CN105153049A - 一种丹参素酰胺衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

一种丹参素酰胺衍生物及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种丹参素酰胺衍生物及其制备方法和用途，其中丹参素酰胺类衍生物的结构通式由通式(I)和通式(II)表示：

Description

一种丹参素酰胺衍生物及其制备方法和用途
一、技术领域
本发明涉及一种丹参素酰胺衍生物及其制备方法和用途，具有抑制血小板聚集、抗氧化应激损伤等多重作用，可应用于脑缺血、血管性痴呆等疾病的预防和治疗。
二、背景技术
丹参素是从中药丹参中分离的一种水溶性活性成分，具有抗血小板聚集、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗血栓等作用，为复方丹参滴丸、丹参注射液等的有效成分。由于其结构中含有邻二酚羟基，非常容易发生氧化变质，造成了不稳定性；且结构中含有α-羟基及羧基，能够和葡萄糖醛酸等键合随尿液排出体外，故在体内的半衰期也非常短，需要反复给药，限制了临床应用。
为了提高丹参素的活性并改善其理化性质，国内外许多学者对丹参素进行了结构修饰。目前对丹参素结构改性的报道主要集中在对羧基部位的酯化改造，对羟基位置的酰化修饰等，而酰胺类衍生物的报道较少。
暨南大学王玉强等报道了一系列丹参素川芎嗪衍生物(III)(授权公告号：CN102212008B)，这些衍生物以酯化产物为主，酰胺类化合物仅有两个。此外，他们还研究了化合物对DPPH自由基清除活性及抗氧化活性，其中化合物ADTM(R1＝R2＝R3＝CH3CO)可以有效抑制大鼠心肌缺血后梗死面积，其作用优于丹参素。
复旦大学朱依谆等将丹参素类似物与硝基结合，获得了一系列结构稳定的丹参素衍生物(IV)(授权公告号：CN101607954B)，该化合物具有较好的保护缺氧心肌的作用并具有一定的抗HIV活性。
复旦大学汪洋等将丹参素与L-半胱氨酸衍生物通过酰胺键结合获得了一系列衍生物(V)(公布号：CN103204790A；EuropeanJournalofMedicinalChemistry,2012,55:176-187)，这些衍生物能减少炎症诱导的一氧化氮的释放，并对H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞的氧化应激有较好的保护作用，可应用于心血管保护作用药物。
以上对丹参素的结构修饰多是针对改善心血管保护作用，而针对脑血管相关疾病方面的结构改性报道相对较少。
三、发明内容
本发明旨在提供一种丹参素酰胺衍生物及其制备方法和用途，所要解决的技术问题是遴选合适的分子结构使其具有较优的抗血小板聚集和抗氧化损伤活性，并且具有较优的血脑屏障通透性和低毒性的特点。
本发明解决技术问题采用如下技术方案：
本发明丹参素酰胺衍生物的结构由以下通式(I)表示：
其中：
R1为H时，R2为H、CH3CO或C2H5CO；
R1为CH3CO时，R2为H或CH3CO；
R1为C2H5CO时，R2为H或C2H5CO。
本发明丹参素酰胺衍生物的制备方法，包括酰胺化反应、酯化反应以及后处理各单元过程，其特征在于：
所述酰胺化反应是将丹参素、2-氨甲基-3,5,6-三甲基吡嗪及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)按摩尔比1：1.1：1.2：1.2的比例加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温反应18小时，得到中间产物A；
所述中间产物A的结构式为：
所述酯化反应是将中间产物A、酸酐(R1)2O及催化剂加入四氢呋喃(THF)中，常温反应2-3小时，柱层析分离纯化得到目标产物(I)。
其中：R1＝R2＝CH3CO或C2H5CO时，酯化反应的催化剂选自4-二甲氨基吡啶(DMAP)，中间产物A、酸酐及催化剂的摩尔比为1：3-4：0.2，进一步优选为1：4：0.2；
R2＝H，R1＝CH3CO或C2H5CO时，酯化反应的催化剂选自三乙胺或吡啶，中间产物A、酸酐及催化剂的摩尔比为1：2-3：0.2，进一步优选为1：3：0.2；
R1＝H，R2＝CH3CO或C2H5CO时，酯化反应的催化剂选自三乙胺或吡啶，中间产物A、酸酐及催化剂的摩尔比为1：2-3：0.2，进一步优选为1：3：0.2。
反应过程如下：
本发明丹参素酰胺衍生物的结构由通式(II)表示：
其中：
R1为H或CH3CO时，R2为H或CH3CO。R1、R2可以相同也可以不同。
本发明丹参素酰胺衍生物的制备方法，包括哌嗪酰胺化反应、丹参素酰胺化反应、酯化反应以及后处理各单元过程，其特征在于：
所述哌嗪酰胺化反应是将3，5，6-三甲基吡嗪-2-羧酸、1-Boc-哌嗪及EDC和HOBt按摩尔比1：1.2：1.3：1.3的比例加入DMF中，室温反应20小时，得到中间产物B；中间产物B溶于乙酸乙酯，通入干燥HCl气体30分钟，室温继续反应2小时，得到中间产物C；
所述中间产物B和中间产物C的结构式依次为：
所述丹参素酰胺化反应是将丹参素、中间产物C及EDC和HOBt按摩尔比1：1.2：1.3：1.3的比例加入DMF中，室温反应20小时，得到中间产物D；
所述中间产物D的结构式为：
所述酯化反应是将中间产物D与酸酐(R1)2O及催化剂加入THF中，常温反应2-3小时，柱层析分离纯化得到目标产物(II)。
其中：R1＝R2＝CH3CO时，酯化反应的催化剂选自DMAP，中间产物D、酸酐及催化剂的摩尔比为1：3-4：0.2，进一步优选为1：4：0.2；
R1＝CH3CO、R2＝H或者R1＝H、R2＝CH3CO时，酯化反应的催化剂选自Et3N或吡啶，中间产物D、酸酐及催化剂的摩尔比为1：2-3：0.2，进一步优选为1：3：0.2。
反应过程如下：
本发明目标化合物的代号及结构如下所示：
本发明丹参素酰胺类化合物是将具有钙离子拮抗、抗凝、改善脑血流量等作用的四甲基吡嗪(川芎嗪)通过酰胺键引入丹参素结构而合成的单一化合物。该化合物具有拮抗ADP诱导的血小板聚集、对H2O2所致PC12细胞的氧化损伤也具有较好的保护作用，且血脑屏障通透性大大提高，可作为改良的丹参素衍生物应用于脑缺血、血管性痴呆在内疾病的预防和治疗。
与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：
1、与现有药物丹参素相比，本发明丹参素酰胺衍生物不仅改善了药动学性质，且提高血脑屏障通透性，拓宽了丹参素衍生物在脑部疾病治疗方面的用途。
2、与现有丹参素酯类衍生物相比，本发明的丹参素酰胺衍生物不仅具有较优的抗氧化损伤作用，同时由于川芎嗪结构的引入而强化抗血小板聚集活性，有助于改善供血供氧，从而可用于预防和治疗缺血性脑血管病及血管性痴呆。
四、具体实施方式
实施例1：起始原料2-氨甲基-3，5，6-三甲基吡嗪的制备
制备过程如下：
具体步骤如下：
32mLCCl4加入盛有2,3,5,6-四甲基吡嗪8.7g(63.7mmol)的反应瓶中，再加入N-溴代丁二酰亚胺(NBS)11.54g(64.8mmol)、23mg过氧化苯甲酰，该混合物在200W的白炽灯照射下搅拌回流反应8-9h；反应结束后将反应液冷至5℃以下，抽滤除去丁二酰亚胺，得到棕黄色油状物13.0g，粗产物经硅胶柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝5：1，v/v)得到纯净的2-溴甲基－3，5，6－三甲基吡嗪(1)8.3g，为白色至浅粉色的低熔点固体，收率为60％。1HNMR(CDCl3,300MHz):2.51(m,6H,CH3),2.60(s,3H,CH3),4.57(s,2H,CH2).
将所得的2-溴甲基-3，5，6-三甲基吡嗪4.3g(20mmol)加入12mL乙醇溶于反应瓶中；另取邻苯二甲酰亚胺钾3.7g(20mmol)溶于15mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并将其加入反应瓶中，80℃加热搅拌，TLC监测反应完全，约2h后，减压蒸除溶剂，EtOH重结晶，得无色针状结晶的2-邻苯二甲酰亚胺基-3，5，6-三甲基吡嗪(2)3.5g，收率为62％。
1HNMR(CDCl3,600MHz)2.29(s,3H,CH3),2.44(s,3H,CH3),2.59(s,3H,CH3),4.94(s,2H,CH2),7.75(m,2H,Ph),7.89(m,2H,Ph).
将所得的2-邻苯二甲酰亚胺基-3，5，6-三甲基吡嗪2.8g(10mmol)用15mL无水乙醇溶解，加入1.0mL50％水合肼，加热回流2h，过滤，盐酸溶液调pH值至1-2，有白色不溶物出现，过滤，减压蒸除滤液得盐酸盐，加入20％NaOH，搅拌，用氯仿萃取三次，萃取液干燥浓缩，得到2-氨甲基-3，5，6-三甲基吡嗪0.75g，收率为50％。
1HNMR(CDCl3,500MHz)2.45(s,3H,CH3),2.46(s,3H,CH3),2.48(s,3H,CH3),3.94(s,2H,CH2N).
实施例2：起始原料3,5,6-三甲基吡嗪-2-羧酸的制备
制备过程如下：
具体合成步骤如下：
在一个500mL两口烧瓶中加入2,3,5,6-四甲基吡嗪6.8g(50mmol)和150mL水，搅拌加热至60℃，然后向上述溶液中分批加入高锰酸钾15.8g(100mmol)和100mL水的混悬液，TLC监测原料消失即停止反应；冷至室温，抽滤，滤饼水洗，滤液用3N盐酸调pH值为1-2，氯仿萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，减压浓缩至干，真空干燥得灰白色固体4.32g，收率52％。1HNMR(D2O,300MHz)2.55(s,6H,CH3),2.61(s,3H,CH3)
实施例3：D001(中间产物A)的合成
将丹参素1.0g(5.0mmol)溶于15mLDMF中，并向其中加入EDC·HCl1.15g(6.0mmol)和1-羟基-苯并-三氮唑(HOBt)0.8g(6.0mmol)，室温下搅拌均匀，用冰水浴将反应体系温度降至0℃，逐滴加入实施例1所制备的2-氨甲基-3，5，6-三甲基吡嗪0.83g(5.5mmol)，室温下反应18h，TLC监测反应，待原料反应结束后，向反应体系中加入冰盐水(8wt％NaCl，-4℃，下同)和乙酸乙酯稀释，用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，用冰盐水洗涤3次，洗去有机相中的DMF，有机相用无水Na2SO4干燥，减压浓缩，硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯＝1：3，v/v)，得淡黄色粘稠状产物1.08g，即为D001，产率65％。
1HNMR(d-DMSO，500MHz)：2.39(s,3H,CH3),2.47(s,6H,CH3),2.89(m,1H,PhCH2),2.97(m,1H,PhCH2),4.38(m,1H,CHO),4.63(s,2H,CH2N),6.38(m,1H,Ph),6.58(m,2H,Ph),7.19(s,1H,NH),8.72(br,2H,ArOH)
实施例4：D002的合成
将实施例3所制备的化合物D0010.33g(1mmol)用3mL干燥无水THF溶解，室温下搅拌均匀，用冰浴将反应体系温度降至0℃，向其中加入酰化剂乙酸酐0.38mL(4mmol)和催化剂DMAP25mg(0.2mmol)，室温继续搅拌反应2小时，反应结束后，向反应体系加入饱和NaHCO3溶液，用乙酸乙酯萃取三次，萃取液合并，干燥，减压浓缩，粗品以硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯＝1：2，v/v)，得近白色固体338mg，即为D002，产率74％。
1HNMR(d-DMSO，500MHz)：2.09(s,3H,CH3CO),2.25(s,6H,CH3CO),2.48(s,6H,CH3),2.51(s,3H,CH3),3.08(m,1H,PhCH2),3.17(m,1H,PhCH2),4.70(s,2H,CH2N),5.14(m,1H,CHO),7.05-7.09(m,3H,Ph),7.21(s,1H,NH).
实施例5：D003和D004的合成
将实施例3所制备的化合物D001(1.16g，3.5mmol)用8mL干燥无水THF溶解，室温下搅拌均匀，用冰浴将反应体系温度降至0℃，向其中加入酰化剂乙酸酐0.99mL(10.5mmol)和催化剂三乙胺71mg(0.7mmol)，室温继续搅拌反应3小时，反应结束后，向反应体系加入饱和NaHCO3溶液，用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，干燥浓缩，粗品以硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯＝1：2)，得到两个不同的产物(Rf＝0.45、0.25)，其中Rf＝0.45的产物456mg，经鉴定为酚羟基乙酰化产物D003，分离产率31％。
1HNMR(d-DMSO，500MHz)：2.26(s,6H,CH3CO),2.47(s,6H,CH3),2.50(s,3H,CH3),2.94(m,1H,PhCH2),3.02(m,1H,PhCH2),4.34(m,1H,CHO),4.75(s,2H,CH2N),7.02-7.06(m,3H,Ph),7.19(s,1H,NH).
Rf＝0.25的产物485mg，经鉴定为醇羟基乙酰化产物D004，分离产率37％。
1HNMR(d-DMSO，500MHz)：2.20(s,3H,CH3CO),2.48(s,6H,CH3),2.51(s,3H,CH3),3.04(m,1H,PhCH2),3.18(m,1H,PhCH2),4.79(s,2H,CH2N),5.14(m,1H,CHO),7.05-7.09(m,3H,Ph),7.21(s,1H,NH).
实施例6：D005的合成
合成过程如实施例4，不同的是将实施例4中乙酸酐替换为丙酸酐，产率57％。
1HNMR(d-DMSO，500MHz)：1.09(t,6H,CH3(CH2)),1.14(t,3H,CH3(CH2)),2.29(q,6H,CH2CO),2.47(s,6H,CH3),2.50(s,3H,CH3),3.05(m,1H,PhCH2),3.16(m,1H,PhCH2),4.68(s,2H,CH2N),5.23(m,1H,CHO),7.08-7.12(m,3H,Ph),7.15(s,1H,NH).
实施例7：D006和D007的合成
合成过程如实施例5，不同的是将实施例5中乙酸酐替换为丙酸酐，两个产物的分离产率为38％和30％。
1HNMR(d-DMSO，500MHz)：1.10(t,6H,CH3(CH2)),2.25(q,4H,CH2CO),2.47(s,6H,CH3),2.50(s,3H,CH3),2.89(m,1H,PhCH2),3.04(m,1H,PhCH2),4.46(m,1H,CHO),4.72(s,2H,CH2N),7.04-7.10(m,3H,Ph),7.21(s,1H,NH).
1HNMR(d-DMSO，500MHz)：1.13(t,3H,CH3(CH2)),2.26(q,2H,CH2CO),2.47(s,6H,CH3),2.50(s,3H,CH3),3.03(m,1H,PhCH2),3.18(m,1H,PhCH2),4.70(s,2H,CH2N),5.26(m,1H,CHO),7.06-7.13(m,3H,Ph),7.19(s,1H,NH).
实施例8：中间产物B的合成
取实施例2所制备的3，5，6-三甲基吡嗪-2-羧酸原料1.66g(10mmol)，向其中加入15mLDMF溶解化合物，并向其中加入EDC·HCl2.49g(13mmol)和HOBt1.79g(13mmol)，室温下搅拌均匀，用冰水浴将反应体系温度降至0℃，逐滴加入Boc保护的哌嗪2.23g(12mmol)，室温下反应20h，TLC监测反应，待原料反应结束后，向反应体系中加入冰盐水(8％NaCl，-4℃)和乙酸乙酯稀释，用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，用冰盐水洗涤3次，洗去有机相中的DMF，有机相用无水Na2SO4干燥，减压浓缩，硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯＝1：2，v/v)，得无色粘稠状产物2.24g，即为中间产物B，产率67％。
1HNMR(CDCl3，500MHz)：1.40(s,9H,t-Bu),2.53(s,6H,CH3),2.60(s,3H,CH3),3.22(m,4H,CH2CH2),3.46(m,4H,CH2CH2).
实施例9：中间产物C的合成
取实施例8所制备的中间产物B1.67g(5mmol)溶于乙酸乙酯中，向反应体系中通入干燥HCl气体，室温下反应约2小时，反应结束后，旋干反应液，得近白色粉末状固体0.7g，即为中间产物C，产率52％。
1HNMR(CDCl3，500MHz)：2.50(s,6H,CH3),2.57(s,3H,CH3),3.12(m,4H,CH2CH2),3.36(m,4H,CH2CH2).
实施例10：D008(中间产物D)的合成
合成过程如实施例3，不同的是将实施例3中2-胺甲基-3，5，6-三甲基吡嗪替换为中间产物C，产率为54％。
1HNMR(d-DMSO,500MHz)：2.48(s,6H,CH3),2.52(s,3H,CH3),2.89(m,1H,PhCH2),3.08(m,1H,PhCH2),3.22(m,4H,CH2CH2),3.48(m,4H,CH2CH2),4.42(m,1H,CHO),6.42(m,1H,Ph),6.60(m,2H,Ph),8.78(br,2H,ArOH).
实施例11：D009的合成
将实施例10所制备的化合物D0080.42g(1mmol)用3mL干燥无水THF溶解，室温下搅拌均匀，用冰浴及将反应体系温度降至0℃，向其中加入乙酸酐0.38mL(4mmol)和催化剂DMAP25mg(0.2mmol)，室温继续搅拌反应2小时，反应结束后，向反应体系加入饱和NaHCO3溶液，用乙酸乙酯萃取三次，萃取液合并，干燥，减压浓缩，粗品以硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯＝1：2，v/v)，得近白色固体318mg，产率59％。
1HNMR(d-DMSO,500MHz)：2.09(s,3H,CH3CO),2.25(s,6H,CH3CO),2.46(s,6H,CH3),2.49(s,3H,CH3),3.08(m,1H,PhCH2),3.17(m,1H,PhCH2),3.32(m,4H,CH2CH2),3.58(m,4H,CH2CH2),5.12(m,1H,CHO),7.05-7.09(m,3H,Ph).
实施例12：D010和D011的合成
将实施例10所制备的化合物D008(1.45g,3.5mmol)用8mL干燥无水THF溶解，室温下搅拌均匀，用冰浴及将反应体系温度降至0℃，向其中加入酰化剂乙酸酐0.99mL(10.5mmol)和催化剂三乙胺71mg(0.7mmol)，室温继续搅拌反应3小时，反应结束后，向反应体系加入饱和NaHCO3溶液，用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，干燥浓缩，粗品以硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯＝1：2，v/v)，得到两种产物(Rf＝0.42、0.23)，其中Rf＝0.42的产物647mg，经鉴定为酚羟基乙酰化产物D010，分离产率37％。
1HNMR(d-DMSO,500MHz)：2.25(s,6H,CH3CO),2.48(s,6H,CH3),2.50(s,3H,CH3),2.91(m,1H,PhCH2),3.05(m,1H,PhCH2),3.35(m,4H,CH2CH2),3.63(m,4H,CH2CH2),4.34(m,1H,CHO),7.02-7.06(m,3H,Ph).
Rf＝0.23的产物410mg，经鉴定为醇羟基乙酰化产物D011，分离产率26％。
1HNMR(d-DMSO,500MHz)：2.22(s,3H,CH3CO),2.47(s,6H,CH3),2.50(s,3H,CH3),3.05(m,1H,PhCH2),3.19(m,1H,PhCH2),3.38(m,4H,CH2CH2),3.73(m,4H,CH2CH2),5.24(m,1H,CHO),7.05-7.10(m,3H,Ph).
实施例13：化合物抑制ADP诱导的血小板聚集活性测定
健康新西兰白兔腹主动脉插管取血，以3.8％枸橼酸钠抗凝(血与抗凝剂体积比为9:1)，室温下200g离心10min制备富血小板血浆(Plateletrichplasma，PRP)及贫血小板血浆(Plateletpoorplasma，PPP)。精密吸取10μL不同目标产物溶液或丹参素溶液(浓度均为100μM)加入到280μLPRP中，空白对照组加入等体积DMSO，37℃孵育5min后，用PPP调零，再加入5μg/mL的ADP溶液5μL，于37℃搅拌条件下观察用药前后PRP在5min内的最大聚集率，按照下式计算血小板聚集抑制率。
表1目标化合物拮抗ADP诱导的血小板聚集活性
表1的结果表明：对丹参素进行结构修饰后其抗血小板聚集活性均有一定程度的增强。其中D002、D003和D010的抗血小板聚集活性与川芎嗪(72.60％)较为接近。
实施例14：化合物保护H2O2所致PC12神经细胞损伤的研究
H2O2可促进羟自由基的生成从而引发脂质过氧化反应，最终造成神经细胞损伤。本实验采用H2O2诱导凋亡的PC12细胞作为氧化损伤的药理模型，以丹参素、川芎嗪为对照，噻唑蓝比色法(MTT法)检测细胞活性，研究目标化合物(D001～D011)对PC12神经细胞的保护作用。实验设立空白组、H2O2损伤组及化合物预处理组，每组设10个平行孔，取平均值。实验方法如下：
(1)取处于对数生长期的PC12细胞，按1.0×105接种至96孔板中，培养24小时待细胞贴壁；
(2)放入37℃，5％CO2培养箱培养5h；实验组加入不同剂量的目标化合物溶液，终浓度分别为5μmol·L-1，10μmol·L-1，20μmol·L-1，40μmol·L-1，孵育3小时；每孔分别加入终浓度为150μmol·L-1的H2O2溶液，孵育5h。模型组细胞仅加入终浓度为150μmol·L-1的H2O2溶液，并孵育5h。
(3)每孔加入终浓度为5mg·mL-1的MTT溶液20μL，继续培养4h；
(4)小心吸取并弃去96孔板孔内培养上清液，每孔加入150μLDMSO，37℃孵育振荡10min；
(5)待孔内颗粒完全溶解后，选择波长570nm，用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度(OD值)。
按下式计算化合物对H2O2损伤的PC12细胞存活率：
各化合物的实验结果列于表2。表2的结果表明：与模型组相比，丹参素及其衍生物对PC12细胞存活性均有一定程度的增强，其中D001、D002、D003、D005、D006和D010的保护作用高于丹参素(75.24％)。
实施例15：化合物(D002、D003、D010)的血脑屏障通透性研究
试验过程如下：昆明小鼠72只，雌雄各半，体重范围为20±2g，随机分为12组，每组6只。前6组为丹参素对照组，按10mg/kg剂量尾静脉注射给药，后6组为目标化合物D002试验组，按23.1mg/kg尾静脉注射给药(与丹参素等摩尔剂量)。给药后各组于5min、15min、30min、60min、90min、180min时分别取一组，获得血浆及脑组织，脑组织称重，加入9倍重量的生理盐水制成匀浆，-80℃冷冻备用。
表2目标化合物对PC12细胞存活率的影响
精密吸取血浆或脑匀浆液200μL，加入内标溶液20μL，涡旋混匀，加入1mL甲醇涡旋混合5min进行提取，4000rpm离心10min，取上清液1μL注入HPLC-MS，记录色谱图及D002、丹参素(As)及内标(Ai)的峰面积，根据线性方程计算血浆及脑匀浆中药物含量。
以logBB表示药物的血脑屏障通透性。logBB的定义是：在药物分布达到稳态时，药物在脑中浓度与血中浓度比值的对数值，数学表达式为
logBB＝log(C brain /Cblood)
D002的研究结果如表3所示。
表3目标化合物D002的血脑屏障通透性研究
小鼠经尾静脉注射丹参素后，脑匀浆中检测到的药物浓度在检测限以下或几乎检测不到，无法计算logBB，推测丹参素几乎不通过或很难通过血脑屏障；而D002在给药后15～90min内，logBB处于稳态，平均值为-1.09。
类似地，进行了化合物的D003、D010的血浆及脑部分布研究，它们各自的稳态logBB为-1.25，-1.73。
由以上结果可知：将丹参素改造为酰胺衍生物后其穿透血脑屏障能力均有较大幅度提高，D002、D003及D010稳态logBB可达-1.09,-1.25,-1.73。化合物在血浆中的代谢速度减慢，血药浓度可以维持较长时间；同时该化合物由血液快速转运入脑，并在脑内较长时间保留，其可能还具有较好的脑部靶向作用。
实施例16：对不完全性脑缺血小鼠的脑毛细血管通透性研究
SPF级小鼠按体重均衡随机分为假手术组、模型组、丹参素组(10mg·kg-1)、化合物D002、D003、D010高、中、低剂量(20、10、5mg·kg-1)组。除假手术组、模型组外，其余各组均腹腔注射给药，给药容积为5mL·kg-1，假手术组、模型组给予等容积的溶媒，每3d称量体重1次，根据体重变化调整给药容量，连续腹腔注射7d。
第8d各组小鼠用用动脉夹持续夹闭双侧颈总动脉20min造成不完全性脑缺血。2h后由尾静脉注射2.5％伊文斯蓝溶液(10mL·kg-1)，注射1h后，将小鼠颈椎脱臼处死，开颅取脑，将脑组织清洗，滤纸吸干，浸泡于脑重量10倍体积(kg·L-1)的甲酰胺中，45℃培养箱温育72h，12000r·min-1离心20min，取上清液于620nm处，酶标仪测OD值，如表4所示。
表4各组小鼠脑毛细血管通透性测定结果
*P<0.05vs模型组
表4的结果表明：丹参素给药组的伊文斯蓝透过量与模型组相比有一定程度下降，但差异无统计学意义；而化合物D002、D003、D010三个剂量组的伊文斯蓝透过量均低于模型组，且呈现一定的剂量依赖性，其中化合物D002、D003高、中剂量组的降低程度最为明显，差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。以上结果表明丹参素对不完全性脑缺血小鼠的保护作用较弱；而化合物D002、D003对不完全性脑缺血小鼠的保护作用明显高于丹参素，而D010与丹参素几乎相当或略强。D002、D003对不完全性脑缺血小鼠血脑屏障通透性保护作用增强，这可能与其血脑屏障通透性提高有一定的联系。
实施例17：对血管性痴呆(Vasculardementia,VD)大鼠的乙酰胆碱酯酶、血小板聚集作用的影响
将经过放射状八臂迷宫训练(7天)的SD大鼠随机分为假手术组、VD模型组、丹参素给药组、D003给药组(高、中、低剂量)。采用双侧颈总动脉永久性结扎法制作VD大鼠模型，按照ZeaLonga等5级评分法进行神经功能缺陷评分，分值≥2分的判定为造模成功，剔除达不到评分标准的大鼠。D003按照5mg·kg-1·d-1、10mg·kg-1·d-1、20mg·kg-1·d-1剂量给予药物；模型对照组、假手术组仅给予等量溶媒。每天1次，连续腹腔注射21d。
按照前期训练方法，于第28-29天给药前在固定时间开始八臂迷宫实验。每次实验记录大鼠下列参数：重新进入放饵臂称为工作记忆错误(workingmemoryeror，WME)，进入不放饵臂称为参照记忆错误(refereneememoryeror，RME)。记录10min内每只大鼠每次实验的WME和RME。
SD大鼠行为学实验结束后，次日给药2h后，腹主动脉取血，并制作PRP和PPP用于ADP诱导的血小板聚集率实验。
腹主动脉取血后，将大鼠迅速置于冰台上快速断头取脑，冰浴条件下匀浆，离心，取上清液用于乙酰胆碱酯酶测定。
表5列出VD大鼠的行为学试验结果，表6、7列出大鼠乙酰胆碱酯酶活性、血小板聚集活性的实验结果。
表5VD大鼠的行为学试验结果
*P<0.05vs模型组
表6化合物D003对VD大鼠脑皮质ACh含量及AChE活性的影响
*P<0.05vs模型组
表7化合物D003对ADP诱导的VD大鼠血小板聚集率的影响
表5、6、7的结果表明：与VD模型组相比，D003能有效减小大鼠行为学错误次数，在一定程度上抑制乙酰胆碱酯酶活性并改善血小板聚集。
实施例18：目标产物D003的急性毒性实验
实验动物：昆明小鼠，体重18-22g，雌雄各半，适应性饲养3-4天后进行预试验及正式试验。
药品配制：将目标产物D003溶于PEG400/EtOH中，最大溶解度达到280mg/mL。
实验方法：分别通过小鼠尾静脉注射目标产物D003(800、560、392、274.4、192.1、134.5、94.2、65.9mg/kg)，注射体积以0.1mL/20g体重计算，采用等容量不等浓度单次尾静脉注射给药，每天观察记录动物的外观、精神、行为、摄食等毒性反应和死亡分布情况，连续观察14天。
实验结果：用Bliss法计算半数致死剂量(LD50)及其95％可信限，小鼠尾静脉注射目标产物D003的LD50为398.78mg/kg，95％可信区间为(291.62～633.19)mg/kg，表明目标产物D003的毒性相对较小，临床使用相对安全。

Claims (10)

1.一种丹参素酰胺衍生物，其特征在于其结构由通式(I)表示：
其中：
R1为H时，R2为H、CH3CO或C2H5CO；
R1为CH3CO时，R2为H或CH3CO；
R1为C2H5CO时，R2为H或C2H5CO。
2.一种权利要求1所述的丹参素酰胺衍生物的制备方法，包括酰胺化反应、酯化反应以及后处理各单元过程，其特征在于：
所述酰胺化反应是将丹参素、2-氨甲基-3,5,6-三甲基吡嗪、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑按摩尔比1：1.1：1.2：1.2的比例加入DMF中，室温反应18小时，得到中间产物A；
所述中间产物A的结构式为：
所述酯化反应是将中间产物A、酸酐(R1)2O及催化剂加入THF中，常温反应2-3小时，柱层析分离纯化得到目标产物(I)。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
R1＝R2＝CH3CO或C2H5CO时，酯化反应的催化剂为4-二甲氨基吡啶，中间产物A、酸酐及催化剂的摩尔比为1：3-4：0.2；
R2＝H，R1＝CH3CO或C2H5CO时，酯化反应的催化剂选自三乙胺或吡啶，中间产物A、酸酐及催化剂的摩尔比为1：2-3：0.2；
R1＝H，R2＝CH3CO或C2H5CO时，酯化反应的催化剂选自三乙胺或吡啶，中间产物A、酸酐及催化剂的摩尔比为1：2-3：0.2。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：
R1＝R2＝CH3CO或C2H5CO时，中间产物A、酸酐及催化剂的摩尔比为1：4：0.2；
R2＝H，R1＝CH3CO或C2H5CO时，中间产物A、酸酐及催化剂的摩尔比为1：3：0.2；
R1＝H，R2＝CH3CO或C2H5CO时，中间产物A、酸酐及催化剂的摩尔比为1：3：0.2。
5.一种权利要求1所述的丹参素酰胺衍生物的用途，其特征在于：在制备治疗缺血性脑血管病及血管性痴呆药物中的应用。
6.一种丹参素酰胺衍生物，其特征在于其结构由通式(II)表示：
其中：
R1为H或CH3CO时，R2为H或CH3CO。
7.一种权利要求6所述的丹参素酰胺衍生物的制备方法，包括哌嗪酰胺化反应、丹参素酰胺化反应、酯化反应以及后处理各单元过程，其特征在于：
所述哌嗪酰胺化反应是将3，5，6-三甲基吡嗪-2-羧酸、1-Boc-哌嗪及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑按摩尔比1：1.2：1.3：1.3的比例加入DMF中，室温反应20小时，得到中间产物B；中间产物B溶于乙酸乙酯，通入干燥HCl气体，室温继续反应2小时，得到中间产物C；
所述中间产物B的结构式为：
所述中间产物C的结构式为：
所述丹参素酰胺化反应是将丹参素、中间产物C及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑按摩尔比1：1.2：1.3：1.3的比例加入DMF中，室温反应20小时，得到中间产物D；
所述中间产物D的结构式为：
所述酯化反应是将中间产物D与酸酐(R1)2O及催化剂加入THF中，常温反应2-3小时，柱层析分离纯化得到目标产物(II)。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：
R1＝R2＝CH3CO时，酯化反应的催化剂为4-二甲氨基吡啶，中间产物D、酸酐及催化剂的摩尔比为1：3-4：0.2；
R1＝CH3CO、R2＝H或者R1＝H、R2＝CH3CO时，酯化反应的催化剂选自三乙胺或吡啶，中间产物D、酸酐及催化剂的摩尔比为1：2-3：0.2。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于：
R1＝R2＝CH3CO时，中间产物D、酸酐及催化剂的摩尔比为1：4：0.2；
R1＝CH3CO、R2＝H或者R1＝H、R2＝CH3CO时，中间产物D、酸酐及催化剂的摩尔比为1：3：0.2。
10.一种权利要求6所述的丹参素酰胺衍生物的用途，其特征在于：在制备治疗缺血性脑血管病及血管性痴呆药物中的应用。
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