CN105155167A - 一种嗜热毛壳菌纤维素酶在抛光染色一浴工艺中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种嗜热毛壳菌纤维素酶在抛光染色一浴工艺中的应用，该嗜热毛壳菌纤维素酶采用里氏木霉、或毕赤酵母表达。该嗜热毛壳菌纤维素酶为具有嗜盐性能的中性纤维素酶，高浓度的盐对中性纤维素酶的活性有明显的提升作用，该中性纤维素酶的最适作用温度为57～63℃，这样抛光温度与染色温度一致，在抛光过程的同时，染料可以充分匀染，保证染色均匀。

Description

一种嗜热毛壳菌纤维素酶在抛光染色一浴工艺中的应用

技术领域

本发明涉及生物酶制剂领域，具体涉及一种嗜热毛壳菌纤维素酶的新用途，尤其涉及一种嗜热毛壳菌纤维素酶在抛光染色一浴工艺中的应用。

背景技术

在传统的棉针织物抛光染色工艺中，抛光与染色工艺分开进行的，一般工艺流程如图1所示，在上述工艺中，最早是采用酸性纤维素酶，pH值一般控制在4.5～5.0左右。随着酶制剂的发展，特别是中性纤维素酶技术的进步，其可以在中性条件下有效的去除织物表面的毛羽，而染色前期的吸附过程一般也是在中性条件下进行。

近来年，随着人们对环保的日益重视，许多印染工作者尝试将抛光工艺染色工艺合二为一，即抛光染色一浴工艺。棉针织物抛光染色一浴工艺将抛光工艺与染色工艺合二为一，大大减少水与能源的消耗、减少污水的排放、缩短工艺时间、提高生产效率。该工艺一经推出，就受到许多印染企业和广大印染工作者的重视。许多工厂目前已经采用该工艺进行生产，其工艺流程一般如图2所示。

与抛光染色两步法相比，抛光染色一浴工艺可以节约3/4水的消耗与污水排放，可以减少1/3能量消耗，可以节省1/3时间。

在该工艺中，使用的酶一般是中性纤维素酶，但目前大部分酶的最适作用温度为50～55℃，因此抛光工序温度(也是染色起始上染工序)一般选择在50～55℃。一般棉活性染料的染色温度为60℃，因此，加碱进行反应固色温度选择在60℃条件下进行。

在该工艺中，为了促染，一般需加入大量的盐(氯化钠或硫酸钠)，即使染浅色，盐的浓度一般也不低于15g/L。染色越深，需要加入的盐量越大，盐浓度越高。染黑色时，盐的浓度甚至可以达到90g/L。

上述工艺在实际生产中存在以下问题：

①盐对中性纤维素酶的失活作用。在上述浓度(15～90g/L)及温度(50～55℃)条件下，盐对纤维素酶有明显的失活作用，浓度越高，失活作用越大。因此，为保证抛光效果，需要加大起始中性纤维素酶的用量或在后面补加中性纤维素酶。

②纤维素酶的最适作用温度一般为50～55℃，当温度高于60℃，酶的活力下降明显。因此，抛光工序与染色反应工序是在不同的温度条件下进行的。在升温60℃后，如果保温时间长，很容易造成较大的强力损伤，保温时间比较短，染料吸附不均匀，加碱进行固色反应，很容易造成染色色花。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种嗜热毛壳菌纤维素酶的新用途，即在抛光染色一浴工艺中的应用。该嗜热毛壳菌纤维素酶为具有嗜盐性能的中性纤维素酶，高浓度的盐对中性纤维素酶的活性有明显的提升作用，该中性纤维素酶的最适作用温度为57～63℃，这样抛光温度与染色温度一致，在抛光过程的同时，染料可以充分匀染，保证染色均匀。

本发明涉及的嗜热毛壳菌纤维素酶，是申请人于2013年7月5日申请的专利申请号为201310280267.6，发明名称为“一种嗜热毛壳菌纤维素酶及其制备方法和应用”的发明专利申请。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

在本发明的一方面，提供一种嗜热毛壳菌纤维素酶在抛光染色一浴工艺中的应用，所述嗜热毛壳菌纤维素酶按如下方法制得：

1)嗜热毛壳菌纤维素酶基因的合成，合成的嗜热毛壳菌纤维素酶基因的序列如SEQIDNO.2所示,合成的基因编码更加符合里氏木霉高效表达的基因编码；

2)嗜热毛壳菌纤维素酶表达质粒的构建；

3)里氏木霉的转化与嗜热毛壳菌纤维素酶高产菌株的筛选，得到的嗜热毛壳菌纤维素酶的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，分泌到细胞外的嗜热毛壳菌纤维素酶为SEQIDNO.3所示序列的第22-314位氨基酸序列；步骤3)具体为：首先，用EcoRI降解步骤2)构建的质粒形成质粒片段，采用化学转化方法将该质粒片段转入里氏木霉RUTC-30宿主细胞；然后在含有潮霉素B的PDA培养基上培养，再将生长旺盛的菌落接种置PDA培养基上，通过生长和发芽，将孢子再转移到新鲜PDA培养基上，以分离纯化转代稳定的转化子，将这些转化子的孢子接种在木霉纤维素酶诱导培养液，培养后，采样离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳分析；所述木霉纤维素酶诱导培养液的pH值为4.8，用乳糖作为诱导物。

作为本发明优选的技术方案，所述嗜热毛壳菌纤维素酶为具有嗜盐性能的中性纤维素酶，在10g/L～90g/L浓度范围内的盐(优选为NaCl、Na₂SO₄中的一种或多种)对该中性纤维素酶的活性有明显的提升作用。

作为本发明优选的技术方案，所述嗜热毛壳菌纤维素酶在抛光染色一浴中的最适作用温度为57～63℃(优选为60℃)。

在本发明的另一方面，提供一种嗜热毛壳菌纤维素酶在抛光染色一浴工艺中的应用，所述嗜热毛壳菌纤维素酶按如下方法制得：

1)嗜热毛壳菌纤维素酶基因的合成，合成的嗜热毛壳菌纤维素酶基因的序列如SEQIDNO.4所示；

2)嗜热毛壳菌纤维素酶表达质粒的构建；

3)毕赤酵母的转化与嗜热毛壳菌纤维素酶高产菌株的筛选，得到的嗜热毛壳菌纤维素酶的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；步骤3)具体为：首先，用SpeI限制性内切酶将步骤2)构建的表达质粒切开后，直接转化毕赤酵母菌；随即挑选多个白色毕赤酵母菌落、培养、诱导后，将菌体与培养液分离，培养液通过SDS-PAGE电泳分析。

作为本发明优选的技术方案，所述嗜热毛壳菌纤维素酶为具有嗜盐性能的中性纤维素酶，在10g/L～90g/L浓度范围内的盐(优选为NaCl、Na₂SO₄中的一种或多种)对该中性纤维素酶的活性有明显的提升作用。

作为本发明优选的技术方案，所述嗜热毛壳菌纤维素酶在抛光染色一浴中的最适作用温度为57～63℃(优选为60℃)。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、盐浓度在10g/L～90g/L范围内，对中性纤维素酶有一定的激活作用，可以提升中性纤维素酶的抛光效果。因此，纤维素酶的用量降低，从而可以降低工艺成本。

2、中性纤维素酶的最适作用温度提高为60℃，与棉用活性染料染色温度一致，可以在恒温(60℃)条件下进行抛光染色一浴。既有利于抛光，又有利于染色，保证染色质量。

附图说明

图1是传统的棉针织物抛光与染色工艺分开进行的工艺流程图。

图2是现有的抛光染色一浴工艺的工艺流程图。

图3是本发明实施例3中在60℃条件下，pH值7.0条件下，用1.0g/L嗜热毛壳菌纤维素酶对织物抛光60分钟，在不同硫酸钠浓度条件下的失重率对比图。

图4是本发明实施例3中在60℃条件下，pH值6.0条件下，用1.0g/L嗜热毛壳菌纤维素酶对织物抛光60分钟，在不同硫酸钠浓度条件下的失重率对比图。

图5是本发明实施例3中在50℃条件下，pH值6.0条件下，用1.0g/L市场上收集的大孢圆孢霉(Staphylotrichumcoccosporum)STCE1基因编码的中性纤维素酶对织物抛光60分钟，在不同硫酸钠浓度条件下的失重率对比图。

图6是本发明实施例4中嗜热毛壳菌纤维素酶的温度特性分析示意图。

图7是本发明实施例4中市场上收集的大孢圆孢霉(Staphylotrichumcoccosporum)STCE1基因编码的中性纤维素酶的温度特性分析示意图。

图8是本发明实施例5中的工艺流程图。

图9是本发明实施例6中的工艺流程图。

图10是本发明实施例7中的工艺流程图。

图11是本发明实施例8中的工艺流程图。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆:实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1采用里氏木霉表达的嗜热毛壳菌纤维素酶的制备(参见专利申请号为

0

5g/L

10g/L

20g/L

40g/L

60g/L

80g/L

90g/L

失重率

1.67％

1.93％

1.98％

1.84％

1.83％

1.74％

1.69％

1.68％

201310280267.6的发明专利申请公开文本CN103343111A的说明书的实施例1)。

实施例2采用毕赤酵母表达的嗜热毛壳菌纤维素酶的制备(参见专利申请号为201310280267.6的发明专利申请公开文本CN103343111A的说明书的实施例3)。

实施例3嗜热毛壳菌纤维素酶具有嗜盐性能的定性试验(不同硫酸钠浓度对中性纤维素酶抛光效果影响)

1、60℃条件下，pH值7.0条件下，用1.0g/L实施例1制得的嗜热毛壳菌纤维素酶对织物抛光60分钟，在不同硫酸钠浓度条件下失重率情况，见表1和图3(失重率越高，抛光效果相对越好)。

表1

0

5g/L

10g/L

20g/L

40g/L

60g/L

80g/L

90g/L

失重率

1.34％

1.57％

1.76％

1.51％

1.52％

1.43％

1.36％

1.35％

2、60℃条件下，pH值6.0条件下，用1.0g/L实施例2制得的嗜热毛壳菌纤维素酶对织物抛光60分钟，在不同硫酸钠浓度条件下失重率情况，见表2和图4(失重率越高，抛光效果相对越好)。

表2

0

5g/L

10g/L

20g/L

40g/L

60g/L

80g/L

90g/L

失重率

1.67％

1.93％

1.98％

1.84％

1.83％

1.74％

1.69％

1.68％

可见，按实施例1、2制得的嗜热毛壳菌纤维素酶具有嗜盐性能，即盐的存在对纤维素酶有一定的激活作用，可以提升纤维素酶的抛光作用效果。

3、50℃条件下，pH值6.0条件下，用1.0g/L市场上收集的大孢圆孢霉(Staphylotrichumcoccosporum)STCE1基因编码的中性纤维素酶对织物抛光60分钟，在不同硫酸钠浓度条件下失重率情况，见表3和图5(失重率越高，抛光效果相对越好)。

表3

0

5g/L

10g/L

20g/L

40g/L

60g/L

80g/L

90g/L

失重率

1.67％

1.60％

1.48％

1.32％

1.27％

1.17％

1.10％

1.06％

可见，盐对市场上收集的大孢圆孢霉(Staphylotrichumcoccosporum)STCE1基因编码的中性纤维素酶有明显的抑制作用，盐浓度越高，抑制作用越强。

实施例4嗜热毛壳菌纤维素酶的FPA活力温度特性分析

纤维素酶FPA活力(滤纸活力)测试方法：

1.5ml缓冲液+0.05g新华滤纸(1*6cm)→恒温水浴锅中预热5min→测试样中加入1ml稀释酶液→恒温水浴锅中准确反应30min后在每支试管中均加1.5mlDNS溶液终止反应→空白样品试管中补加1ml稀释酶液→所有反应试管均于100℃水浴中煮沸5min，冷却后定容至5ml→540nm，10mm比色皿测定吸光值，根据吸光值与标准曲线计算酶活力。

纤维素酶FPA活力温度特性分析方法：

按上述测试纤维素酶FPA活力方法，在不同温度的条件下准确反应30min，测试出纤维素酶在不同温度下的FPA活力，分析纤维素酶活力随温度变化情况。

具体结果见图6(嗜热毛壳菌纤维素酶的温度特性分析示意图)和图7(市场上收集的大孢圆孢霉(Staphylotrichumcoccosporum)STCE1基因编码的中性纤维素酶的温度特性分析示意图)。如图6所示，本发明嗜热毛壳菌纤维素酶最适作用温度为60℃，最适作用温度范围为57～63℃，在温度为70℃时，酶活力保持仍然在80％以上，很适合在染色中使用。如图7所示，市场上收集的大孢圆孢霉(Staphylotrichumcoccosporum)STCE1基因编码的中性纤维素酶的最适作用温度一般范围为50～53℃。温度超过60℃时，活力急剧下降；温度超过70℃时，活力下降50％左右，该种纤维素酶不适合在染色中使用。可见，本发明将嗜热毛壳菌纤维素酶的最适作用温度提高至57～63℃，与棉用活性染料染色温度一致，可以在恒温(60℃)条件下进行抛光染色一浴，既有利于抛光，又有利于染色，保证染色质量。

实施例5：嗜热毛壳菌纤维素酶在抛光染色一浴工艺中的应用(先加酶，后加染料、再加盐工艺)：

布重：180Kg布种：20S珠地染驼色浴比：1：10

机型：ECO－38－1T溢流染色机(香港立信染整机械有限公司)

按图8所示的工艺流程进行染色：上述抛光染色一浴，取样时织物表面毛羽去除明显，所染颜色要求颜色一致，染色比较均匀，各项牢度指标均合格。

实施例6：嗜热毛壳菌纤维素酶在抛光染色一浴工艺中的应用(先加盐，后加酶、再加染料工艺)：

布重：711Kg布种：20S罗纹染藏青色浴比：1：10

机型：ECO－38－3T溢流染色机(香港立信染整机械有限公司)

按图9所示的工艺流程进行染色：上述抛光染色一浴，取样时织物表面毛羽去除明显，所染颜色要求颜色一致，染色比较均匀，各项牢度指标均合格。

实施例7：嗜热毛壳菌纤维素酶在抛光染色一浴工艺中的应用：

布重：218Kg布种：40S双面布染浅蓝色浴比：1：12

机型：三技两管高温溢流染色机

按图10所示的工艺流程进行染色：上述抛光染色一浴，取样时织物表面毛羽去除明显，所染颜色要求颜色一致，染色比较均匀，各项牢度指标均合格。

实施例8：嗜热毛壳菌纤维素酶在抛光染色一浴工艺中的应用：

布重：858Kg布种：26S平纹布染藏青色浴比：1：12

机型：LAN’sdyeingmachineLTO-6T溢流染色机(香港维喜染整机械有限公司)

按图11所示的工艺流程进行染色：上述抛光染色一浴，取样时织物表面毛羽去除明显，所染颜色要求颜色一致，染色比较均匀，各项牢度指标均合格。

Claims (10)

1.一种嗜热毛壳菌纤维素酶在抛光染色一浴工艺中的应用，所述嗜热毛壳菌纤维素酶按如下方法制得：

1)嗜热毛壳菌纤维素酶基因的合成，合成的嗜热毛壳菌纤维素酶基因的序列如SEQIDNO.2所示,合成的基因编码更加符合里氏木霉高效表达的基因编码；

2)嗜热毛壳菌纤维素酶表达质粒的构建；

3)里氏木霉的转化与嗜热毛壳菌纤维素酶高产菌株的筛选，得到的嗜热毛壳菌纤维素酶的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，分泌到细胞外的嗜热毛壳菌纤维素酶为SEQIDNO.3所示序列的第22-314位氨基酸序列；步骤3)具体为：首先，用EcoRI降解步骤2)构建的质粒形成质粒片段，采用化学转化方法将该质粒片段转入里氏木霉RUTC-30宿主细胞；然后在含有潮霉素B的PDA培养基上培养，再将生长旺盛的菌落接种置PDA培养基上，通过生长和发芽，将孢子再转移到新鲜PDA培养基上，以分离纯化转代稳定的转化子，将这些转化子的孢子接种在木霉纤维素酶诱导培养液，培养后，采样离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳分析；所述木霉纤维素酶诱导培养液的pH值为4.8，用乳糖作为诱导物。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述嗜热毛壳菌纤维素酶为具有嗜盐性能的中性纤维素酶，在10g/L～90g/L浓度范围内的盐对该中性纤维素酶的活性有明显的提升作用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述在10g/L～90g/L浓度范围内的盐为NaCl、Na₂SO₄中的一种或多种。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述嗜热毛壳菌纤维素酶在抛光染色一浴中的适合作用温度为57～63℃。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述嗜热毛壳菌纤维素酶在抛光染色一浴中的最适作用温度为60℃。

6.一种嗜热毛壳菌纤维素酶在抛光染色一浴工艺中的应用，所述嗜热毛壳菌纤维素酶按如下方法制得：

1)嗜热毛壳菌纤维素酶基因的合成，合成的嗜热毛壳菌纤维素酶基因的序列如SEQIDNO.4所示；

2)嗜热毛壳菌纤维素酶表达质粒的构建；

3)毕赤酵母的转化与嗜热毛壳菌纤维素酶高产菌株的筛选，得到的嗜热毛壳菌纤维素酶的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；步骤3)具体为：首先，用SpeI限制性内切酶将步骤2)构建的表达质粒切开后，直接转化毕赤酵母菌；随即挑选多个白色毕赤酵母菌落、培养、诱导后，将菌体与培养液分离，培养液通过SDS-PAGE电泳分析。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述嗜热毛壳菌纤维素酶为具有嗜盐性能的中性纤维素酶，在10g/L～90g/L浓度范围内的盐对该中性纤维素酶的活性有明显的提升作用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述在10g/L～90g/L浓度范围内的盐为NaCl、Na₂SO₄中的一种或多种。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述嗜热毛壳菌纤维素酶在抛光染色一浴中的最适作用温度为57～63℃。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述嗜热毛壳菌纤维素酶在抛光染色一浴中的最适作用温度为60℃。