。
结合表2至表6可见：本发明的山豆根多糖有效部位具有很好的免疫增强作用，并且其活性还优于山豆根水提醇沉部位；由于本发明的山豆根多糖有效部位具有很好的免疫增强作用，因而可进一步促进对乙型肝炎的治疗，可实现从根本上治疗乙型肝炎的目的。
五、毒性测试试验
将实施例制备的山豆根多糖有效部位和对比例制备的山豆根水提醇沉部位，分别作用于处理至5dpf(受精后5天)的野生型AB系斑马鱼，评价其急性毒性和肝脏毒性。
用待测药物处理一定阶段的野生型AB系斑马鱼幼鱼到5dpf，设置系列浓度，同时设置空白对照组，每个浓度均处理30尾斑马鱼。药物处理期间，每天统计各实验组的斑马鱼死亡数量并及时移除，通过OriginPro 8.0软件拟合浓度-致死曲线经过曲线拟合，可以求得LC50、LC10，测试结果见表7～9所示。
表7山豆根多糖有效部位诱发的斑马鱼死亡率(n＝30)
浓度(μg/mL) 用鱼数(尾) 死亡数(尾) 死亡率(％)
2500 30 0 0
3000 30 0 0
3500 30 1 3.3
4000 30 2 6.7
4500 30 5 16.7
5000 30 30 100
表8山豆根水提醇沉部位诱发的斑马鱼死亡率(n＝30)
浓度(μg/mL) 用鱼数(尾) 死亡数(尾) 死亡率(％)
600 30 0 0
800 30 1 3.3
1000 30 22 73.3
1200 30 30 100
1400 30 30 100
表9毒性比较
Figure BDA0000865902170000101
结合表7至表9可见：诱发的斑马鱼100％死亡率需要的山豆根多糖有效部位的浓度(5000μg/mL)要远远高于山豆根水提醇沉部位的浓度(1200μg/mL)，在急性毒性实验中，山豆根多糖有效部位的LC10和LC50值均为山豆根水提醇沉部位的LC10和LC50值的5倍，且在肝脏毒性实验中，山豆根多糖有效部位的LC10值也为山豆根水提醇沉部位的LC10值的5倍多；说明，本发明通过合理控制山豆根多糖有效部位中的苦参碱的含量，明显降低了毒性，相对于现有技术，取得了显著性进步，对研究开发具有临床应用价值的山豆根药物制剂具有重要意义。
综上实验可见：本发明的山豆根多糖有效部位既具有显著的抗HBV活性，同时还具有显著的免疫增强作用，可从根本上提高免疫力，降低HBV病毒的入侵和复制，通过两者相结合，可以实现治疗乙型肝炎，尤其可实现治疗由乙肝病毒(HBV)引起的病毒性乙型肝炎；并且，本发明的山豆根多糖有效部位安全低毒，具有明显的应用前景和临床应用价值。
最后需要在此指出的是：以上仅是本发明的部分优选实施例，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种山豆根多糖有效部位的应用，其特征在于：所述的山豆根多糖有效部位，是由山豆根的水提液进行醇沉后进行分级干燥得到，其中：总多糖的含量为88wt％，苦参碱的含量为0.46wt％，氧化苦参碱的含量为0.046wt％，所述应用是指以所述的山豆根多糖有效部位作为活性成分用于制备治疗乙型肝炎的药物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：以所述的山豆根多糖有效部位作为活性成分用于制备治疗由乙肝病毒(HBV)引起的病毒性乙型肝炎的药物。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的山豆根多糖有效部位的制备，包括如下具体步骤：
a)取山豆根药材，用水煎煮，制备山豆根水煎液；
b)在75～80℃，对山豆根水煎液进行减压浓缩至浓度为1～2kg/L，然后在95～100℃下进行常压加热1～2小时，再冷却至室温，制得山豆根水提液；
c)向步骤b)所得山豆根水提液中加入体积分数为90～100％的乙醇，边加边搅拌，至最终乙醇的体积分数为75～85％，静置，收集沉淀物；
d)对所得沉淀物进行分级减压干燥：先在80±2℃下减压干燥10～14小时，然后在75±2℃下减压干燥至全干，即得所述山豆根多糖有效部位。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述山豆根水煎液的制备，包括如下操作：将山豆根药材，加水浸泡后加热到95～100℃，进行1～3次煎煮，每次煎煮时间为0.5～1.5小时。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：每次煎煮，加水的重量为山豆根药材重量的4～8倍。
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