JPWO2011013764A1 - アグロバクテリウム菌を用いた、コムギ属の植物へ遺伝子導入を行う方法、コムギ属の植物の形質転換植物の作成方法 - Google Patents
アグロバクテリウム菌を用いた、コムギ属の植物へ遺伝子導入を行う方法、コムギ属の植物の形質転換植物の作成方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
近年、強病原性アグロバクテリウムの病原性遺伝子の一部を有するスーパーバイナリーベクターの利用により、イネ、トウモロコシなどの単子葉植物においても、安定して、高効率で形質転換のなされることが報告された(非特許文献3および4)。これらの報告では、アグロバクテリウムによる形質転換は、安定して、高効率で形質転換がなされる他に、得られた形質転換植物に変異が少なく、導入された遺伝子はコピー数が少なく、かつインタクトな形のものが多いという利点をもつとしている。イネ、トウモロコシでの成功に続いて、オオムギ(非特許文献6)およびソルガム(非特許文献7)等でのアグロバクテリウムによる形質転換の報告がなされた。
アグロバクテリウムによる単子葉穀物の形質転換の材料として、未熟胚および短期間培養した未熟胚は最適であり、トウモロコシ、コムギ、オオムギなどの作物において、未熟胚はアグロバクテリウム感染の主要なターゲットである(Cheng et al. (2004):非特許文献14)。
[態様1]
コムギ属(Triticum)の植物の、未熟胚または完熟種子の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
(i)アグロバクテリウム菌を接種した上記組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程を行い、
(ii)該共存工程と同時におよび/または該共存工程に次いで、上記組織において幼根、幼芽、および胚軸から選択される1またはそれ以上の部位を物理的/化学的に損傷する工程を行う、
ことを含む、上記方法。
[態様2]
コムギ属(Triticum)の植物の、形質転換植物の作成方法であって、
(i)アグロバクテリウム菌を接種した、未熟胚または完熟種子の組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程を行い、
(ii)該共存工程と同時におよび/または該共存工程に次いで、上記組織において幼根、幼芽、および胚軸から選択される1またはそれ以上の部位を物理的/化学的に損傷する工程を行い、
(iii)上記組織をレスティング培地で培養するレスティング工程を行い、そして、
(iv)上記組織を再分化培地で再分化させる工程を行う
ことを含む、上記方法。
[態様3]
前記組織において幼根、幼芽、および胚軸から選択される1またはそれ以上の部位を物理的/化学的に損傷することが、組織から幼根、幼芽、および胚軸から選択される1またはそれ以上の部位を取り除くことである、態様1又は2記載の方法。
[態様4]
前記共存工程と同時におよび/または該共存工程開始後7日以内に、前記組織において幼根、幼芽、および胚軸から選択される1またはそれ以上の部位を物理的/化学的に損傷する工程を行う、態様1ないし3のいずれか1に記載の方法。
[態様5]
前記共存工程開始後1日ないし3日で、前記組織において幼根、幼芽、および胚軸から選択される1またはそれ以上の部位を物理的/化学的に損傷する工程を行う、態様1ないし3のいずれか1に記載の方法。
[態様6]
前記共存培地が植物成長調節物質を含まない培地である、態様1ないし5のいずれか1に記載の方法。
[態様7]
以下の形質転換効率向上処理のうち、少なくとも1つを行う、態様1ないし6いずれか1に記載の方法。
b)硝酸銀および/または硫酸銅の共存培地への添加;
c)熱処理;
d)熱及び遠心処理;
e)加圧処理
f)粉体の存在下でアグロバクテリウムを接種する処理;
g)共存培地にシステインを添加する処理
[態様8]
以下の、a)及び/又はb)の形質転換効率向上処理を行う、態様1ないし6いずれか1に記載の方法。
b)硝酸銀および/または硫酸銅の共存培地への添加
[態様9]
上記(iii)レスティング工程と、(iv)再分化工程の間に薬剤選抜工程を含む、態様2ないし8のいずれか1に記載の方法。
[態様10]
(iii)レスティング培地、および/または、薬剤選抜工程の選抜培地が、植物成長調節物質を含む、態様2ないし9いずれか1に記載の方法。
[態様11]
前記アグロバクテリウム菌が、LBA4404、EHA101、EHA105、AGL1C、および58C1からなる群から選択される菌である、態様1ない10のいずれか1に記載の方法。
[態様12]
コムギ属の植物がパンコムギ(T.aestivum)またはマカロニコムギ(T.durum)である、態様1ないし11のいずれか1に記載の方法。
(i)アグロバクテリウム菌を接種した上記組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程を行い、
(ii)該共存工程と同時におよび/または該共存工程に次いで、上記組織において幼根、幼芽、および胚軸から選択される1またはそれ以上の部位を物理的/化学的に損傷する工程を行う、
ことを含む、遺伝子導入方法を提供する。
(i)アグロバクテリウム菌を接種した、未熟胚または完熟種子の組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程を行い、
(ii)該共存工程と同時におよび/または該共存工程に次いで、上記組織において幼根、幼芽、および胚軸から選択される1またはそれ以上の部位を物理的/化学的に損傷する工程を行い、
(iii)上記組織をレスティング培地で培養するレスティング工程を行い、そして、
(iv)上記組織を再分化培地で再分化させる工程を行う
ことを含む、上記方法を提供する。
本発明の遺伝子導入方法及び形質転換植物の作成方法は、アグロバクテリウム細菌を利用する。特に明記する工程以外は、公知のアグロバクテリウム細菌を利用した遺伝子導入方法、形質転換方法の各工程に従って行うことが可能である。
本発明において、アグロバクテリウム菌を接種した、未熟胚または完熟種子の組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程を行う。本工程は、アグロバクテリウム菌を接種した植物組織を、アグロバクテリウム菌の共存下にて培養することにより、アグロバクテリウム菌から植物細胞へのDNAの導入を確実にする工程である。
本工程における培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは20℃−35℃、さらに好ましくは23℃で行われる。また、本工程の培養は好ましくは暗所で行われるが、これに限定されない。本工程の培養期間もまた適宜選択可能であり、好ましくは1日ないし5日、より好ましくは2日である。
上記の共存工程と同時におよび/または該共存工程に次いで、組織において幼根、幼芽、および胚軸から選択される1またはそれ以上の部位を物理的/化学的に損傷する工程を行う。本発明は、当該工程により、遺伝子導入の効率、および植物の形質転換の効率を上昇させることを特徴の1つとする。
鋭利な刃物(例えばメス)による切除あるいは付傷、鋭利な先端をもつ器具(例えばピンセット)による除去あるいは付傷等が含まれる。化学的処理には、例えば、植物細胞の機能を消失あるいは低減させる酸性、アルカリ性の物質、細胞に毒性を有する除草剤成分等の薬剤による処理、などが含まれる。本発明において、幼根、幼芽、および胚軸から選択される1またはそれ以上の部位を物理的に「取り除く」ことは好ましい態様である。
1)共存工程において上記部位を損傷する態様、例えば、共存工程中に、植物組織を共存培地より取り出し、損傷処理を行い、再び共存培地に戻す態様;
2)共存工程後、レスティング工程の前に上記部位を損傷する態様;
3)レスティング工程において上記部位を損傷する態様、例えば、レスティング工程中に、植物組織をレスティング培地より取り出し、損傷処理を行い、再びレスティング培地に戻す態様;
および、
4)上記、1)乃至3)のいずれか複数の段階において上記部位を損傷する態様を意味する。それらの態様は全て本発明に包含される。
本発明の形質転換植物の作成方法においては、上記共存工程の後にさらにレスティング工程、再分化工程を経て、形質転換植物を作成する。
以下に記載する選抜工程および再分化工程は、アグロバクテリウム菌による植物の形質転換方法において一般に行われている方法である。なお本発明の形質転換植物の作成方法において、この選抜工程は必須のものではない。例えば、後に述べる形質転換向上処理をした場合には、選抜工程を経なくても目的とする形質転換体を得ることができるからである。なお選抜工程を行う場合、以下の記載は例示のためのものであり、本発明は以下の記載により限定されるものではない。
レスティング培地で培養した組織を、必要ならば選抜した後に、再分化培地で再分化させる工程を行う。本工程で使用される培地は、本明細書中では「再分化培地」という。再分化培地は、オーキシン類は含まない。
また本発明の遺伝子導入方法と形質転換植物の作成方法において、以下に述べる形質転換向上処理を行ってもよい。本明細書において「形質転換向上処理」とは、形質転換効率の向上を達成するための処理をいう。このような形質転換向上処理としては、限定されるものではないが、例えば以下のようなものあるいはこれらの組み合わせが含まれる。このような処理は、アグロバクテリウム菌の接種の前に施される場合も、アグロバクテリウム菌の接種と同時に行われる場合もあり、あるいは、アグロバクテリウム菌の接種の後に施される場合もあり、アグロバクテリウム菌の接種の後においては胚軸を切除する前後のいずれかで行ってもよい。
b)硝酸銀および/または硫酸銅の共存培地への添加(参照:AgNO3(Zhao et al. 2001:非特許文献9、Ishida et al. 2003:非特許文献11、特許文献4);CuSO4(WO2005/017152:特許文献7))、
c)熱処理(参照:WO1998/054961:特許文献2)、
d)熱及び遠心処理(参照:WO2002/012521:特許文献5)、
e)加圧処理(参照:WO2005/017169:特許文献6)、
f)粉体の存在下でアグロバクテリウムを接種する処理(参照:WO2007/069643:特許文献8)、ならびに、
g)共存培地にシステインを添加する処理(Frame et al. 2002:非特許文献10)。
本発明の遺伝子導入方法と本発明の形質転換植物の作成方法により、高い効率でコムギ属植物の形質転換を行うことができる。よって植物の形質転換効率の向上が達成される。
共存培地組成が遺伝子導入効率に及ぼす効果
材料および方法
開花後14日目のパンコムギ(品種:Bobwhite)の未熟胚(大きさ1.5−2.5mm)を無菌的に採取し、Inf液体培地(1/10濃度のMS無機塩およびMSビタミン、10g/lグルコース、0.5g/l MES、pH5.8)で1回洗浄した。遺伝子導入効率を高めるための前処理(15,000rpm、10分間の遠心処理)を行った。100μMアセトシリンゴンを含むInf液体培地に約1.0x109cfu/mlでアグロバクテリウム菌系 EHA101(pIG121Hm)(非特許文献3)を懸濁し接種源とした。遠心処理した未熟胚に接種源を加え、30秒間撹拌した後、5分間室温で静置した。100μMアセトシリンゴンを含むCo−Cul共存培地(1/10濃度のMS無機塩およびMSビタミン、10g/lグルコース、0.5g/l MES、pH5.8、固化剤は8g/lアガロース)および5μM AgNO3および5μM CuSO4を含むCo−Cul共存培地にアグロバクテリウムを接種した未熟胚を胚盤が上になるように置床した。対照の培地は0.5mg/l 2,4−Dおよび2.2mg/l ピクローラムを含むCo−Cul共存培地とした。
植物成長調節物質として2,4−Dおよびピクローラムを含む対照の共存培地で培養した未熟胚はX−glucによる染色後、GUS遺伝子のトランジェントな発現を示す青色のスポットは染色した25の未熟胚のいずれでも全くみられなかった。これに対し、植物成長調節物質を含まない共存培地で培養した未熟胚では,18の未熟胚のうち3つの未熟胚で直径1mm以上の青色のスポットがみられた。さらに硝酸銀および硫酸銅を添加した植物成長調節物質を含まない共存培地で培養した未熟胚では18の未熟胚のうち7つの未熟胚で直径1mm以上の青色のスポットがみられた。
幼根、幼芽および胚軸の切除がカルス形成と遺伝子導入効率に及ぼす効果(切除まで共存培地に置床)
材料および方法
開花後14日目のパンコムギ(品種:Bobwhite)の未熟胚(大きさ1.5−2.5 mm)を無菌的に採取し、Inf液体培地(1/10濃度のMS無機塩およびMSビタミン、10g/lグルコース、0.5g/l MES、pH5.8)で1回洗浄した。遺伝子導入効率を高めるための前処理(15,000rpm、10分間の遠心処理)を行った。100μMアセトシリンゴンを含むInf液体培地に約1.0x109cfu/mlでアグロバクテリウム菌系 EHA101(pIG121Hm)(非特許文献3)を懸濁し接種源とした。遠心処理した未熟胚に接種源を加え、30秒間撹拌した後、5分間室温で静置した。対照の未熟胚はメスとピンセットで幼根、幼芽および胚軸を取り除いた後、アグロバクテリウムを接種した。その他の未熟胚は幼根、幼芽および胚軸を付けたままアグロバクテリウムを接種した。100μMアセトシリンゴン、5μM AgNO3および5μM CuSO4を含むCo−Cul共存培地(1/10濃度のMS無機塩およびMSビタミン、10g/lグルコース、0.5g/l MES、pH5.8、固化剤は8g/lアガロース)にアグロバクテリウムを接種した未熟胚を胚盤が上になるように置床した。23℃、暗黒下で共存培養した。
1)カルス形成
カルス形成の結果を図1に示す。図1において、縦軸は未熟胚からのカルス形成を、横軸は未熟胚から幼根、幼芽および胚軸を切除しレスティング培地に置床するまでの、アグロバクテリウム接種後の日数を示す。共存培養開始後1日目に幼根、幼芽および胚軸を取り除き、レスティング培地に置床した未熟胚が最も高いカルス形成率を示した。幼根、幼芽および胚軸を取り除くまでの期間が長くなるに従い、カルス形成率は低下した。共存培養開始後2日目に幼根、幼芽および胚軸を切り取らずにレスティング培地に置床した未熟胚(図1:2日無切除)よりも、同日に幼根、幼芽および胚軸を切り取ってからレスティング培地に置床した未熟胚の方が高いカルス形成率を示した。また、幼根、幼芽および胚軸を切り取ってからアグロバクテリウムを接種した未熟胚(図1:0日)からはほとんどカルス形成が見られなかった。
幼根、幼芽および胚軸を切り取ってからアグロバクテリウムを接種した未熟胚でGUS遺伝子を発現したのは18未熟胚中1未熟胚であった。これに対し、共存培養開始後2日目に幼根、幼芽および胚軸を切り取った未熟胚では19未熟胚中15未熟胚でGUS遺伝子の発現がみられた。
幼根、幼芽および胚軸の切除がカルス形成と遺伝子導入効率に及ぼす効果(何日目に切除を行うかに関わらず、接種して共存培養開始後2日目にレスティング培地に置床)
材料および方法
開花後14日目のパンコムギ(品種:Bobwhite)の未熟胚(大きさ1.5−2.5 mm)を無菌的に採取し、Inf液体培地(1/10濃度のMS無機塩およびMSビタミン、10g/lグルコース、0.5g/l MES、pH5.8)で1回洗浄した。遺伝子導入効率を高めるための前処理(15,000rpm、10分間の遠心処理)を行った。100μMアセトシリンゴンを含むInf液体培地に約1.0x109cfu/mlでアグロバクテリウム菌系 EHA101(pIG121Hm)(非特許文献3)を懸濁し接種源とした。遠心処理した未熟胚に接種源を加え、30秒間撹拌した後、5分間室温で静置した。100μMアセトシリンゴン、5μM AgNO3および5μM CuSO4を含むCo−Cul共存培地(1/10濃度のMS無機塩およびMSビタミン、10g/lグルコース、0.5g/l MES、pH5.8、固化剤は8g/lアガロース)にアグロバクテリウムを接種した未熟胚を胚盤が上になるように置床した。23℃、暗黒下で共存培養した。
1)カルス形成
カルス形成の結果を図2に示す。図2において、縦軸は未熟胚からのカルス形成指数を、横軸は未熟胚から幼根、幼芽、および胚軸を切除するまでの、アグロバクテリウム接種後の日数を示す。共存培養開始後2日目に幼根、幼芽および胚軸を取り除き、レスティング培地に置床した未熟胚が最も高いカルス形成指数を示した。その後、幼根、幼芽および胚軸を取り除くまでの期間が長くなるに従い、カルス形成率は低下した。共存培養開始後2日目に幼根、幼芽および胚軸を切り取らずにレスティング培地に置床した未熟胚(無切除)は共存培養開始後5日目に幼根、幼芽および胚軸を切除した未熟胚と同等のカルス形成指数を示した。また、幼根、幼芽および胚軸を切り取ってからアグロバクテリウムを接種した未熟胚は共存培養直後に幼根、幼芽および胚軸を切除した未熟胚(0日目)と同等のカルス形成指数を示した。
共存培養直後に幼根、幼芽および胚軸を切り取ってからアグロバクテリウムを接種した未熟胚でGUS遺伝子を発現したのは15未熟胚中1未熟胚であった。これに対し、共存培養開始後2日目に幼根、幼芽および胚軸を切り取った未熟胚では15未熟胚中8未熟胚でGUS遺伝子の発現がみられた。共存培養開始後3日目に幼根、幼芽および胚軸を切り取った未熟胚では15未熟胚中11未熟胚でGUS遺伝子の発現がみられた。共存培養開始後4日目に幼根、幼芽および胚軸を切り取った未熟胚では15未熟胚中9未熟胚でGUS遺伝子の発現がみられた。共存培養開始後5日目に幼根、幼芽および胚軸を切り取った未熟胚では16未熟胚中7未熟胚でGUS遺伝子の発現がみられた。幼根、幼芽および胚軸を切り取らずにレスティング培養した未熟胚では15未熟胚中GUS遺伝子を発現したのは3未熟胚であった。
形質転換植物の作出
材料および方法
人工気象室KG−206SHL(小糸工業株式会社)、空調機付温室、通常のガラス温室でそれぞれ栽培した開花後14日目のパンコムギ(品種:Bobwhite)の未熟胚(大きさ1.5−2.5mm)を無菌的に採取し、Inf液体培地(1/10濃度のMS無機塩およびMSビタミン、10g/lグルコース、0.5g/l MES、pH5.8)で1回洗浄した。遺伝子導入効率を高めるための前処理(15,000rpm、10分間の遠心処理)を行った。100μMアセトシリンゴンを含むInf液体培地に約1.0x109cfu/mlでアグロバクテリウム菌系 EHA101(pIG121Hm)(非特許文献3)を懸濁し接種源とした。遠心処理した未熟胚に接種源を加え、30秒間撹拌した後、5分間室温で静置した。100μMアセトシリンゴン、5μM AgNO3および5μM CuSO4を含むCo−Cul共存培地(1/10濃度のMS無機塩およびMSビタミン、10g/lグルコース、0.5g/l MES、pH5.8、固化剤は8g/lアガロース)にアグロバクテリウムを接種した未熟胚を胚盤が上になるように置床した。23℃、暗黒下で共存培養した。
2008年の4月から5月、2008年の12月から2009年の3月に合計7回の試験を行った。結果を表1に示す。材料のコムギは人工気象室(人工気象機)、空調機付温室(空調温室)、通常のガラス温室(通常温室)で栽培したものから採取した。表1において、接種した未熟胚の数を(A)に、ハイグロマイシンに抵抗性、GUS陽性の植物個体数を(B)に、(B)/(A)で示される形質転換効率を一番右の欄に、それぞれ示す。
材料および方法
実施例3で得られたGUS遺伝子の発現を示す形質転換植物の葉から、小鞠らの方法(非特許文献29)に従いDNAを抽出した。抽出したDNAに制限酵素HindIIIで処理し、GUS遺伝子をプローブとしたサザン法による導入遺伝子の検出を行った。サザン法はMolecular Cloning (非特許文献26)に記載の方法に従って行った。
いずれの形質転換体もGUSプローブにハイブリダイズするバンドを示した。そのパターンは形質転換体ごとに異なり、導入遺伝子が植物の染色体上にランダムに挿入されていることが示された。GUS陽性を示した個体のバンド数は1−3本で、挿入された導入遺伝子のコピー数はいずれも少ないことが明らかとなった。1から3の各コピー数でGUS遺伝子が導入されたT0植物の個体数を表2に示す。
材料および方法
実施例3で得られた形質転換植物を栽培しT1種子を得た。これらの種子を培養土に播種し、温室で栽培した。播種後11日目の幼苗から葉を切り取り、200mg/lのハイグロマイシンを含むELA培地(非特許文献16)に差し込んだ。25℃、照明下で6日間培養後、葉片を観察し、緑色(ハイグロマイシン抵抗性)と黄色(ハイグロマイシン感受性)の判定を行った。
調査した4系統のいずれも後代植物においてハイグロマイシン抵抗性と感受性の分離を示した。分離比はいずれも3:1を示し、メンデルの法則に従って導入遺伝子が後代植物に遺伝していることが確認された(表3)。
材料および方法
1)Wan and Layton(2006)の従来法
従来法として、Wan and Layton(2006)(非特許文献23)の方法に従い、パンコムギ(品種:Bobwhite)を材料に、採取直後の未熟胚およびCM4C培地(MS無機塩およびMSビタミン、0.5g/l グルタミン、0.1g/l カゼイン加水分解物、0.75g/l 塩加マグネシウム6水和物、40g/lマルトース、0.5mg/l 2,4−D、2.2mg/l ピクローラム、1.95g/l MES、pH5.8、固化剤は2g/lゲルライト、100mg/l アスコルビン酸)で2日間培養した未熟胚(前培養未熟胚)に、MS無機塩とMSビタミンの濃度を1/10に減じたCM4C液体培地にEHA101(pIG121Hm)を懸濁し、接種した。接種後の未熟胚および前培養未熟胚をMS無機塩とMSビタミンの濃度を1/10に減じたCM4C培地に10g/lグルコースおよび200μMアセトシリンゴンを添加した共存培地に置床した。
Wan and Layton(2006)の方法において、遺伝子導入を行った結果を表4に示す。表4において、GUS++は未熟胚が複数の青色スポットを示したことを、GUS+は未熟胚が1つの青色スポットを示したことを、それぞれ示す。Wan and Layton(2006)の方法で接種した未熟胚および前培養未熟胚ではGUS遺伝子のトランジェントな発現を示す青色のスポットは供試した組織のいずれでも全くみられなかった。
遠心処理の時期が形質転換植物の作出に及ぼす効果
材料および方法
pIG121HmをテンプレートにBglII−Icat_Fw(5’-ACT CTA GAA CAT AGA TCT CTA CAG GGT AAA TTT CTA G-3’:配列番号1)とBamHI−GNos_Rv(5’-TTT GGA TCC GCG TCG ACG CGT CGA CGC GTC CTA GAA GCT AAT T-3’ :配列番号2)のプライマーセットでPCRを行い、Icat−GUS−Tnos断片を得た。このPCR産物を電気泳動、切り出し、β−agarase処理により精製し、pUC19/SmaIベクターにクローニングし「pUC−IcatGusTnos」を得た。このpUC−IcatGusTnosをBamHI + BglI + BglIIで消化し、IcatGusTnos/BamHI + BglII断片を回収して、pIG121Hm/BamHI + BAPベクターにクローニングした。得られたコンストラクトをシークエンスし、P35S−HPTを欠落させたことを確認したものを「pIG121del」とした。
レスティング培養5日目に各試験区の未熟胚の一部を採取しGUS遺伝子の発現を行った結果を図3に示す。なお図3における縦軸はGUS遺伝子の発現により表した遺伝子導入効率を示す。いずれの区も供試した半数以上の未熟胚がGUS遺伝子の発現を示し、遺伝子導入の程度はいずれの区も同等であった。これらのことから、本法において遠心処理は、アグロバクテリウムを接種する前に行っても、共存培養後に行ってもよく、また、共存培養後においては、胚軸を切り取る前、切り取った後のいずれにおいて行ってもよいことが示された。
材料および方法
実施例3で得られたGUS遺伝子の発現が陽性を示す独立の3系統の形質転換植物およびそれらの形質転換植物を自殖して得られた後代種子から生育したT1世代のGUS遺伝子の発現が陽性あるいは陰性を示すそれぞれの形質転換植物の葉から、小鞠らの方法に従いDNAを抽出した。抽出したDNAに制限酵素HindIIIで処理し、GUS遺伝子をプローブとしたサザン法による導入遺伝子の検出を行った。サザン法はMolecular Cloningに記載の方法に従って行った。
形質転換当代およびT1世代でGUS遺伝子の発現が陽性を示すいずれの形質転換体もGUSプローブにハイブリダイズするバンドを示した。そのパターンは形質転換系統ごとに異なり、また、同一の系統では当代植物とT1植物の示すバンドの数およびサイズはいずれの系統でも同じであった。さらにT1世代でGUS遺伝子の発現が陰性を示す植物ではGUSプローブにハイブリダイズするバンドはいずれの系統でもみられなかった。これらのことから、導入遺伝子が後代植物に安定して遺伝することが分子的に確認された。
共存培地への植物ホルモンの添加が形質転換植物の作出に及ぼす効果
材料および方法
空調機付温室で栽培した開花後14日目のパンコムギ(品種:Fielder)の未熟胚(大きさ1.5−3.0mm)を無菌的に採取し、Inf液体培地で1回洗浄した。Inf液体培地中で遺伝子導入効率を高めるための前処理(15,000rpm、10分間の遠心処理)を行った。100μMアセトシリンゴンを含むInf液体培地に約1.0x109cfu/mlでアグロバクテリウム菌系 EHA101(pIG121Hm)を懸濁し接種源とした。未熟胚のそれぞれに接種源を加え、30秒間撹拌した後、5分間室温で静置した。100μMアセトシリンゴン、5μM AgNO3および5μM CuSO4を含むCo−Cul共存培地に5μMの濃度でカイネチンあるいは4PUを添加した培地、また、0.5μMおよび5μMの各濃度で2,4−D、ダイカンバ、あるいはピクローラムを添加した培地にそれぞれアグロバクテリウムを接種した未熟胚を胚盤が上になるように置床した。23℃、暗黒下で共存培養した。対照は、いずれの植物ホルモンも含まないCo−Cul共存培地とした。
レスティング培養5日目に各試験区の未熟胚の一部を採取しGUS遺伝子の発現を行った結果を図4、5および6に示す。なお図4、5および6における縦軸はGUS遺伝子の発現を個々の未熟胚について、4(胚盤の75%以上で発現)、3(胚盤の50から74%で発現)、2(胚盤の25から49%で発現)、1(胚盤の5から24%で発現)、0.5(胚盤の1から4%で発現)、0(発現なし)の6段階で評価した平均値を示す。すなわち、GUS遺伝子の発現により表した遺伝子導入効率を示す。
未熟胚の大きさが形質転換植物の作出に及ぼす効果
材料および方法
実施例7と同様にベクターEHA105(pIG121−PubiIubiBAR)を作製した。空調機付温室で栽培した開花後14日目のパンコムギ(品種:Fielder)の未熟胚(大きさ1.2−3.0mm)を無菌的に採取し、Inf液体培地で1回洗浄した。Inf液体培地中で遺伝子導入効率を高めるための前処理(7,500rpm、10分間の遠心処理)を行った。100μMアセトシリンゴンを含むInf液体培地に約1.0x109cfu/mlでアグロバクテリウム菌系 EHA105(pIG121−PubiIubiBAR)を懸濁し接種源とした。未熟胚のそれぞれに接種源を加え、30秒間撹拌した後、5分間室温で静置した。100μMアセトシリンゴン、5μM AgNO3および5μM CuSO4を含むCo−Cul共存培地にアグロバクテリウムを接種した未熟胚を大きさにより1.2−1.8mm、1.8−2.2mmおよび2.2−3.0mmのそれぞれの実験区に分け、胚盤が上になるように置床した。23℃、暗黒下で共存培養した。
表6に各区の未熟胚における形質転換効率を示す。表6において、接種した未熟胚の数を(A)に、PPTに抵抗性の植物個体数を(B)に、(B)/(A)で示される形質転換効率を一番右の欄に、それぞれ示す。
Claims (12)
- コムギ属(Triticum)の植物の、未熟胚または完熟種子の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
(i)アグロバクテリウム菌を接種した上記組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程を行い、
(ii)該共存工程と同時におよび/または該共存工程に次いで、上記組織において幼根、幼芽、および胚軸から選択される1またはそれ以上の部位を物理的/化学的に損傷する工程を行う、
ことを含む、上記方法。 - コムギ属(Triticum)の植物の、形質転換植物の作成方法であって、
(i)アグロバクテリウム菌を接種した、未熟胚または完熟種子の組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程を行い、
(ii)該共存工程と同時におよび/または該共存工程に次いで、上記組織において幼根、幼芽、および胚軸から選択される1またはそれ以上の部位を物理的/化学的に損傷する工程を行い、
(iii)上記組織をレスティング培地で培養するレスティング工程を行い、そして、
(iv)上記組織を再分化培地で再分化させる工程を行う
ことを含む、上記方法。 - 前記組織において幼根、幼芽、および胚軸から選択される1またはそれ以上の部位を物理的/化学的に損傷することが、組織から幼根、幼芽、および胚軸から選択される1またはそれ以上の部位を取り除くことである、請求項1又は2記載の方法。
- 前記共存工程と同時におよび/または該共存工程開始後7日以内に、前記組織において幼根、幼芽、および胚軸から選択される1またはそれ以上の部位を物理的/化学的に損傷する工程を行う、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記共存工程開始後1日ないし3日で、前記組織において幼根、幼芽、および胚軸から選択される1またはそれ以上の部位を物理的/化学的に損傷する工程を行う、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記共存培地が植物成長調節物質を含まない培地である、請求項1ないし請求項5のいずれか1項に記載の方法。
- 以下の形質転換効率向上処理のうち、少なくとも1つを行う、請求項1ないし6いずれか1項に記載の方法。
a)遠心処理;
b)硝酸銀および/または硫酸銅の共存培地への添加;
c)熱処理;
d)熱及び遠心処理;
e)加圧処理
f)粉体の存在下でアグロバクテリウムを接種する処理;
g)共存培地にシステインを添加する処理 - 以下の、a)及び/又はb)の形質転換効率向上処理を行う、請求項1ないし6いずれか1項に記載の方法。
a)遠心処理;
b)硝酸銀および/または硫酸銅の共存培地への添加 - 上記(iii)レスティング工程と、(iv)再分化工程の間に薬剤選抜工程を含む、請求項2ないし8のいずれか1項に記載の方法。
- (iii)レスティング培地、および/または、薬剤選抜工程の選抜培地が、植物成長調節物質を含む、請求項2ないし9いずれか1項に記載の方法。
- 前記アグロバクテリウム菌が、LBA4404、EHA101、EHA105、AGL1C、および58C1からなる群から選択される菌である、請求項1ないし10のいずれか1項に記載の方法。
- コムギ属の植物がパンコムギ(T.aestivum)またはマカロニコムギ(T.durum)である、請求項1ないし11のいずれか1項に記載の方法。
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