CN105164257A

CN105164257A - 用于植物的转化方法的土壤杆菌属细菌

Info

Publication number: CN105164257A
Application number: CN201480024753.4A
Authority: CN
Inventors: 今山辉之; 樋江井佑弘; 石田佑二
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2013-03-29
Filing date: 2014-03-27
Publication date: 2015-12-16
Anticipated expiration: 2034-03-27
Also published as: JP2016111926A; EP2980214A4; US20160083737A1; CN105164257B; US10266835B2; WO2014157541A1; EP2980214A1; EP2980214B1

Abstract

本发明涉及一种含有3种质粒的、用于植物的转化方法的土壤杆菌属细菌。本发明的土壤杆菌属细菌含有下述(1)～(3)的质粒：(1)具有下述构成要素的质粒；(i)pTiBo542的virB基因、virC基因、virD1基因、virD2基因、virD3基因、virG基因及virJ基因，及(ii)复制起点，(2)土壤杆菌属细菌的卸甲型Ti质粒或卸甲型Ri质粒；以及(3)具有由期望的DNA构成的T-DNA区域的质粒；这里，(1)～(3)的各质粒具有能够相互共存的复制机理。

Description

用于植物的转化方法的土壤杆菌属细菌

技术领域

本申请主张基于2013年3月29日提出的日本申请特愿2013-072177的优先权，在本说明书中引入其全部内容。

本发明涉及含有3种质粒的、用于植物的转化方法的土壤杆菌属细菌及其用途。

背景技术

对于植物的转化而言，通常利用向植物细胞导入外来DNA的技术，使得能够在结果种子的后代或营养繁殖体中保持并表达外来基因。使用该技术，实际上能够对非常多的单子叶植物、双子叶植物进行转化。对于转化作物而言，除了玉米、水稻、小麦、大麦、高梁、大豆、油菜籽、向日葵、棉花、马铃薯、番茄等，还能制作水果类、其它的蔬菜类，在商业上也很受关注。

在植物的转化方法中，已知有聚乙二醇法、电穿孔法、基因枪法等物理/化学的方法(DNA的直接导入法)和利用土壤杆菌属细菌具有的功能的生物学的方法(DNA的间接导入法)。在直接导入法中，高频率地发生使目的基因片段化而导入的、多拷贝导入的现象。因此，高频率地出现未表达目的基因的转化体、较弱地显示出异常表达(基因沉默)的转化体。另外，在使用原生质体的方法中，由于培养时间长期化，因此，在得到的转化体中，容易发生培养变异引起的种子不结果或畸形等。相比之下，经由土壤杆菌属细菌的基因导入法不容易发生这样的问题。在土壤杆菌属法中，通过控制Ti或Ri质粒的病原性区域(vir区域)中的基因群的表达来导入目的基因。根据vir基因所编码的蛋白质群，目的基因经过植物细胞与细菌的相互作用的识别和信号转导、vir基因的表达诱导、IV型分泌通路的形成、T-DNA边界重复序列的识别、T-DNA链的形成、T-DNA链向植物细胞的转移和向核的转移、以及T-DNA向植物核基因组的插入等多个过程而导入。因此，较低地保持目标基因的导入拷贝数，发生片段化而导入的情况较少。其结果是，在得到的转化体中目标基因高表达的个体数量多且能稳定地得到，与直接导入法相比，存在表达量的个体之间差异较小的巨大优点。

这样，土壤杆菌属法是非常优异的植物转化方法，但是，实际情况是转化的能否成功以及效率依赖于植物种类、基因型以及使用的植物组织，有很大差异(Potrykusetal.,1997)。仍然不能以充分的效率进行转化的植物还有很多，在现实情况下，可以容易地获得多个转化体的作物的种类仅限定于一部分。因此，强烈地期望能够解决这样问题的改进方法。

迄今为止开发了各种转化用载体，进行了解决上述问题的努力。以下，对与载体开发有关的背景进行说明。原来，野生型土壤杆菌属的Ti质粒巨大，为190kb以上，因此，在标准的基因工程的方法中，难以在质粒上的T-DNA中插入基因。因此，开发了用于在T-DNA上插入外来基因的方法。首先，制作了作为具有从肿瘤性的Ti质粒的T-DNA中除去了植物成长调节物质合成基因的卸甲型Ti质粒的菌系的LBA4404(Hoekemaetal.,1983)、GV3850(Zambryskietal.,1983)、GV3TillSE(Fraleyetal.,1985)、C58-Z707(Hepburnetal.,1985)、GV3101::pMP90(KonczandSchell,1986)、GV3101::pMP90RK(KonczandSchell,1986)、GV2260(McBrideandSummerfelt,1990)、NTI(pKPSF2)(Palanichelvametal.,2000)等。

而且，通过使用这些菌株，开发了将期望的基因导入土壤杆菌的Ti质粒的T-DNA中、或者将具有期望的基因的T-DNA导入土壤杆菌的两种方法。其中一种方法被称为中间载体法(Fraleyetal.,1983)，基因操作容易且可以插入期望的基因，是通过三系杂交法(Dittaetal.,1980)经由同源重组将能够用大肠杆菌复制的中间载体导入土壤杆菌的卸甲型Ti质粒的T-DNA中同源重组的方法。另一种方法被称为双元载体法，该方法基于以下结果(LeeandGelvin，2008)：虽然在T-DNA向植物的插入中需要vir区域，但为了使其发挥作用，并不需要存在于与T-DNA相同的质粒上(Hoekemaetal.,1983)。在该vir区域中存在virA、virB、virC、virD、virE及virG等。双元载体是将T-DNA插入于在土壤杆菌和大肠杆菌两者中均能复制的小质粒中而得到的，将其导入具有卸甲型Ti质粒的土壤杆菌来使用。将双元载体导入土壤杆菌可以使用电穿孔法、三系杂交法等方法。在双元载体中存在pBIN19(Bevan,1984)、pBI221(Jefferson,1987)、pGA482(Anetal.,1988)等，以此为基础能够构建大量新双元载体，可以用于转化(LeeandGelvin，2008)。

土壤杆菌属A281(Watsonetal.,1975)是强病原性(super-virulence)的菌株，其宿主范围广，转化效率高于其它菌系(Komarietal.,1986)。该特性依赖于具有A281的Ti质粒的pTiBo542(Jinetal.,1987)。

迄今为止开发了使用pTiBo542的3种转化系统。第一种是使用了具有pTiBo542的卸甲型Ti质粒的菌系EHA101(Hoodetal.,1986)、EHA105(Hoodetal.,1993)、AGL0(Lazoetal.,1991)或AGL1(Lazoetal.,1991)的转化系统。通过将这些菌系应用于上述的双元载体系统，可以作为转化能力高的系统而应用于各种植物的转化。

第二种是超级双元载体系统(super-binaryvector)(Hieietal.,1994；Ishidaetal.,1996)。由于该系统由具有vir区域(全部的virA、virB、virC、virD、virE及virG、virJ)的卸甲型Ti质粒和具有T-DNA的质粒构成，因此是双元载体系统的一种。但是，在使用将从pTiBo542的vir区域被切下的14.8kb的KpnI片段(virD1基因的一部分、virB基因、virC基因及virG基因)插入(Komari,1990)具有T-DNA侧的质粒、即双元载体中而形成的超级双元载体方面不同。该KpnI片段在最初的论文中被认为是15.8kb(Jinetal.,1987)，但准确而言为14.8kb。需要说明的是，为了在具有超级双元载体的土壤杆菌中导入插入了期望的基因的T-DNA区域，可以使用经由三系杂交法的同源重组来作为容易的方法(Komarietal.,1996)。已知该超级双元载体系统在许多植物种类中具有非常高的转化效率(Saitoetal.,1992；Hieietal.,1994；Ishidaetal.,1996)。报导了特别是在玉米的转化中，超级双元载体系统表现出卓越的效果(Ishidaetal.,1996)。另外，KhannaandDaggard(2003)在通过使用不是强病原性的土壤杆菌属菌株LBA4404和超级双元载体pHK21的组合，成功地获得了用LBA4404和通常的双元载体pHK22的组合完全无法得到的小麦转化体。

第三种是将在质粒上具有从pTiBo542的vir区域被切下的14.8kb的KpnI片段(virD1的一部分、virB、virC及virG)的质粒pTOK47(Jinetal.,1987)作为用于提高转化效率的加强载体(boostervector)追加导入双元载体系统的系统。通常，在双元载体系统中进一步追加加强载体的载体系统被称为“三元载体系统”，但是由于该系统在加强载体中含有上述14.8kb的KpnI片段，因此，在本说明书中将其特别称为“超级三元载体(super-ternaryvector)系统”。在该系统中，分别使用能在土壤杆菌属内共存的不亲合性组具有不同复制起点(ori)的质粒。在各自的ori中，Rep蛋白质(起始子)的编码区域是必须的，通常使其接近而使用。报导了利用pTOK47的超级三元载体系统在许多植物种类中显示出较高的转化效率(Wencketal.,1999；Tang，2003；DongandQu，2005；Arokiarajetal.,2009)。pTOK47的复制起点(ori)是IncW不亲合性组，在具有利用这些三元载体系统的报导例的T-DNA的质粒中主要使用了属于IncP不亲合性组的ori。报导了在超级双元载体系统中，使用了加强载体pTOK47的超级三元载体系统稍差，但在玉米的转化中是有用的(WO2007/148819A1)。另外，有如下报道(Amoahetal.,2001；Wuetal.,2008)：与pTOK47同样地，将来自pTiBo542vir区域的14.8kbKpnI片段使用配置在与具有T-DNA的质粒不同的质粒上的超级三元载体系统进行了小麦的转化。Amoahetal.(2001)和Wuetal.(2008)使用的载体系统由虽然仅具有IncWori但是缺乏其rep基因的pGreen(Hellensetal.,2000)、以及在反式部分具有IncW的rep基因且在自身复制中具有需要的IncP的oriV的pSoup(Hellensetal.,2000)构成。即，采用了pSoup以补充pGreen的复制的形式在土壤杆菌中稳定地保持两者的质粒的结构。因此，特别被称为双重双元载体系统。但是，实际上可以认为是由卸甲型Ti质粒、双元载体pSoup及三元载体pGreen的3种质粒构成的超级三元载体系统。

与pTiBo542的vir区域有关的见解

Jinetal.(1987)使各种长度的super-vir(pTiBo542的vir区域)附加性地保持在土壤杆菌中，评价了冠瘿的形成能力。该试验中，与通常的菌株A348一起使用了具有super-vir全部区域的强病原性菌株A281。其结果表明：在任一种菌株中，对于提高转化能力(冠瘿形成能力)而言，super-vir的virB和virG的附加是重要的。其另一方面，关于virD或virE区域，没有观察到附加效果(Jin,S.,Komari,T.,Gordon，M.P.,andNester,E.W.(1987).GenesresponsibleforthesupervirulencephenotypeofAgrobacteriumtumefaciensA281.J.Bacteriol.169,4417-4425.Table3及Figure3)。

另外，Hieietal.(1994)使用强病原性菌株A281的卸甲型菌株EHA101(pIG121Hm)、以及不仅具有通常的病原性(通常的vir全区域)还在双元载体上保持了super-vir的一部分(virB、virC、virG)的超级双元载体LBA4404(pTOK233)，比较了对水稻的转化能力。其结果确认了后者的转化效率更高。该情况表明：关于将super-vir区域用于转化用载体而言，与使用全部区域相比，使用一部分区域(virB和virG)的转化能力更高。

关于virD，virD1和virD2在边界序列中形成缺口，产生T-DNA，特别是virD2与T-DNA形成复合体。可以认为virD3的保存性较低，在T-DNA的转移中不需要。virD4与virB基因群一起构成IV型分泌系统。可以认为virD5是具有IV型分泌系统的信号功能的附属蛋白质(Ream,W.(2008).ProductionofamobileT-DNAbyAgrobacteriumtumefaciens.InAgrobacterium,T.TzfiraandV.Citovsky,eds(NewYork:SpringerScience+BusinessMedia,LLC)，pp.280-313.)。

通常，对于载体而言，较小者容易进行插入期望的DNA等的操作，因此优选小型的载体。另外，推测大肠杆菌可以稳定地保持的外来DNA为每细胞1200～1500kb(Tao,Q.,andZhang,H.-B.(1998).CloningandstablemaintenanceofDNAfragmentsover300kbinEscherichiacoliwithconventionalplasmid-basedvectors.NucleicAcidsResearch264901-4909)。因此，大肠杆菌不能稳定地保持一定大小以上的质粒。例如，对于具有来自ColE1的复制起点的质粒而言，每大肠杆菌细胞存在30～40拷贝，因此，不能保持大于30～40kb的质粒。

关于pTiBo542的vir区域，没有见解特别表明virD区域和virJ区域对使用土壤杆菌属细菌的转化是有用的。

现有技术文献

专利文献

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发明内容

发明所要解决的课题

土壤杆菌法是非常优异的植物的转化方法，但是转化的能否成功以及效率依赖于植物种类、基因型以及使用的植物组织，有很大差异(Potrykusetal.,1997)。仍然不能以充分的效率进行转化的植物还有很多，可以容易地获得多个转化体的作物的种类仅限定于一部分。因此，强烈地期望能够解决这样问题的改进方法。

本发明的目的在于，提供一种能够使对植物的基因导入效率和转化效率较高的、利用了新型超级三元系统的土壤杆菌属细菌及使用了该土壤杆菌属细菌的植物的转化方法。

用于解决课题的方法

本发明包含以下的方式作为优选方式，但并不限定于此。

[方式1]

一种土壤杆菌属细菌，其含有下述的(1)～(3)的质粒：

(1)具有下述构成要素的质粒；

(i)pTiBo542的virB基因、virC基因、virD1基因、virD2基因、virD3基因、virG基因及virJ基因、以及

(ii)复制起点

(2)土壤杆菌属细菌的卸甲型Ti质粒或卸甲型Ri质粒；以及

(3)具有由期望的DNA构成的T-DNA区域的质粒，

这里，(1)～(3)的各质粒具有能够相互共存的复制机理。

[方式2]

根据方式1所述的土壤杆菌属细菌，其中，(1)质粒的(ii)的复制起点为IncW复制起点。

[方式3]

根据方式1或2所述的土壤杆菌属细菌，其中，(1)质粒还含有pTiBo542的virE基因。

[方式4]

根据方式1～3中任一项所述的土壤杆菌属细菌，其中，(1)质粒还含有repA基因。

[方式5]

根据方式1～4中任一项所述的土壤杆菌属细菌，其中，(1)质粒还含有药物选择标记基因。

[方式6]

根据方式5所述的土壤杆菌属细菌，其中，药物筛选标记基因为庆大霉素抗性基因。

[方式7]

根据方式1～6中任一项所述的土壤杆菌属细菌，其中，(1)质粒为具有SEQIDNO(序列号)：1所述的碱基序列的pVGW9。

[方式8]

根据方式1～7中任一项所述的土壤杆菌属细菌，其中，(2)土壤杆菌属细菌的卸甲型质粒为卸甲型Ti质粒。

[方式9]

根据方式1～8中任一项所述的土壤杆菌属细菌，其不保持卸甲型pTiBo542。

[方式10]

根据方式1～9中任一项所述的土壤杆菌属细菌，其是通过向选自LBA4404、GV3850、GV3TillSE、C58-Z707、GV3101::pMP90、GV3101::pMP90RK、GV2260及NTI(pKPSF2)中的土壤杆菌属细菌中导入(1)质粒及(3)质粒来制造的。

[方式11]

一种土壤杆菌属细菌，其含有下述的(1)～(2)的质粒：

(1)具有下述构成要素的质粒；

(ii)复制起点，以及

(2)土壤杆菌属细菌的卸甲型Ti质粒或卸甲型Ri质粒，

这里，(1)和(2)的各质粒具有能够相互共存的复制机理。

[方式12]

一种植物的转化方法，该方法包括：使方式1～10中任一项的土壤杆菌属细菌与植物细胞接触。

[方式13]

一种植物的转化方法，该方法包括：在方式11的土壤杆菌属细菌中导入(3)具有由期望的DNA构成的T-DNA区域的质粒，并且使该土壤杆菌属细菌与植物细胞接触。

[方式14]

根据方式12或13所述的植物的转化方法，其中，植物为被子植物。

[方式15]

一种试剂盒，其用于通过土壤杆菌转化植物细胞的方法，所述试剂盒包含方式1～10或方式11中任一项所述的土壤杆菌属细菌。

[方式16]

一种试剂盒，其用于通过土壤杆菌转化植物细胞的方法，所述试剂盒包含下述(1)～(3)的质粒的组合：

(1)具有下述构成要素的质粒；

(ii)复制起点，

(2)土壤杆菌属细菌的卸甲型Ti质粒或卸甲型Ri质粒；以及

(3)具有由期望的DNA构成的T-DNA区域的质粒，

这里，(1)～(3)的各质粒具有能够相互共存的复制机理。

[方式17]

一种试剂盒，其用于土壤杆菌转化植物细胞的方法，其中，所述试剂盒包含下述(1)和(3)的质粒的组合：

(1)具有下述构成要素的质粒；

(i)pTiBo542的virB基因、virC基因、virD1基因、virD2基因、virD3基因、virG基因及virJ基因，及

(ii)复制起点，以及

(3)具有由期望的DNA构成的T-DNA区域的质粒；

这里，(1)和(3)的各质粒具有能够相互共存的复制机理。

[方式18]

根据方式17所述的试剂盒，其还含有选自LBA4404、GV3850、GV3TillSE、C58-Z707、GV3101::pMP90、GV3101::pMP90RK、GV2260、及NTI(pKPSF2)中的土壤杆菌属细菌。

[方式19]

一种pVGW9质粒，其具有SEQIDNO：1所述的碱基序列。

[方式20]

方式19所述的质粒的用途，其用于方式12～14中任一项所述的植物的转化方法。

发明的效果

使用利用了本发明的系统的土壤杆菌属细菌的植物的转化方法与使用公知的加强载体的(超级)三元载体系统、超级双元系统的情况相比，转化效率提高。特别是在玉米中显示出显著的效果。

附图说明

图1是pVGW9质粒的示意图。

图2是本发明的超级三元载体系统的示意图。

图3是pVGW2质粒的示意图。

图4是pGW质粒的示意图。

图5是pGWL质粒的示意图。

图6是pVGW7质粒的示意图。

图7是来自pTiBo542的vir区域附加于加强载体的示意图。

图8是pLC41GWH质粒的示意图。

图9是pLC41GWH-IG质粒的示意图。

图10示出了用超级三元载体系统向玉米A188进行基因导入的结果。

具体实施方式

I.土壤杆菌属细菌

本发明涉及一种用于在植物的转化的土壤杆菌属细菌。

本说明书中，土壤杆菌属细菌为在根瘤菌属(Rhizobium)中具有对植物的病原性的细菌的总称，包含分类为根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的细菌。本发明的土壤杆菌属细菌不含有野生型的Ti质粒和野生型的Ri质粒。

本发明的土壤杆菌属细菌的特征在于含有下述的(1)～(3)的三种质粒。

(1)具有下述构成要素的质粒；

(ii)复制起点

(2)土壤杆菌属细菌的卸甲型Ti质粒或卸甲型Ri质粒；以及

(3)具有由期望的DNA构成的T-DNA区域的质粒，

由于使用了(1)～(3)的3种质粒载体，因此，被称为超级三元载体系统。特别是作为加强载体使用的质粒(1)是新型的，其具有以下特征。

(1)加强载体

在本说明书中，将能够使基因导入效率和转化效率提高、且可以附加性地用于土壤杆菌属细菌的载体质粒称为加强载体。在本发明中，使用具有下述的构成要素的质粒(1)作为加强载体。质粒(1)包含(i)pTiBo542的virB基因、virC基因、virD1基因、virD2基因、virD3基因、virG基因及virJ基因、以及(ii)复制起点。

(i)pTiBo542的virB基因、virC基因、virD1基因、virD2基因、virD3基因、virG基因及virJ基因

Ti质粒为野生型土壤杆菌属具有的通常为20万碱基对左右的巨大的质粒，包含被导入植物的T-DNA(transferDNA)、致病性区域(virlence区域：vir区域)等。T-DNA是通过同源重组而插入植物细胞的基因组的DNA片段，含有植物生长调节因子(植物生长激素和细胞分裂素)合成基因、冠瘿碱合成基因等。vir区域是编码用于插入T-DNA的植物所必需的蛋白质群的区域，含有virA基因、virB基因、virC基因、virD基因、virE基因、virG基因及virJ基因等各基因。

强病原性土壤杆菌属菌株A281具有的Ti质粒“pTiBo542”(Jinetal.,1987)具有Ti质粒的vir区域，该vir区域转化效率特别高，被称为超级致病性区域(super-virulence区域：super-vir区域)。

本发明的加强载体的特征在于，包含pTiBo542中所有的virB基因、virC基因、virD1基因、virD2基因、virD3基因、virG基因及virJ基因。

关于virB基因，在Wardetal.(1988)JBiolChem263：5804-5814中有详细的记载。

例如，可以由pSB1(Komarietal.1996PlantJ10：165-174)等质粒用常规方法来制备。例如，可以将virB基因的碱基序列规定为Genbank/EMBL收录号：AB027255(pSB1)的碱基序列中的第3416号～第12851号的碱基。需要说明的是，virB区域是由多个基因构成的操纵子，但在本说明书中，将其记为“virB基因”。

关于virC基因，在Closeetal.(1987)中有详细的记载。例如，可以由pSB1等质粒用常规方法来制备。例如，可以将virC基因的碱基序列规定为Genbank/EMBL收录号：DQ058764的碱基序列中的第163574号～第164880号的碱基。需要说明的是，virC区域是由多个基因构成的操纵子，但在本说明书中，将其记为“virC基因”。

virD基因由virD1基因、virD2基因、virD3基因、virD4基因及virD5基因这5个基因构成。关于virD基因，例如在Ream,W.(2008).ProductionofamobileT-DNAbyAgrobacteriumtumefaciens.InAgrobacterium,T.TzfiraandV.Citovsky,eds(NewYork:SpringerScience+BusinessMedia,LLC),pp.280-313中有详细的记载。本发明的加强载体含有virD基因中的virD1基因、virD2基因、virD3基因。例如，可以将virD1基因、virD2基因及virD3基因分别规定为Genbank/EMBL收录号：DQ058764的碱基序列中的第165149号～第165592号的碱基、第165626号～第166900号的碱基及第166920号～第167558号的碱基。

virG是virB或virE等其它vir基因群的转录调节(激活)因子(Winansetal.1986Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:8278-8282)。例如，可以将virG基因的碱基序列规定为Genbank/EMBL收录号：DQ058764的碱基序列中的第162660号～第163463号的碱基。

关于virJ基因，在Pantojaetal.(2002)中有详细的记载。例如，可以由pTiBo542等质粒用常规方法来制备。例如，可以将virJ的碱基序列规定为Genbank/EMBL收录号：DQ058764的碱基序列中的第150873号～第151616号的碱基。

作为virB基因、virC基因、virD1基因、virD2基因、virD3基因、virG基因及virJ基因，可以使用含有与各个上述特定的序列或其互补序列在严格条件下杂交的碱基序列的DNA、且由具有各序列的功能的DNA构成的基因。也可以使用在这些碱基序列中至少含有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的碱基序列的DNA、且由具有各序列的功能的DNA构成的基因。但是，并不限于上述基因。

在本说明书中，“严格条件下”是指以中程度或高程度在严格条件下进行杂交。具体而言，对于中程度严格条件而言，例如，具有通常技术的本领域技术人员可以基于DNA的长度容易地确定。基本的条件示于Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版,第6章,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001,包含使用例如5×SSC、0.5％SDS、1.0mMEDTA(pH8.0)的预清洗溶液、约42℃下的、约50％甲酰胺、2×～6×SSC、优选5×～6×SSC、0.5％SDS(或约42℃下的约50％甲酰胺中的、施托克溶液(Starksolution)等其它同样的杂交溶液)的杂交条件、以及例如约50℃～68℃、0.1×～6×SSC、0.1％SDS的清洗条件。中程度严格条件优选包含约50℃、6×SSC、0.5％SDS的杂交条件(及清洗条件)。对于高严格条件而言，例如，也可以由本领域技术人员基于DNA的长度容易地确定。

通常，这样的条件被定义为含有比中程度严格条件更高的温度和/或更低的盐浓度下的杂交(例如，含有0.5％左右的SDS，在约65℃下6×SSC～0.2×SSC、优选6×SSC、更优选2×SSC、更优选0.2×SSC、或0.1×SSC的杂交)和/或清洗，例如，如上所述的杂交条件、以及伴随有约65℃～68℃、0.2×～0.1×SSC、0.1％SDS的清洗。在杂交和清洗的缓冲液中，可以使用SSPE(1×SSPE为0.15MNaCl、10mMNaH₂PO₄、及1.25mMEDTA、pH7.4)代替SSC(1×SSC为0.15MNaCl和15mM柠檬酸钠)，清洗在杂交结束后进行15分钟～1小时左右。

另外，也可以使用在探针中不使用放射性物质的市售的杂交试剂盒。具体而言，可以列举使用了ECLdirectlabeling&detectionsystem(Amersham公司制)的杂交等。作为严格的杂交，可以列举如下条件，例如，在试剂盒中的杂交缓冲液中加入封闭试剂5％(w/v)，使得NaCl为0.5M，在42℃下进行4小时，在0.4％SDS、0.5×SSC中于55℃下进行两次20分钟的清洗，在2×SSC中于室温下进行一次5分钟的清洗。

2个碱基序列的同一性％可以通过肉眼检查和数学计算来确定，或者更优选通过使用计算机程序比较序列信息来完成该比较。代表性的优选计算机程序是GeneticsComputerGroup(GCG；威斯康星州麦迪逊(Madison))的Wisconsinpackage，10.0版程序“GAP”(Devereux,etal.,1984,Nucl.AcidsRes.,12:387)。通过使用该“GAP”程序，除了进行两个碱基序列的比较以外，还能够进行两个氨基酸序列的比较、碱基序列与氨基酸序列的比较。这里，在“GAP”程序的优选的默认参数中包含：(1)关于核苷酸的(关于相同物，含有1的值，关于非相同物，含有0的值)一元(unary)比较矩阵的GCG实行、和在Schwartz及Dayhoff主编的“多肽的序列及结构的图谱(AtlasofPolypeptideSequenceandStructure)”国立生物医学研究财团、353-358页、1979所记载的、Gribskov和Burgess,Nucl.AcidsRes.,14:6745,1986的加权氨基酸比较矩阵；或者其它能够进行比较的比较矩阵；(2)对氨基酸的各间隙进行30的补偿并对各间隙中的各符号追加1的补偿；或者对核苷酸序列的各间隙进行50的补偿并对各间隙中的各符号追加3的补偿；(3)对末端间隙无补偿：以及(4)对长间隙没有最大补偿。对于本领域技术人员使用的其它序列比较程序而言，例如，可以使用来自美国国立医学图书馆的网站：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html的BLASTN程序2.2.7版、或UW-BLAST2.0algorithm。关于UW-BLAST2.0的标准默认参数的设定，记载于以下的因特网网站：http://blast.wustl.edu。另外，BLASTalgorithm使用BLOSUM62氨基酸打分矩阵，可使用的选择参数如下所述：(A)包含用于屏蔽具有较低组成复杂性的检索序列的区段(根据Wootton及Federhen的SEG程序(ComputersandChemistry,1993)来确定；也希望参照Wootton及Federhen,1996“序列数据库中的组成偏离区域的分析(Analysisofcompositionallybiasedregionsinsequencedatabases)”MethodsEnzymol.,266:544-71)、或者由短周期性的内部重复构成的区段(根据Claverie及States(ComputersandChemistry,1993)的XNU程序来确定)的过滤器；以及(B)用于报告对数据库序列的匹配的有统计学上意义的阈值、或E-评分(根据Karlin及Altschul,1990的统计学模型，单纯通过偶然而发现匹配的期望概率；在源于某种匹配的有统计学上意义的差大于E-评分阈值的情况下，不报告该匹配)；优选的E-评分阈值的数值为0.5，或者按优选度增加的顺序为0.25、0.1、0.05、0.01、0.001、0.0001、1e-5、1e-10、1e-15、1e-20、1e-25、1e-30、1e-40、1e-50、1e-75、或1e-100。

在本发明的加强载体中，pTiBo542的virB基因、virC基因、virD1基因、virD2基因、virD3基因、virG基因及virJ基因在载体上的位置没有特别限定。例如，可以优选使用含有全部这些基因的来自pTiBo542的vir区域片段(图7)。

(ii)复制起点

本发明中的加强载体((1)质粒)含有在大肠杆菌及土壤杆菌属细菌中能够复制的复制起点。例如，可以使用从IncW不亲合性组的复制起点、IncP不亲合性组的复制起点、IncQ不亲合性组的复制起点及pVS1不亲合性组的复制起点中适当选择的复制起点，但是并不限定于此。

复制起点优选为IncW不亲合性组的复制起点，进一步优选为IncW的复制起点。关于IncW质粒的复制起点的分子生物学上的各种特性在OkumuraandKado(1992MolGenGenet235:55-63)中有详细的记载，规定为Genbank/EMBL收录号：U30471(全长5500bp)的第2170号～第2552号的碱基。IncW质粒的复制起点可以由pTOK47(Jinetal.1987)等IncW质粒用常规方法进行制备。

另外，为了使IncW质粒的复制起点发挥作用，优选含有RepA蛋白质(起始子)的编码区域。对于repA基因的碱基序列而言，只要是在IncW质粒的复制中作为必需的repA基因起作用的序列，就没有特别限定。关于IncW质粒的复制中必需的repA的分子生物学上的各种特性，在OkumuraandKado(1992MolGenGenet235:55-63)中有详细的记载，规定为Genbank/EMBL收录号：U30471(全长5500bp)的第1108号～第2079号的碱基。

IncW质粒的复制中必需的repA可以由pTOK47(Jinetal.1987)等IncW质粒用常规方法进行制备。

(iii)其它构成要素

本发明的加强载体((1)质粒)还可以含有pTiBo542的vir区域的其它基因、例如virE基因、virD4基因或virD5基因。

关于virE基因，在Citovskyetal.(1988)中有详细的记载。例如，可以由pTiBo542等质粒用常规方法来制备。例如，将virE的碱基序列规定为Genbank/EMBL收录号：DQ058764的碱基序列中的第172574号-第176510号的碱基。需要说明的是，virE区域是由多个基因构成的操纵子，但是在本说明书中将其记为“virE基因”。

关于virD4基因，在Christie(2004)中有详细的记载。例如，可以由pTiBo542等质粒用常规方法来制备。例如，将virD4的碱基序列规定为Genbank/EMBL收录号：DQ058764的碱基序列中的第167555号-第169513号的碱基。

关于virD5基因，在Vergunstetal.(2005)中有详细的记载。例如可以由pTiBo542等质粒用常规方法来制备。例如，将virD5碱基序列规定为Genbank/EMBL收录号：DQ058764的碱基序列中的第169614号-第172124号的碱基。

本发明的加强载体还可以含有药物筛选标记基因。药物筛选标记基因可以使用公知的基因，没有特别限定，优选为在Ti质粒和具有T-DNA区域的质粒(双元载体)中不含有的药物筛选标记基因。作为药物筛选标记基因的具体例子，可以优选使用庆大霉素抗性基因，但对其完全没有限定。可以根据目的优选使用以卡那霉素抗性基因，氨苄西林抗性基因，奇放线菌素抗性基因，四环素抗性基因，潮霉素抗性基因为代表的多种药物筛选标记基因。通过In-FusionPCR等可以容易地更改本发明的加强载体和双元载体上的药物筛选标记基因的种类。

本发明中的加强载体的全长没有限定，优选为10kb～30kb，更优选为15kb～25kb。

(iv)pVGW9

作为满足上述条件的本发明的加强载体之一，可以列举pVGW9。pVGW9具有附于本说明书中的SEQIDNO：1的碱基序列，全长为20978碱基对。

将pVGW9的示意图示于图1。各构成要素在SEQIDNO：1的碱基序列中相当于以下位置。

复制起点：SEQIDNO：1的第9号-第2758号的碱基

virJ基因：SEQIDNO：1的第3003号-第3746号的碱基

virB基因：SEQIDNO：1的第5223号-第14658号的碱基

virG基因：SEQIDNO：1的第14790号-第15593号的碱基

virC基因：SEQIDNO：1的第15704号-第17010号的碱基

virD1基因：SEQIDNO：1的第17279号-第17722号的碱基

virD2基因：SEQIDNO：1的第17756号-第19030号的碱基

virD3基因：SEQIDNO：1的第19050号-第19688号的碱基

(2)土壤杆菌属细菌的卸甲型Ti质粒或卸甲型Ri质粒

本发明的土壤杆菌属细菌还含有土壤杆菌属细菌的卸甲型Ti质粒或卸甲型Ri质粒(在本说明书中，有时总称为“Ti质粒”)。

Ri质粒为在土壤杆菌属细菌中特别是Agrobacteriumrhizogenes具有的质粒。与Ti质粒相同，是20万碱基对左右的巨大的质粒，包含被导入植物的T-DNA(transferDNA)、病原性区域(virlence区域：vir区域)等。

需要说明的是，土壤杆菌属细菌的卸甲型Ti质粒或卸甲型Ri质粒的复制起点属于与IncW、IncP、IncQ及pVS1不同的不亲合性组。

“卸甲型Ti质粒或卸甲型Ri质粒”是从野生型Ti质粒或野生型Ri质粒中除去了T-DNA区域的质粒。土壤杆菌属细菌的卸甲型质粒优选为卸甲型Ti质粒。

例如，卸甲型Ti质粒可以使用记载于Hoekemaetal.,(1983)的pAL4404。例如，卸甲型Ri质粒可以使用记载于Jouaninetal.,(1987)的pRiB278b。

或者，也可以使用本来保持有卸甲型Ti质粒的公知的土壤杆菌属菌株。本发明的土壤杆菌属细菌优选不含有卸甲型pTiBo542。例如，可以使用LBA4404、GV3850、GV3TillSE、C58-Z707、GV3101::pMP90,GV3101::pMP90RK、GV2260、或NTI(pKPSF2)，但并不限定于此。

(3)双元载体(具有由期望的DNA构成的T-DNA区域的质粒)

本发明的土壤杆菌属细菌还含有具有由期望的DNA构成的T-DNA区域的质粒。该质粒能够在土壤杆菌属和大肠杆菌两者中复制，被称为双元载体。作为双元载体，可以适当使用公知的载体。具体而言，可以列举：pBin19、pBI121、pIG121、pIG121Hm、pLC41、pGreen系列的载体、pCLEAN-G系列的载体、pPZP系列的载体、pCAMBIA系列的载体、pOREO1、pGWB等载体，但并不限定于此。

插入本发明的T-DNA区域的DNA没有特别限定。例如，可以使用基因组DNA片段、cDNA片段等任意的DNA。优选为基因组DNA片段，更优选为来自植物的基因组DNA片段。所导入的DNA片段的尺寸优选为0.1kb～100kb，更优选为1kb～40kb，但并不限定于此。

需要说明的是，将大片段的T-DNA插入双元载体时，可以优选使用Ri质粒(Hamilton,C.M.,Frary,A.,Lewis,C.,andTanksley,S.D.(1996).StabletransferofintacthighmolecularweightDNAintoplantchromosomes.ProcNatlAcadSciUSA93,9975-9979.)的复制起点。

在本发明中，(1)～(3)的各质粒具有能够相互共存的复制机理。在双元载体和加强载体属于相同的不亲合性组的情况下，不能在土壤杆菌中保持两种载体。因此，需要使这些复制起点为不同的不亲合性组。例如，使IncW、IncP、IncQ及pVS1分别属于不同的不亲合性组。“(1)～(3)的各质粒具有能够相互共存的复制机理”是指(1)～(3)的3种质粒各自属于不同的不亲合性组，例如，只要属于分别与IncW、IncP、IncQ不同的不亲合性组即可。在3种质粒中，如果2种属于相同的组，则不满足本条件。

本发明的土壤杆菌属细菌的方式

将(1)～(3)的3种质粒导入土壤杆菌属细菌的顺序、导入的方法没有特别限定。

例如，可以利用本来保持有卸甲型Ti质粒(相当于(2)质粒)的公知的土壤杆菌属菌株。例如，可以使用LBA4404(Hoekemaetal.,1983)、GV3850(Zambryskietal.,1983)、GV3TillSE(Fraleyetal.,1985)、C58-Z707(Hepburnetal.,1985)、GV3101::pMP90(KonczandSchell,1986)，GV3101::pMP90RK(KonczandSchell,1986)、GV2260(McBrideandSummerfelt,1990)、或NTI(pKPSF2)(Palanichelvametal.,2000)，但并不限定于此。可以在这些土壤杆菌属菌株中导入加强载体((1)质粒)和双元载体((3)质粒)。加强载体和双元载体可以通过，例如，电穿孔法、三系杂交法、冻结融化法等公知的方法而导入。加强载体和双元载体的导入顺序没有特别限定。可以将两者同时导入。

在本发明的一个方式中，土壤杆菌属细菌通过在选自LBA4404、GV3850、GV3TillSE、C58-Z707、GV3101::pMP90、GV3101::pMP90RK、GV2260及NTI(pKPSF2)中的土壤杆菌属细菌中导入(1)质粒和(3)质粒来制造。

本发明还在一种方式中包含含有下述的(1)～(2)的质粒的土壤杆菌属细菌：

(1)具有下述构成要素的质粒；

(i)pTiBo542的virB基因、virC基因、virD1基因、virD2基因、virD3基因、virG基因及virJ基因、及

(ii)复制起点，以及

(2)土壤杆菌属细菌的卸甲型Ti质粒或卸甲型Ri质粒，

这里，(1)和(2)的各质粒具有能够相互共存的复制机理。

含有(1)和(2)的质粒的土壤杆菌属细菌可以进一步导入具有插入了期望基因的T-DNA的(3)双元载体，可以广泛利用。

II.植物的转化方法

本发明还涉及一种利用了本发明的土壤杆菌属细菌的植物的转化方法、向植物中导入基因的方法。本发明的方法包括使本发明的土壤杆菌属细菌与植物细胞接触。

在一个方式中，本发明的方法包括：

含有下述的(1)～(2)的质粒的土壤杆菌属细菌：

(1)具有下述构成要素的质粒；

(ii)复制起点，以及

(2)土壤杆菌属细菌的卸甲型Ti质粒或卸甲型Ri质粒，

这里，(1)和(2)的各质粒具有能够相互共存的复制机理；

(3)向所述土壤杆菌属细菌导入具有由期望的DNA构成的T-DNA区域的质粒，且使该土壤杆菌属细菌与植物细胞接触。

作为本发明的转化方法的对象的植物没有特别限定，优选为被子植物，可以为单子叶植物，也可以为双子叶植物。如本说明书的实施例所述，可以优选使用玉米、水稻、番茄，但并不限定于此。

通过将本发明的土壤杆菌属细菌用于经由公知的土壤杆菌的转化方法，可以使转化效率大幅提高。

III.试剂盒

本发明还涉及一种用于通过土壤杆菌来转化植物细胞的方法的试剂盒。在一个方式中，本发明的试剂盒含有本发明的土壤杆菌属细菌。

本发明还涉及一种用于通过土壤杆菌属来转化植物细胞的方法的试剂盒。在一个方式中，本发明的试剂盒包含下述的(1)～(3)的质粒的组合：

(1)具有下述构成要素的质粒；

(ii)复制起点，

(2)土壤杆菌属细菌的卸甲型Ti质粒或卸甲型Ri质粒；以及

(3)具有由期望的DNA构成的T-DNA区域的质粒，

这里，(1)～(3)的各质粒具有能够相互共存的复制机理。

在其它方式中，本发明的试剂盒还包含(1)和(3)的质粒的组合：

(1)具有下述构成要素的质粒；

(ii)复制起点，以及

(3)具有由期望的DNA构成的T-DNA区域的质粒，

这里，(1)和(3)的各质粒具有能够相互共存的复制机理。

在该方式中，试剂盒还可以含有选自LBA4404、GV3850、GV3TillSE、C58-Z707、GV3101::pMP90、GV3101::pMP90RK、GV2260及NTI(pKPSF2)中的土壤杆菌属细菌。

IV.质粒

本发明还涉及：

(1)具有下述构成要素的质粒；

(ii)复制起点。

本发明的质粒优选为具有SEQIDNO：1所述的碱基序列的pVGW9质粒。

本发明还涉及一种本发明的质粒的用途，其用于方式12～14中任一项所述的植物的转化方法。

V.植物细胞转化用载体系统

本发明还提供一种组合使用上述(1)～(3)的三种质粒的植物细胞转化用载体系统(超级三元载体系统)。

上述公知的超级双元载体是在插入了从pTiBo542的vir区域切下的14.8kb的KpnI片段(virD1基因的一部分，virB基因，virC基因及virG基因)的受体载体和用大肠杆菌克隆的具有期望的T-DNA的穿梭载体之间通过同源重组而得到的混合载体。因此，需要在土壤杆菌中预先导入受体载体，因此在想要对多种类型的土壤杆菌属菌株进行试验时等，在准备中要花很大功夫。另外，在专利文献WO2007/148819A1中报告了：想要通过同源重组插入30kb～40kb的大T-DNA时，混合载体在土壤杆菌内是不稳定的。可以认为其主要原因是穿梭载体的复制起点为多拷贝型的ColE1。

相比之下，对于本发明的超级三元载体系统而言，只要将加强载体导入保持了卸甲型Ti质粒的土壤杆菌属菌株、并向其中用电穿孔法等导入具有插入了期望的基因的T-DNA的双元质粒，就可以用于植物的转化。即，仅通过使用电穿孔法等在各种植物中被广泛使用的双元载体菌株中导入本发明的加强载体，就能够容易地构建超级三元载体系统，由此可以以特别高的效率获得转化植物体。

实施例

以下，基于实施例，对本发明详细地进行说明，但是本发明并不限定于这些实施例。本领域技术人员可以基于本说明书的记载而容易地对本发明进行修饰、更改，这些均包含在本发明的技术的范围内。

实施例1超级三元载体系统的构建

本实施例记载了使用本发明的3种质粒的载体系统(超级三元载体系统)的构建。

pTOK47中含有IncWori和pBR322的ori两者，全长约为28kb(Jinetal.,1987)。另外，pAL154(Amoahetal.,2001)的全长为24kb。这些加强载体是大量含有在土壤杆菌内的复制保持中不需要的序列的长质粒。用作超级三元载体系统的加强载体的载体优选为尺寸小、容易插入vir区域片段、且可以进行大肠杆菌中的克隆的穿梭载体。在专利文献WO2007/148819A1中公开了符合这些目标的载体pVGW2。pVGW2包含IncWori和pBR322的ori两者，具有庆大霉素抗性基因(图3)。在本实施例中，以该pVGW2为基础进行了具有pTiBo542的病原性区域的加强载体的构建。

首先，以pVGW2为模板用pSa5’EcT22I(5’-AAAATGCATGGCATGTTTAACAGAATCTG-3’)(SEQIDNO：2)和M13(-20)Fw(5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’)(SEQIDNO：3)的引物集进行PCR，使得到的碎片自身连接而制成新型克隆载体“pGW”(图4)。需要说明的是，在PCR试剂中使用了保真度高的“PrimeSTARMax”(TaKaRa)。以下，在与构建有关的所有的PCR中均使用该试剂。

加强载体pVGW7的制作

制作了含有pTOK47及pAL154中所保持的14.8Kb的KpnI片段的加强载体pVGW7作为vir基因群。首先，为了提高克隆时的操作效率，在pGW中插入了pUC19的乳糖操纵子。在pGW的NsiI-NheI位点上插入用SapI+AatII消化pUC19而得到的乳糖操纵子片段，得到了新型克隆载体“pGWL”(图5)。在该pGWL的KpnI位点上插入用KpnI消化pSB1而得到的片段，得到了pVGW7(图6、图7)。

加强载体pVGW9的制作

通过进一步扩展来自待插入加强质粒的pTiBo542vir基因群的区域，进行了能否进一步提高转化能力的试验。用以pTiBo542为模板预先进行了磷酸化的引物、pTiBo542：150641Fw(5’-aaaaactagtcagagccaccccatcaggaatatcgcccattccgtcatcagcgtggtgac-3’)(SEQIDNO：4)及delD2-3’Rv(5’-tccaaagatcggccccttgatgcgactgtaacgctgcagataac-3’)(SEQIDNO：5)进行PCR，将其扩增产物连接于通过SmaI而开环并进行了脱磷酸化处理的pGW载体的两个末端。其结果是得到了含有virB、virC、virD1、D2、D3、virG及virJ基因的全部7个区域的目的构建pVGW9(图1、图7)。将pVGW9的碱基序列记载于序列表的SEQIDNO：1。

pLC41GWH-IG的制作

专利文献WO2007/148819A1中所记载的粘粒载体pLCleo(别名pLC41GWH)是IncP质粒，具有复制起点oriV(图8)。oriV在大肠杆菌和土壤杆菌两者中发挥作用。另外，在T-DNA区域中具有用含有玉米的泛素基因的第一内含子的启动子控制的潮霉素抗性基因。在该pLC41GWH的多克隆部位(MCS)上插入用CaMV的35S启动子控制且蓖麻的过氧化氢酶第一内含子介导的GUS基因(P35S：Icat：GUS：T35S)，因此，用HindIII消化pLC41GWH和pSB34(HieiandKomari,2006)。消化样品用0.7％SeaKemGTG琼脂糖进行电泳，切下目的条带，用QIAEXII(QIAGEN公司)从凝胶中提取DNA并纯化。连接载体片段和插入片段(16℃，过夜)，对反应液进行乙醇沉淀处理，用电穿孔法将用MilliQ水再溶解的物质导入大肠杆菌GeneHogs(Invitrogen公司)。在含有抗生素卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂培养基上进行培养，从得到的菌落纯化质粒。对于这些克隆而言，将确定了碱基序列、且确认了具有目的插入区域的克隆命名为双元载体pLC41GWH-IG(图9)。

双元载体菌株及超级三元载体菌株的制作

将pLC41GWH-IG利用电穿孔法导入土壤杆菌属菌株LBA4404、GV2260、GV3850，在含有抗生素卡那霉素(50μg/ml)及潮霉素(50μg/ml)的AB琼脂培养基上进行培养，得到了3种双元载体菌株。接着，用电穿孔法将加强载体pVGW7导入LBA4404(pLC41GWH-IG)，在含有卡那霉素(50μg/ml)及潮霉素(50μg/ml)、庆大霉素(30μg/ml)的AB琼脂培养基上进行培养，得到了超级三元载体菌株LBA4404(pLC41GWH-IG/pVGW7)。另外，用电穿孔法在LBA4404(pLC41GWH-IG)、GV2260(pLC41GWH-IG)、GV3850(pLC41GWH-IG)各菌株中导入加强载体pVGW9，在含有卡那霉素(50μg/ml)及潮霉素(50μg/ml)、庆大霉素(30μg/ml)的AB琼脂培养基上进行培养，得到了超级三元载体菌株LBA4404(pLC41GWH-IG/pVGW9)、GV2260(pLC41GWH-IG/pVGW9)、GV3850(pLC41GWH-IG/pVGW9)。另外，用电穿孔法在LBA4404(pIG121Hm)(Hieietal.,1994)中导入加强载体pVGW9，在含有卡那霉素(50μg/ml)及潮霉素(50μg/ml)、庆大霉素(30μg/ml)的AB琼脂培养基上进行培养，得到了超级三元载体菌株LBA4404(pIG121Hm/pVGW9)。

实施例2

用超级三元载体系统向玉米A188进行基因导入

在本实施例中，使用实施例1中制成的超级三元载体菌株LBA4404向玉米A188进行了基因导入。

材料和方法

从温室栽培的植物中无菌地取出大小约1.2mm的玉米未成熟胚(品种：A188)，浸渍于土壤杆菌悬浮用液体培养基LS-inf(Ishidaetal.,2007)。在46℃下热处理3分钟后，用相同液体培养基清洗未成熟胚1次。接着，以20,000G进行10分钟(4℃)的离心处理，然后将未成熟胚浸渍于含有以约1×10⁹cfu/ml的浓度悬浮有实施例1中制成的LBA4404(pLC41GWH-IG)、GV2260(pLC41GWH-IG)、GV3850(pLC41GWH-IG)及LBA4404(pLC41GWH-IG/pVGW9)、GV2260(pLC41GWH-IG/pVGW9)、GV3850(pLC41GWH-IG/pVGW9)各个菌株的乙酰丁香酮100μmM的LS-inf培养基，然后置于共培养基LS-AS(Ishidaetal.,2007)。在25℃下暗黑培养3天后，用5-溴-4-氯-3-二氢吲哚基-β-D-葡萄糖苷酸(X-Gluc)研究未成熟胚的GUS活性。

结果和考察

将各种菌株接种于A188未成熟胚，在共培养的第3天观察GUS基因的短暂表达。对于接种了对照的LBA4404(pLC41GWH-IG)、GV2260(pLC41GWH-IG)及GV3850(pLC41GWH-IG)的未成熟胚而言，仅在接种了LBA4404(pLC41GWH-IG)的情况下，稍微观察到GUS活性。对于GV2260(pLC41GWH-IG)和GV3850(pLC41GWHIG)而言，几乎未发生基因导入(图10)。

相比之下，对于导入了加强载体pVGW9的超级三元载体菌株而言，在任一种菌株的未成熟胚的胚子叶上均观察到了GUS活性。特别是在LBA4404(pLC41GWH-IG/pVGW9)中，高频率地观察到了GUS表达(图10)。

实施例3用超级三元载体系统进行玉米A188的转化

在本实施例中，使用实施例1中制成的超级三元载体菌株LBA4404进行了玉米A188的转化。

材料和方法

从温室栽培的植物中无菌地取出大小约1.2mm的玉米未成熟胚(品种：A188)，浸渍于土壤杆菌悬浮用液体培养基LS-inf(Ishidaetal.,2007)。在46℃下热处理3分钟后，用相同液体培养基清洗未成熟胚1次。接着，以20,000G进行10分钟(4℃)的离心处理，然后将未成熟胚浸渍于含有以约1×10⁹cfu/ml的浓度悬浮有双元载体系统LBA4404(pLC41GWH-IG)、及三元载体系统LBA4404(pLC41GWH-IG/pVGW7)、超级三元载体系统LBA4404(pLC41GWHIG/pVGW9)及超级双元载体系统的LBA4404(pSB134)(HieiandKomari，2006)的各菌株的乙酰丁香酮100μM的LS-inf培养基，然后置于共培养基LS-AS(Ishidaetal.,2007)。需要说明的是，pSB134与pLC41GWH-IG的T-DNA上含有的启动子、终止子的基因构成相同。在25℃下黑暗培养3天。将共培养后的未成熟胚置于含潮霉素(Hm)的筛选培养基(Ishidaetal.,2007)进行培养。将增殖的愈伤组织切成小片，置于含有Hm的再分化培养基(Ishidaetal.,2007)，在光照下进行培养。2周后，对显示出Hm抵抗性的再分化植物进行了研究。

将结果和考察结果示于表1。

表1玉米A188中的转化结果

a：超级双元载体系统

b：双元载体系统

c：超级三元载体系统

d：超级三元载体系统(本发明)

只有在双元载体系统LBA4404(pLC41GWH-IG)中完全不能得到转化体。除此以外的附加有pTiBo542的virB、C、G的载体系统全部能够得到Hm抗性且GUS阳性的玉米转化体(表1)。

对于各载体系统之间的比较而言，在超级双元载体系统LBA4404(pSB134)和超级三元载体系统LBA4404(pLC41GWH-IG/pVGW7)之间，后者的转化效率稍高(表1)。在专利文献WO2007/148819A1中报导了：在同样地使用了A188的未成熟胚的转化试验中，具有14.8kb的KpnI片段的超级双元载体系统比同样地附加了具有14.8kb的KpnI片段的pTOK47的超级三元载体系统的转化效率稍高。

相比之下，本发明的超级三元载体系统LBA4404(pLC41GWH-IG/pVGW9)与其它载体系统相比，转化效率显著增高(表1)。可以认为，具有pTiBo542的virB、C、D、G、J的全部5个基因的超级三元载体系统比现有的任一种载体系统的转化能力更高。

实施例4用超级三元载体系统进行籼稻IR64的转化

在本实施例中，使用实施例1中制成的超级三元载体菌株LBA4404进行了籼稻IR64的转化。

材料和方法

无菌地分离籼稻品种IR64的1.5mm长的未成熟胚，置于CCM愈伤组织诱导培养基，在30℃下黑暗培养10天。将从胚子叶增殖的愈伤组织进一步在30℃亮条件下培养2周。将得到的愈伤组织切成1-2mm的尺寸，进一步培养4天，然后浸渍于含有以约1×10⁹cfu/ml的浓度悬浮有实施例1中制成的LBA4404(pLC41GWH-IG)、LBA4404(pIG121Hm)、GV2260(pLC41GWH-IG)、GV3850(pLC41GWH-IG)及LBA4404(pLC41GWH-IG/pVGW9)、LBA4404(pIG121Hm/pVGW9)、GV2260(pLC41GWH-IG/pVGW9)、GV3850(pLC41GWH-IG/pVGW9)各菌株的乙酰丁香酮100μM的土壤杆菌悬浮用液体培养基AAM培养基(HieiandKomari,2008)。然后，置于共培养基NB-As(HieiandKomari,2008)，在25℃下黑暗培养3天。将共培养后的愈伤组织置于含Hm的筛选培养基(HieiandKomari,2008)进行培养。将增殖的Hm耐性愈伤组织在X-Gluc溶液中进行处理，研究GUS活性。

结果和考察

将结果示于表2。

表2使用了籼稻IR64的愈伤组织的转化结果(愈伤组织水平)

从接种了对照的LBA4404(pLC41GWH-IG)、LBA4404(pIG121Hm)、GV2260(pLC41GWH-IG)及GV3850(pLC41GWH-IG)的愈伤组织中，完全不能得到Hm耐性且GUS阳性的愈伤组织(表2)。相比之下，在导入了加强载体pVGW9的超级三元载体菌株中，任一种菌株均能得到转化愈伤组织，特别是在LBA4404(pLC41GWH-IG/pVGW9)中，从供试的9.6％的愈伤组织中能够得到转化愈伤组织(表2)。虽然籼稻可以比较容易地获得以未成熟胚为材料的转化，但是在以愈伤组织为材料的情况下是非常困难的。可以证实：仅通过在目前使用的各种双元载体系统的菌株中导入加强载体pVGW9，就能够提高转化能力，从任何菌株中均可以容易地得到转化细胞。

实施例5用超级三元载体系统向番茄Micro-Tom进行基因导入

在本实施例中，使用实施例1中制成的超级三元载体菌株LBA4404向番茄Micro-Tom进行基因导入。

材料和方法

将番茄的模型品种Micro-Tom的种子进行灭菌处理，在琼脂培养基上使其发芽，切下真叶刚开始长出时的子叶，供于土壤杆菌的感染。方法的详细情况参照Sunetal.(2006)。用于实验的菌株为实施例1中制成的LBA4404(pLC41GWH-IG)、GV2260(pLC41GWH-IG)及LBA4404(pLC41GWH-IG/pVGW7)、LBA4404(pLC41GWH-IG/pVGW9)、GV2260(pLC41GWH-IG/pVGW9)。在25℃、黑暗下进行3天的共培养。将共培养后的叶片用X-Gluc溶液进行处理，研究GUS活性。

结果和考察

将结果示于表3。

表3使用了番茄(Micro-Tom)的子叶切片的共培养后的短暂GUS活性

+：添加-：非添加

观察GUS基因的短暂表达时发现，在乙酰丁香酮存在下实施共培养的情况下，加强载体的附加效果较小，但是在未添加乙酰丁香酮的试验区中，加强载体pVGW7和pVGW9的附加效果明显(表3)。特别是在使用了pVGW9的超级三元载体系统中，在供试的全部的子叶片中均观察到了GUS活性。可以推测：虽然Micro-Tom本来就是可以转化的品种，但是如果使用在双元载体系统菌株种导入了加强载体pVGW9的超级三元载体系统，则能够以以往没有的高效率得到转化体。

实施例6用超级三元载体系统进行番茄的转化

在本实施例中，使用在实施例1中制成的超级三元载体菌株，进行了番茄品种Micro-Tom的转化愈伤组织形成效率的比较试验。

材料和方法

将番茄品种Micro-Tom的种子进行灭菌处理，置于含有高浓度(120g/L)蔗糖的无激素MS培养基上，在25℃的亮条件下预培养5天，由此，使种子处于发芽准备的状态。接着，向不含蔗糖的无激素MS培养基移植种子，然后进一步培养2天，由此使发芽情况一致。用手术刀将没有完全从种皮中抽出的子叶的中间切成长方形，用于土壤杆菌的感染。感染和共培养按照Sunetal.(2006)的方法。在菌株中使用实施例1中制成的LBA4404(pLC41GWH-IG)、LBA4404(pLC41GWH-IG/pVGW7)、LBA4404(pLC41GWH-IG/pVGW9)。需要说明的是，在共培养的培养基中添加了0.1mM乙酰丁香酮。在共培养后，将叶片移植于含有30g/L蔗糖、3g/L结冷胶、1.5mg玉米素、50mg/L潮霉素、100mg/L羧苄青霉素、250mg/L头孢噻肟的MS愈伤组织诱导培养基。在25℃的亮条件下培养2周，然后移植于相同组成的MS愈伤组织诱导培养继续培养2周。培养后，用镊子夹取形成于子叶切片上的潮霉素耐性的愈伤组织，通过用X-Gluc溶液进行浸渍处理，研究GUS活性。需要说明的是，在相同子叶切片上相互离开的位置上形成了多个潮霉素耐性且GUS阳性的转化愈伤组织的情况下，作为不同的转化愈伤组织计数。

将结果和考察结果示于表4。

表4使用了番茄(Micro-Tom)的子叶切片的转化愈伤组织形成效率

形成于子叶切片上的潮霉素耐性的愈伤组织的90％以上为显示出强GUS活性的转化愈伤组织。加强载体pVGW9的附加显示出使转化愈伤组织的形成效率提高至2倍以上的效果。相比之下，加强载体pVGW7的附加效果稍差，约为1.4倍(表4)。这样，具有加强载体pVGW9的菌株比具有加强载体pVGW7的菌株显示出更高的转化能力，这是由于在pVGW9中附加了来自pTiBo542的virD1基因、virD2基因、virD3基因及virJ基因。

序列表自由文本

SEQIDNO：1是pVGW9载体的碱基序列。

SEQIDNO：2是PCR引物pSa5’EcT22I的碱基序列。

SEQIDNO：3是PCR引物M13(-20)Fw的碱基序列。

SEQIDNO：4是PCR引物pTiBo542：150641Fw的碱基序列。

SEQIDNO：5是PCR引物delD2-3’Rv的碱基序列。

Claims

1.一种土壤杆菌属细菌，其含有下述的(1)～(3)的质粒：

(1)具有下述构成要素的质粒；

(ii)复制起点，

(2)土壤杆菌属细菌的卸甲型Ti质粒或卸甲型Ri质粒；以及

(3)具有由期望的DNA构成的T-DNA区域的质粒，

这里，(1)～(3)的各质粒具有能够相互共存的复制机理。

2.根据权利要求1所述的土壤杆菌属细菌，其中，

(1)质粒的(ii)的复制起点为IncW复制起点。

3.根据权利要求1或2所述的土壤杆菌属细菌，其中，(1)质粒还含有pTiBo542的virE基因。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的土壤杆菌属细菌，其中，(1)质粒还含有repA基因。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的土壤杆菌属细菌，其中，(1)质粒还含有药物筛选标记基因。

6.根据权利要求5所述的土壤杆菌属细菌，其中，药物筛选标记基因为庆大霉素抗性基因。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的土壤杆菌属细菌，其中，(1)质粒为具有SEQIDNO：1所述的碱基序列的pVGW9。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的土壤杆菌属细菌，其中，(2)土壤杆菌属细菌的卸甲型质粒为卸甲型Ti质粒。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的土壤杆菌属细菌，其不保持卸甲型pTiBo542。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的土壤杆菌属细菌，其是通过向选自LBA4404、GV3850、GV3TillSE、C58-Z707、GV3101::pMP90、GV3101::pMP90RK、GV2260、以及NTI(pKPSF2)中的土壤杆菌属细菌中导入(1)质粒及(3)质粒来制造的。

11.一种土壤杆菌属细菌，其含有下述的(1)～(2)的质粒：

(1)具有下述构成要素的质粒；

(ii)复制起点，以及

(2)土壤杆菌属细菌的卸甲型Ti质粒或卸甲型Ri质粒；

这里，(1)和(2)的各质粒具有能够相互共存的复制机理。

12.一种植物的转化方法，该方法包括：使权利要求1～10中任一项的土壤杆菌属细菌与植物细胞接触。

13.一种植物的转化方法，该方法包括：在权利要求11的土壤杆菌属细菌中导入(3)具有由期望的DNA构成的T-DNA区域的质粒，并且使该土壤杆菌属细菌与植物细胞接触。

14.根据权利要求12或13所述的植物的转化方法，其中，植物为被子植物。

15.一种试剂盒，其用于通过土壤杆菌转化植物细胞的方法，所述试剂盒包含权利要求1～10或权利要求11中任一项所述的土壤杆菌属细菌。

16.一种试剂盒，其用于通过土壤杆菌转化植物细胞的方法，所述试剂盒包含下述(1)～(3)的质粒的组合：

(1)具有下述构成要素的质粒；

(ii)复制起点，

(2)土壤杆菌属细菌的卸甲型Ti质粒或卸甲型Ri质粒；以及

(3)具有由期望的DNA构成的T-DNA区域的质粒，

这里，(1)～(3)的各质粒具有能够相互共存的复制机理。

17.一种试剂盒，其用于通过土壤杆菌转化植物细胞的方法，所述试剂盒包含下述(1)和(3)的质粒的组合：

(1)具有下述构成要素的质粒；

(ii)复制起点，以及

(3)具有由期望的DNA构成的T-DNA区域的质粒；

这里，(1)和(3)的各质粒具有能够相互共存的复制机理。

18.根据权利要求17所述的试剂盒，其还含有选自LBA4404、GV3850、GV3TillSE、C58-Z707、GV3101::pMP90、GV3101::pMP90RK、GV2260、以及NTI(pKPSF2)中的土壤杆菌属细菌。

19.一种pVGW9质粒，其具有SEQIDNO：1所述的碱基序列。

20.一种权利要求19所述的质粒的用途，其用于权利要求12～14中任一项所述的植物的转化方法。