CN105142570A - 包封装置 - Google Patents

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Abstract

本文提供了细胞包封装置，其包含适用于保持生物活性剂的内室，其中所述内室被安排在第一个半渗透层和第二个半渗透层之间，且将第一个和第二个半渗透层安置于围绕内室周边的支撑框架上；其中所述支撑框架包含第一个框架元件和第二个框架元件，且第一个和第二个框架元件，以预定的所述层之间的间距，共同决定第一个和第二个半渗透层的位置。

Description

包封装置
发明领域
本发明涉及用于包封生物活性剂的装置的领域。具体而言，生物活性剂可以是适用于植入活体动物诸如哺乳动物体内的细胞。
发明背景
存在用于体内植入的改善的包封装置的需求。具体而言，存在与现有装置相比制备简单但具有改善的生物相容性的装置的需求。此外，存在改善生物活性剂、诸如植入后的包封细胞的生存力、成熟和/或分化性质和功能的装置的需要。
包括细胞在内的多种生物活性剂可以包埋入包含半渗透膜的植入装置中，并植入体内。所述半渗透膜通常允许营养素、生长因子和小生物活性剂进入而达到所述包封的细胞，但阻止免疫系统的细胞进入。所述半渗透膜还阻止细胞从包封装置流出。所述植入物的另一个功能可以是促进装置周围的血管形成以增加所述细胞的存活。例如，US6,060,640和US6,773,458中公开了用于包封细胞的适合的植入装置。
发明概述
因此，在一个方面，本发明提供了细胞包封装置，其包含适用于保存活细胞的内室，其中所述内室被安排在第一个半渗透层和第二个半渗透层之间，且第一个和第二个半渗透层安置在围绕内室周边的支撑框架上；其中所述支撑框架包含第一个框架元件和第二个框架元件，且第一个和第二个框架元件，以预定的在第一个和第二个半渗透层之间的间距，共同决定了第一个和第二个半渗透层的位置。
在一个实施方案中，将第一个半渗透层安置于第一个框架元件上，并将第二个半渗透层安置于第二个框架元件上，且第一个和第二个框架元件相互连接以包围内室周边。
优选地第一个和第二个框架元件各自包含(a)与第一个或第二个半渗透层连接的安置区域和(b)间隔区域，由此当第一个和第二个框架元件相互连接时，各间隔区域被置于安置区域之间，并一起限定所述层之间的预定的间距。
在一个实施方案中，支撑框架还包含装载口(loadingport)，可以经其将物质和/或细胞悬液引入内室。在另一个实施方案中，所述装置包含在第一个和/或第二个半渗透层与支撑框架之间的粘合封条(adhesiveseal)。
优选第一个和第二个框架元件经超声焊接(ultrasonicallywelded)在一起。在另一个优选的实施方案中，第一个和/或第二个半渗透层经超声焊接至所述框架。
在一个实施方案中，第一个和第二个半渗透层各自包含与内室接触的膜层以及网状物层，所述网状物层覆于膜层上达到内室的外部。优选地膜层包含聚丙烯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯或聚四氟乙烯。优选地所述网状物层包含尼龙、钛、不锈钢、聚对苯二甲酸乙二酯、聚四氟乙烯或聚酯。
在一个实施方案中，将哺乳动物细胞包封在内室中。优选包封细胞为人细胞。更优选包封细胞源自诱导性多能干细胞(iPSCs)，例如包封细胞为在包封前已经从iPSCs至少部分分化的细胞。最优选地包封细胞是胰腺祖细胞。
在另一个实施方案中，包封在内室中的细胞能生成和/或分泌治疗剂。治疗剂可以是例如治疗性蛋白质、肽、核酸或其他生物学活性剂。在一个特定的实施方案中，治疗剂可以是抗体或其片段、DNA分子或RNA分子。可以使用重组DNA技术将细胞工程化以生成治疗剂，例如细胞可以是表达外源性多肽或其他治疗剂的重组细胞。
在进一步的方面，本发明提供了制备根据任意前述权利要求的细胞包封装置的方法，其包括将第一个和第二个半渗透层安置于支撑框架上以在所述装置内围起内室，其中所述支撑框架包含第一个框架元件和第二个框架元件，且第一个和第二个框架元件，以预定的在第一个和第二个半渗透层之间的间距，共同决定了第一个和第二个半渗透层的位置。
在一个实施方案中，所述方法包括将第一个半渗透层安置于第一个框架元件上，将第二个半渗透层安置于第二个框架元件上，并使第一个和第二个框架元件包围内室周边。
在进一步的方面，本发明提供了分化细胞的方法，其包括将细胞包封在如上文定义的装置中，并将装置植入活体哺乳动物中。
在一个实施方案中，所述哺乳动物并非人类，且所述包封细胞是人细胞。在另一个实施方案中，所述哺乳动物是人，且所述包封细胞是人细胞。
在另一个实施方案中，所述哺乳动物并非人类，且所述包封细胞是非人类细胞。
在进一步的方面，本发明提供了在有需要的个体中预防或治疗糖尿病的方法，其包括将如上文定义的包含胰腺祖细胞的装置植入个体中。
在一个实施方案中，胰腺祖细胞在植入个体中后分化为功能性的葡萄糖响应性胰岛细胞。
在上文定义的方法的一些实施方案中，所述装置被皮下植入。在供选的实施方案中，所述装置可在鞘内、脑内或腹膜内位置被植入。
在进一步的方面，本发明提供了如上文定义的装置在哺乳动物体内用于分化包封细胞的用途。
附图简述
图1显示一个如本文所述的包封装置的实施方案的透视图。
图2显示如本文所述的包封装置的侧视图。
图3显示在图2中所示的包封装置的F位置的截面图。
图4显示图3中所示的截面图的G区的扩大图。
图5显示如本文所述的包封装置的下部的透视图。
图6显示如本文所述的包封装置的下部的侧视图。
图7显示在图6中所示的包封装置的下部的D位置的截面图。
图8显示图7中所示的截面图的E区的扩大图。
图9显示如本文所述的包封装置的装配的示意图。
图10显示本发明的包封装置的平面图。
图11显示在植入本文所述的装置后在不同的时间在小鼠中的葡萄糖-刺激的人C-肽水平，所述装置包含人胰腺祖细胞，所述细胞已经从人iPSCs预先分化。
图12显示在植入本文所述的装置后在不同的时间(以周计)在小鼠中的葡萄糖清除(即，葡萄糖刺激后，在以分钟计的各时间的葡萄糖水平)，所述装置包含人胰腺祖细胞，所述细胞已经从人iPSCs预先分化。
图13显示由包封的工程化的细胞在小鼠皮下植入后达到的抗体血浆水平。
发明详述
在本发明的实施方案中，将包含在室内的细胞的各半渗透层安置于支撑框架结构上，其以对应于内室深度的预定的间距精确地决定所述层的位置。所述框架通常在内室周边完全包围半渗透层的边缘，这避免了在装置外表面出现半渗透层的粗糙的边缘，并改善生物相容性。有利地，支撑框架可仅由两个元件形成，所述元件相互连接以限定所述层间的间距并将它们固定就位。这避免了对置于所述层之间单独间隔物的需求，其简化了制备方法，并有助于提供的光滑的装置外表面。所述支撑框架还可包含集成的装载口，其有助于将物质引入装置的内室，并可简化制备方法。
细胞包封装置
本发明的实施方案涉及用于保存活细胞的包封装置。所述装置通常可以植入动物中，诸如哺乳动物，包括人。在一个实施方案中，所述装置包含能完全包封细胞于其中的、生物相容的免疫隔离装置和任选与之组合的一种或多种生物学活性剂。
细胞保存在装置中的室中。通常所述室被完全包围，例如包括围绕细胞的连续的壁结构，使得细胞不能从室中脱离。
在一些实施方案中，可将细胞装入所述室中的生物相容的基质材料中或排列于其上，诸如水凝胶。适合的基质材料包括聚乙烯醇(PVA)、藻酸盐、琼脂糖、明胶、胶原蛋白、聚乙二醇、纤维蛋白和脱乙酰壳多糖。所述基质可以是例如凝胶、微珠或海绵形式。可在装置制备期间(即将细胞引入室中之前)将基质加入室中，或者可在载入细胞的同时将基质加入室中。在一些实施方案中，可先将细胞与基质(例如与多孔的微珠)组合，然后将包含细胞的所述基质载入室中。
本文所述的包封装置的实施方案不意欲限于某种装置尺寸、形状、设计、体积容量和/或用于制备包封装置的材料，除非在本文在独立权利要求中另外限定。
细胞
可包封至本文描述的装置中的细胞可以包括任何类型的动物细胞、优选哺乳动物细胞或人细胞。通常在植入后细胞对个体可具有治疗益处。适合的细胞包括同种异体细胞和异种细胞、自体细胞或其衍生物。例如，从个体获得干细胞或体细胞并从这些细胞获取治疗细胞群可能是合乎需要的。该过程通常降低对植入细胞的免疫应答的风险。适用于包封装置的示例性的细胞类型包括多能干细胞或其衍生物的聚集的或单一的细胞悬液，优选诱导性多能干(iPS)细胞、更优选人诱导性多能干(hiPS)细胞。在特定的实施方案中，细胞可包含胰腺祖细胞、葡萄糖响应性β细胞、胰岛素生成细胞、限定性内胚层细胞、胰岛细胞、肿瘤细胞或或其任意组合。
诱导性多能干(iPS)细胞是源自非多能细胞的多能干细胞。SeeZhou等(2009)、CellStemCell4:381-384；Yu等、(2009)Science324(5928):797-801、EpubMarch26、2009；Yu等(2007)Science318(5858):1917-20、EpubNovember20、2007；Takahashi等、(2007)Cell、131:861-72；和TakahashiK.和YamanakaS.(2006)、Cell126:663-76。从其收获非多能细胞的动物可以是脊椎动物或无脊椎动物、哺乳动物或非哺乳动物、人或非人动物。动物源的实例包括但不限于灵长类动物、啮齿类动物、犬科动物、猫科动物、马科动物、牛科动物和猪类动物。多能细胞可以使用本领域技术人员已知的任何方法传代，包括手工传代方法和批量传代方法诸如酶或非酶传代。
在本发明的一个实施方案中，通过将人诱导性多能干细胞分化为可以进一步分化为胰、肝和其他细胞、组织和器官的细胞类型来生成细胞。例如，限定性内胚层可以在体外分化为将在体内生成胰岛素的胰腺祖细胞，用于治疗胰岛素依赖性1型和2型糖尿病(参见例如US7,534,608、US7、510,876和US7,695,965)。另外的适合的用于包封的细胞类型包括PDX1-阴性前肠内胚层细胞、前肠内胚层细胞或肠内胚层细胞；PDX1-阳性、背侧偏移的(dorsally-biased)、前肠内胚层细胞、PDX1-阳性前肠内胚层细胞或PDX1-阳性内胚层；胰腺祖细胞、PDX1-阳性胰内胚层细胞、PDX1-阳性胰腺祖细胞、胰上皮细胞、PDX1-阳性胰内胚层端细胞、胰内分泌前体细胞、胰内分泌祖细胞、胰内分泌细胞、胰激素分泌细胞、胰岛激素-表达细胞或其等同物。
该细胞类型由特定的细胞表面或其他标记物的组合的表达来定义，例如如WO2010/057039中所定义。测定分子表达的方法为本领域技术人员所熟知，且包括但不限于Northern印迹、RT-PCR、原位杂交、蛋白质印迹法和免疫染色。胰岛激素-表达细胞可以是成熟或不成熟的，且能基于细胞标记物的表达和功能特性来区分。该细胞可以是多激素的(poly-hormonal)或单激素的(singly-hormonal)，例如表达一种或多种胰激素诸如胰岛素、胰高血糖素、脑肠肽、促生长素抑制素和胰多肽或其组合。
在一些实施方案中，包封的细胞可以是多潜能的(pluripotent)、多能的(multipotent)、寡能的(oligopotent)或甚至单能的。在某些实施方案中，包封细胞是多能的可分化细胞。优选，包封在装置中的细胞是多能或祖细胞，其能进一步分化为至少部分成熟的细胞。用于本文的"部分成熟的细胞"可包括没有最终分化的细胞。例如，部分成熟的细胞可显示来自相同器官或组织的成熟细胞的至少一种特征性表型、诸如形态学或蛋白质表达，但能够进一步分化为至少一种其他细胞类型。例如，正常的成熟肝细胞通常表达诸如以下的蛋白质：白蛋白、纤维蛋白原、α-1-抗胰蛋白酶、凝血素凝集因子(prothrombinclottingfactors)、转铁蛋白和解毒酶(detoxificationenzymes)、诸如细胞色素P-450等等。因此用于本文的“部分成熟的肝细胞”可表达白蛋白或其他一种或多种蛋白质，或开始体现正常的成熟肝细胞的外观或功能。
在另外的实施方案中，包封细胞可从胎盘或绒毛膜组织获得，或从更成熟的组织获得，其包括但不限于脂肪、骨髓、神经组织、乳房组织、肝组织、胰腺组织、上皮组织、呼吸组织、性腺组织和肌肉组织。在特定的实施方案中，包封细胞为成体干细胞。在其他实施方案中，包封细胞为源自胎盘或绒毛膜的干细胞。
可从任何类型的动物收获细胞，例如脊椎动物或无脊椎动物、哺乳动物或非哺乳动物、人或非人动物。动物来源的实例包括但不限于灵长类动物、啮齿类动物、犬科动物(canines)、猫科动物(felines)、马科动物(equines)、牛科动物(bovines)和猪类动物(porcines)。
在一些实施方案中，多能细胞可在包封在装置中之前先在体外被至少部分分化。通常，细胞可以通过与细胞分化环境接触在体外分化。可使用细胞分化介质或环境以使本文所述的多能细胞部分分化、最终分化或可逆分化。例如，细胞分化环境的介质可包含多种组分，包括例如KODMEM培养基(Knockout达尔伯克改良伊格尔培养基)、DMEM、Ham'sF12培养基、FBS(胎牛血清)、FGF2(成纤维细胞生长因子2)、KSR或hLIF(人白血病抑制因子)。细胞分化环境还可以包含补充物，诸如L-谷氨酰胺、NEAA(非必需氨基酸)、P/S(青霉素/链霉素)、N2、B27和β-巯基乙醇(β-ME)。本发明考虑到可以向细胞分化环境中添加额外的因子，包括但不限于纤连蛋白、层粘连蛋白、肝素、硫酸肝素、视黄酸、表皮生长因子家族(EGF)的成员、成纤维细胞生长因子家族(FGF)的成员(包括FGF2、FGF7、FGF8和/或FGF10)、血小板源性生长因子家族(PDGF)的成员、转化生长因子(TGF)/骨形成蛋白(BMP)/生长和分化因子(DGF)家族拮抗剂，包括但不限于头蛋白(noggin)、卵泡抑素、腱蛋白、gremlin、cerberus/DAN家族蛋白、ventropin、高剂量活化素和amnionless或其变体或功能片段。还可以以TGF/BMP/GDP受体-Fc嵌合体的形式添加TGF/BMP/GDP拮抗剂。可以添加的其它因子包括可以使通过Notch受体家族信号传导激活或失活的分子，包括但不限于δ-样和Jagged家族的蛋白以及Notch加工或切割的抑制剂，或其变体或功能片段。其它生长因子可以包括胰岛素样生长因子家族(IGF)成员、胰岛素、无翅相关(WNT)因子家族和hedgehog因子家族或其变体或功能片段。可以添加其它因子来促进中内胚层干/祖细胞、内胚层干/祖细胞、中胚层干/祖细胞、或限定性内胚层干/祖细胞增殖和存活以及这些祖细胞衍生物的存活和分化。
在一个优选的实施方案中，包封细胞为胰腺祖细胞。所述细胞可通过从诱导性多能干细胞体外分化来适合地制备，例如使用如Schulz等(2012年5月)PLoSONE7(5):e37004中描述的方法，以及在体内生成包封的功能性β细胞。
源自成体分化细胞的诱导性多能干(iPS)细胞是唯一适用于细胞疗法应用的细胞，因为它们是多能的和可自我恢复的。由于分化多能干细胞培养物中可以出现众多种细胞类型，成功达到有效、定向的分化对人多能干细胞的治疗应用至关重要。各种生长因子、信号传导因子和小分子可用于尝试将多能干细胞直接体外分化为中间细胞类型、诸如胰腺细胞谱系。
可以通过对所需要的细胞系的标志物基因特征的表达以及可分化细胞类型的标志物基因特征的表达的缺乏进行定量，来监测可分化细胞向所需要细胞系的进展，或其在未分化状态的维持。定量此类标志物基因的基因表达的一种方法是使用定量PCR(Q-PCR)。本领域熟知进行Q-PCR的方法。本领域已知的其它方法也可用于定量标志物基因表达。可以通过使用针对该所关注的标志物基因的特异性抗体来检测标志物基因表达。
待包封在室内的细胞在植入后不必定需要在体内进一步分化。例如，在另外的实施方案中，在包封的时候细胞可已经完全分化。细胞可源自任何来源，包括不是多能的细胞系或细胞类型。例如，在一些实施方案中，可将包封细胞工程化以生成和/或分泌治疗剂、诸如多肽(例如抗体、生长因子或肽激素)或多核苷酸(例如DNA或RNA分子)。因此包封细胞可源自表达外源性多肽或其他治疗剂的重组细胞系。
半渗透层
所述内室被安排在第一个和第二个半渗透层之间。每个半渗透层可由一个或多个亚层组成，例如每个半渗透层可包含层状结构。在一些实施方案中，所述亚层中仅一个是半渗透性的。
在一个实施方案中，所述半渗透层具有使得对细胞存活和功能重要的氧和其他分子可以通过该半渗透层、但细胞(例如包封细胞和/或宿主免疫系统的细胞)不能渗透或通过孔的孔径。
在其中装置还包封一种或多种生物学活性剂例如血管生成因子、生长因子或激素的实施方案中，半渗透层优选另外允许所述包封的有益的生物活性物质通过所述层，以提供达到在装置外的宿主组织或有机体中的靶细胞的通路。
在一个优选的实施方案中，半渗透层允许个体中存在的一种或多种营养素通过所述层以向包封细胞提供必需营养素。例如，在一个其中包封细胞是生成胰岛素的胰β细胞或它们的前体细胞的实施方案中，半渗透层允许葡萄糖和氧刺激所述胰岛素生成细胞以释放胰岛素，同时防止免疫系统细胞识别和消灭所植入的细胞。在一个优选的实施方案中，半渗透膜阻止植入细胞脱离包封。
优选半渗透层(或一个或多个其亚层)由在生理条件、特别是生理学pH和温度下起作用的生物相容的材料构成。可用于半渗透层中的适合的材料的实例包括但不限于聚酯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、非均质性材料(anisotropicmaterials)、聚砜(PSF)、纳米纤维垫、聚酰亚胺、四氟乙烯/聚四氟乙烯(PTFE；也称为)、ePTFE(膨胀性聚四氟乙烯)、聚丙烯腈、聚醚砜、丙烯酸树脂、醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚酰胺、以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)膜。适合的材料由例如Phillips和制备。
优选，对包封在装置中的细胞和/或宿主组织或生物体而言所述半渗透层是化学惰性的或无毒的。所述半渗透层优选允许分泌或释放生物学活性剂(其是由所包封的细胞产生的，或是被所述细胞所包封的)穿过所述装置,以及优选促进大分子扩散的快速动力学。在另外的实施方案中，半渗透层可促进包封细胞的长期稳定性。例如，半渗透层可促进装置的血管形成，由此增加营养素和氧进入包封细胞。
在一些实施方案中，半渗透层包含两个或更多个亚层，例如为层状结构。例如，半渗透层可以是包含2、3或4个亚层的层状结构。在一个特别优选的实施方案中，半渗透层包含与内室接触的第一个亚层以及第二个亚层，所述第二个亚层覆于第一个亚层之上达到内室的外部，即第一个亚层位于装置的内部，且第二个亚层位于装置的外部。
优选第一个亚层包括与室内的细胞相容的膜，且其具有允许溶质传送但防止细胞进入或流出的孔径。适合地，膜的孔径应当小于约2μm(即2微米)以防止进入血管结构。更优选地，小于约0.6μm(即0.6微米)的孔径是优选的，以防止细胞(包括巨噬细胞、异物巨细胞和成纤维细胞)进入装置的内室。在包封可能尤其易受免疫攻击影响的细胞的装置中应当使用更小的孔径，例如在异种移植物或同种异体移植物的情况中。在同种移植物(isografts)(自体植入物)的情况中，孔径应当足以防止包封细胞从室中离开。“孔径”意指材料的最大孔径。孔径可使用常规始沸点方法测定，如例如PharmaceuticalTechnology,1983年5月,第36至42页中所描述。
优选膜层包含聚丙烯、聚碳酸酯、PET或PTFE。例如，在一个实施方案中，使用具有约25微米的厚度和约0.4微米的最大孔径的半渗透性的PTFE膜材料。膜层的代用材料包括聚乙烯、醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚酯、尼龙、聚砜材料、纤维素、聚偏二氟乙烯、丙烯酸材料、硅酮和聚丙烯腈。
优选地第二个亚层包括网状物层，其通常用作血管形成膜。“血管形成膜”意指该亚层促进宿主组织中在装置周围的血管结构的生长。第二个亚层还可为第一个亚层提供机械支撑或机械保护。
宿主组织-装置界面附近的血管形成可以取决于装置中存在的膜材料的性质。参见例如Brauker等，Neovascularizationatamembrane-tissueinterfaceisdependentonmicroarchitecture,第四届世界生物材料大会(TransactionsoftheFourthWorldBiomaterialsCongress)四月24-28日,1992第685页；Brauker等,Neovascularizationofimmunoisolationmembranes:Theeffectofmembranearchitectureandencapsulatedtissue,Transplantation1:163,1992。
因此，第二个亚层优选包含具有约0.01至约1mm(即0.01至1毫米)的平均标称孔径的网状物。优选，膜的至少约50％的孔具有约0.01至约1mm的平均大小。
所述网状物层通常由纤维或丝条(strands)或聚合物材料形成。这些丝条通常为具有一个远大于另两个维度的维度的伸长/拉长的结构。
用于网状物层或血管形成膜的适合的材料包括尼龙、聚酯和PTFE。在一个实施方案中，网状物层由尼龙制备，且具有约0.12mm的孔径。例如，WO92/07525和WO96/10966中公开了另外的适合的物质。
例如US6,060,640和US5,344,454中公开了用于细胞包封和植入的层状的半渗透性结构。例如，可使用非渗透性聚合粘合剂的交叉杂交(criss-crossing)模式使用BIOPORETM膜材料(其用作同种异体移植的免疫隔绝膜)将GORE-TEXTM膜材料(其用作血管形成-促进膜)制成薄层(laminate)。
支撑框架
所述装置还包含支撑框架，所述第一个和第二个半渗透层安置于该支撑框架上。所述框架为半渗透层的提供了支撑，并决定它们的位置，从而限定了内室的尺寸。支撑框架包围半渗透层的周边，例如由此其在内室周围封闭了所述层之间的空间。
所述支撑框架通常是化学惰性的，且可发挥为装置提供稳定的机械性能的作用。支撑框架还可发挥保持装置的完整性的作用，例如通过在半渗透层的周边防止细胞泄漏至装置内或外来发挥该作用。所述支撑框架可包含一个或多个装载口以方便将物质加入内室和/或从内室移出。通常可以将支撑框架(和/或半渗透层)灭菌。
所述支撑框架可由任何适合的生物相容的材料制备，优选能向半渗透层提供机械支撑并保持装置整体上的完整性的耐用材料。可例如从适合的聚合物材料、诸如聚丙烯或聚醚醚酮(PEEK)或者从陶瓷或金属材料、诸如钛、钛合金或不锈钢形成支撑框架。
在本发明的实施方案中，支撑框架由第一个框架元件和第二个框架元件组成。第一个和第二个框架元件可例如机械衔接/啮合(engage)或互锁和/或可焊接在一起形成支撑框架的总体结构。优选使用超声焊接来接合和/或封闭第一个和第二个框架元件。优选第一个和第二个框架元件焊接在一起，基本环绕支撑框架的整个周边。
第一个和第二个框架元件，以预定的在第一个和第二个半渗透层之间的间距，共同决定第一个和第二个半渗透层的位置，由此决定内室的深度。例如，可将第一个半渗透层安置于第一个框架元件上，并将第二个半渗透层安置于第二个框架元件上。当第一个和第二个框架元件相互连接时，它们可包围内室周边。这种类型的排列避免了单独的间隔物元件的需要，简化装置的制备，并防止半渗透膜的粗糙的边缘暴露于装置的外部。因此在本发明的实施方案中，支撑框架和作为整体的包封装置的外形尽可能平滑。这改善了生物相容性，并由此改善了包封细胞在体内植入后的生存力。
在一些实施方案中，可通过超声焊接将第一个和/或第二个半渗透层安置于支撑框架上。在另外的实施方案中，在半渗透层邻接支撑框架的区域可使用粘合剂。所述粘合剂可用于封闭半渗透层和框架之间的接合处，例如防止液体泄漏至内室内或外。粘合剂还可有助于半渗透层固定于框架，无论半渗透层是否还经超声焊接于框架。粘合剂可在环绕内室外周的一部分或整个外周使用，例如沿第一个和/或第二个半渗透层的周边的一部分或整个周边，和/或沿第一个和/或第二个框架元件的内表面的一部分或整个内表面。可使用任何适合的生物相容的粘合剂。在一个实施方案中，使用光可聚合(photo-polymerisable)的粘合剂。
考虑到上文所述的原因，所述支撑框架可具有任何适合的几何形状或尺寸。在特定的实施方案中，支撑框架的形状可以基本上是圆形、椭圆形的或基本是矩形的。优选支撑框架基本上是椭圆形至矩形形状的。根据特定应用，支撑框架尺寸可显著不同，但长度可以例如是约5至100mm、10至50mm、20至30mm或约25mm。
支撑框架与安置于其上的第一个和第二个半渗透层一起可限定装置的内室的几何形状。内室可形成不同形状或形态，但沿支撑框架的长尺寸所定义的纵轴通常基本上是椭圆至矩形的形状，且其截面(即在垂直于纵轴的横轴)可以是，例如基本上是矩形的。
第一个和第二个半渗透层通常位于基本平行的平面，所述层间分隔相对窄。该分隔限定了内室的深度，且可通过第一个和第二个半渗透层在支撑框架上安置位置的相对间距来确定。在具体的实施方案中，第一个和第二个半渗透层之间的间距(即内室的深度)可以是例如0.05至10mm、0.2至5mm、0.3至1mm或0.4至0.8mm。
有利地，本发明的实施方案能使第一个和第二个半渗透层以精确的间距安置。通过以该方式控制内室的深度，根据室内细胞的确切性质，可以实现包封细胞的分化、生长和维持的最优条件。例如，半渗透层的间距可以影响内室中包封的细胞对氧和其他营养素的可得性，因为这些物质需要扩散通过半渗透层。因此与具有较低代谢需要量的细胞类型相比，高速生长和/或代谢的细胞类型(例如其具有较高的需氧量)可能需要被包封在具有较小的半渗透层间间距的装置中。本发明的实施方案允许间距被改变并针对不同的细胞类型进行测试，而且允许为包封细胞的最佳生存力选择所述的所述室的适合的深度。
在一些实施方案中，所述支撑框架可还包含用于在体内植入后保持包封装置在适合位置的锚定工具。所述锚定工具可包含例如一个或多个钩、夹或适用于将装置安置在软组织中的其他固定元件。或者，所述锚定工具可包含在支撑框架中的一个或多个孔或洞，缝线可通过其将装置固定在体内。
所述装置中细胞的包封
一旦得到了需要的细胞(例如多能或部分分化细胞，被工程化以表达重组产品的细胞和/或表达如上文所讨论的治疗剂的细胞)，可将细胞引入用于体内植入的装置的内室中。植入通常诱导(进一步)细胞向特定的谱系分化。
就包封至装置中而言，细胞可以以各种类型的混悬液或其他液体制剂的形式制备。在一个实施方案中，可将细胞混悬于适合的液体培养基中、诸如生长或分化培养基中。所述液体培养基可包含用于活细胞的生长或维持的生理学可接受的水溶液。例如，所述液体培养基可包含细胞在体外和/或体内所需要和使用的葡萄糖、盐、矿物质、缓冲剂、氨基酸、激素和生长因子。例如U.S.专利7,432,104中描述适合的液体介质。
在一个实施方案中，使用生物相容的聚乙二醇(PEG)包封细胞。例如US7,427,415、US6,911,227和US5,529,914中更详细地描述了基于PEG的包封。还可以使用任何适合的生物相容的基质或水凝胶、诸如聚乙烯醇(PVA)、藻酸盐、琼脂糖、明胶、胶原蛋白和脱乙酰壳多糖包封细胞。
可以以各种细胞密度将细胞包封在装置中。例如，包封装置可包含约1x105或1x106细胞/ml至约1x1010细胞/ml或更高的细胞密度。可将细胞与另外的物质一起例如通过装载口引入装置中，所述装载口可集成至装置中，且可提供至内室的入口。在一些实施方案中，在将细胞引入包封装置中后可将装载口密封(例如通过塞子、粘合剂或焊接)。
在一些情况中，在包封前测定所述细胞的活力和/或功能性以确定它们用于例如移植的适用性是合乎需要的。这可以使用本领域已知的多种方法实现。例如，可以使用活体染料使细胞染色，该活体染料例如台盼蓝或溴化乙锭或吖啶橙。在优选的的实施方案中，适用于移植的细胞群为至少约50％、至少约75％、至少约95％或至少约99％是存活的。在其他实施方案中，可以测定细胞的形态测定特征作为用于植入的细胞适合性的度量。
或者，可以测定细胞某些细胞表面标记物(例如胰祖细胞或激素分泌细胞标记物)或功能性(例如胰岛素或其他胰激素的生成)的存在，以确定它们是否适合用于移植(参见例如US7,534,608)。
所述装置的体内植入
一旦已经将细胞包封在装置中，可以将装置植入活体动物中、例如哺乳动物(诸如人或非-人哺乳动物)中。可将所述装置植入各个部位中，包括皮肤以下(例如皮下)。或者，可将装置植入鞘内、脑内、骨内或腹腔内的部位。
通常将所述装置固定在植入部位以将包封细胞保持在植入部位，并允许例如表达的和分泌的治疗剂从植入部位扩散。在一个实施方案中，所述植入部位位于或非常接近作为治疗焦点的组织或器官。在其他方面，其中从所述装置分泌的活性剂的递送不是位置依赖性(例如其中治疗剂可有效地分泌至体循环中)，可以将装置植入远的位置。例如，在优选的实施方案中，将包封装置皮下植入至例如前臂、胁腹或背或腿上的皮肤之下，其中其保持直至手术移除。
植入后，包封细胞通常分化为提供有用效果的特定的细胞类型。装置中的分化的细胞在多个研究领域具有应用，所述领域包括但不限于药物发现、药物开发和试验、毒理学、治疗目的的细胞生产以及基础科学研究。所述细胞类型可表达在广阔范围的研究领域中有吸引力的分子，诸如细胞因子、生长因子、细胞因子受体、细胞外基质、转录因子、分泌的多肽和其他分子、以及生长因子受体。
因此在一个实施方案中，植入如本文所述的包封装置的非-人哺乳动物可用作动物模型用于研究疾病和/或疾病的治疗。或者，可从所述装置提取分化的细胞(例如在从动物移除植入装置后)，并用于进一步的体外应用，例如疾病的体外研究中。无论在哪种情况下，在一些实施方案中，包封细胞可源自与宿主动物不同的物种。例如，包封细胞可以是人，且宿主动物可以是非人动物，例如啮齿类动物、诸如小鼠或大鼠或另外的物种的实验哺乳动物。
在另外的实施方案中，植入装置可直接用于在宿主动物治疗或预防疾病。或者，从植入装置的第一种宿主动物提取的分化细胞可用于在第二种动物个体中治疗疾病，例如将提取的分化的细胞引入第二种动物中后。治疗的动物可以是哺乳动物、诸如人。
在特定的实施方案中，包封细胞可用于治疗代谢紊乱。例如，在包含适合的包封细胞的装置植入罹患糖尿病的个体后，糖尿病或其一种或多种症状可以被改善或减轻一段时间。在该类实施方案中，包封细胞通常是胰腺祖细胞或群体，PDX1-阳性胰腺祖细胞或群体、内分泌前体细胞或群体、多或单-激素内分泌细胞、胰岛素-生成胰β胰岛细胞或其任何其他前体。
在一些实施方案中，在植入后在包封装置中细胞在体内存活至少1小时、1天、1周、1个月、3个约、6个月或1年或更多，其具有以下功能性：代表了在植入时或在细胞完全成熟或达到功能的最高水平(例如在植入祖细胞的情况中，所述祖细胞需要在体内进一步发育或成熟为功能细胞)时所表达的至少50％、75％、95％或99％或更高的功能。通常可基于有吸引力的生物活性剂的生成或活性来测定功能性，例如在胰β胰岛细胞或它们的前体细胞的情况中，基于胰岛素的生成或对葡萄糖清除率的作用。
现将仅以例举方式参考以下具体实施方案来进一步描述本发明。
实施例1
图1显示本发明的包封装置1的一个实施方案。该装置1包含被支撑框架3围绕的第一个和第二个半渗透层。在图1中仅可见第一个(在最上面的)半渗透层2。包封装置具有整体上椭圆形至矩形的形状，且还包含装载口4，通过该装载口能将物质(包括细胞)引入，以及用于在体内将该装置定位在组织内的锚定工具18。
图2显示同样的包封装置1的侧视图。装载口4和锚定工具18被集成于支撑框架3中。第一个和第二个半渗透层的周边被支撑框架3完全包围且在图2中不可见。
图3显示经图2中所示的包封装置1的F位置的截面图。该装置1包含第一个和第二个框架元件5和6，它们相互连接来形成支撑框架3。第一个和第二个半渗透层2和7被安置于支撑框架3上。第一个和第二个半渗透层2和7和支撑框架3一起围起在该装置中的内室8。
图4是图3中所示的截面图的G区的扩大图。第一个和第二个框架元件5和6衔接以形成支撑框架。将第一个和第二个半渗透层在安置区域9连接于第一个和第二个框架元件5和6(仅标出了在第一个框架元件5上的安置区域9)。第一个和第二个框架元件5和6的间隔区域10(仅标出了第一个框架元件5上的间隔区域10)位于安置区域9之间且一起确定了第一个和第二个半渗透层2和7之间的间距12。间距12限定了内室8的深度。粘合剂13封闭第一个和第二个半渗透层2和7各自与第一个和第二个框架元件5和6之间的结合处，特别是在间隔区域10(仅标出了粘合第一个框架元件5和第一个半渗透层2的粘合剂)。
图5显示包封装置1的下部的透视图，其包含第二个框架元件6、安置于其上并用粘合剂13封闭的第二个半渗透层7。
图6显示所述装置同样部分的侧视图。
图7显示经在图6中所示的包封装置1的下部的D位置的截面图。
图8显示图7中所示的截面图的E区的扩大图。图8还显示了第二个半渗透层7由连接内室8的膜层14和在所述装置的外侧覆盖于膜层14上的网状物层15组成。第二个半渗透层7(尤其是其网状物层15)被安置于第二个框架元件6提供的突出部分17上。该突出部分17支撑第二个半渗透层7并且与第一个框架元件5的相应的配置和第一个半渗透层2一起限定了所述的层之间的间距和内室的深度。
图9显示包封装置1的装配的示意图。在步骤1中，将由膜材料14(例如PTFE)和网状物材料15(例如聚酯)组成的层状的薄片切割为第二个半渗透层7的形状。在步骤2，将第二个半渗透层7经超声焊接至第二个框架元件6(由例如聚丙烯制备)上。以类似的方式将第一个半渗透层2经超声焊接至第一个框架元件5(由例如聚丙烯制备)上。在步骤3，然后将第一个和第二个框架元件5和6经超声焊接在一起以形成包封装置1，其以包含集成的装载口4、集成的锚定工具18和第一个半渗透层2的框架3显示。
各种工具和技术可用于将膜14和网状物15材料切割为适合的形状，将半渗透层2和7焊接至第一个和第二个框架元件5和6上，以及将第一个和第二个框架元件5和6焊接在一起。例如，可将超声焊头/底座(sonotrode/nest)配置用于超声波焊，其中将待焊接的材料置于超声焊头和底座之间。在一些实施方案中，可专门修改超声焊头和/或底座以将用于焊接的相应的组分精确地放置。
图10是类似装置的平面图，显示装载口提供了将细胞引入内室的入口。在一些实施方案中，在将细胞引入包封装置后，可将装载口切割然后封闭(例如通过塞子、粘合剂或焊接)。
实施例2
人β细胞的可再生来源将极大地有益于基础研究和细胞疗法。胰腺祖细胞可以在体外从人多能干细胞分化；随后胰腺祖细胞在体内的移植导致功能性的β细胞生成。Schulz等(2012年5月)PLoSONE7(5):e37004公开了胰腺祖细胞从一组多能干细胞系分化的方案，在体内得到包封的功能性β细胞。使用这些新建立的方法，将被部分分化细胞包封在如实施例1所述的装置中以在体内完成iPSC-来源的胰腺祖细胞的分化(CellularDynamics公司提供的未分化的iPSC系)。
将所述组细胞载入使用若干不同类型的膜制备的装置中，以评价对于最优的细胞存活、血管形成和功能性胰岛细胞分化而言的最佳的装备。将负载细胞的装置皮下植入免疫受损的小鼠中。接受了包封的移植物的动物对葡萄糖刺激有应答，生成人C-肽(图11)，并显示更快的葡萄糖校正(图12)。
总之，这些结果证明了能够在体外从人iPSCs分化胰腺祖细胞，并将其包封至如本文所述的装置中。所述包封细胞在体内进一步分化和成熟成为葡萄糖响应性功能性胰岛细胞。这些结果使得能够开发IPSC-来源的人化的胰模型，用于的进一步研究基因组与功能关系。
将以上说明书提及的所有出版物均作为参考引入本文。本领域技术人员会明白本发明描述实施方案的各种改进和改变，而不背离本发明的范围和精神。尽管已经结合特定的优选实施方案描述了本发明，但应理解所要求的本发明不应当被不适当地限定于所述特定的实施方案。实际上，对于细胞生物学、生物医学工程和生物技术或相关领域技术人员而言显而易见的用于实施本发明的所描述的模式的各种改进预期涵盖在随后权利要求的范围内。
实施例3
基因工程细胞系的植入可以用于在体内长期递送治疗性蛋白质。将C2C12小鼠成肌细胞细胞系基因工程化以分泌治疗性抗体。将细胞以低密度载入装置中。将负载细胞的装置在同种异体条件下皮下植入成年小鼠中。使用特定的ELISA从血样定量测定抗体血浆水平。植入后7周，在小鼠血浆中检测到抗体。15周后，抗体水平稳定在约40μg/ml(参见图13)。在体内19周后取回植入物，并在体外测定分泌水平。装置平均分泌119μg/24小时(±66μg/24小时)。组织学分析显示C2C12细胞在装置的室中以非常高密度存活。
总之，这些结果证实了本发明的装置能够支持渐进性扩展(progressiveexpansion)和大量的工程化的细胞长期存活。因此，可以达到治疗的抗体血浆水平。这些结果验证了免疫隔离的同种异体基因工程细胞系作为用于递送治疗性重组蛋白质的供选方法的用途。

Claims (31)

1.包含适用于保存活细胞的内室的生物分子包封装置，其中所述内室被安排在第一个半渗透层和第二个半渗透层之间，且第一个和第二个半渗透层被安置于围绕内室周边的支撑框架上；其中所述支撑框架包含第一个框架元件和第二个框架元件，且第一个和第二个框架元件，以预定的所述层之间的间距，共同决定第一个和第二个半渗透层的位置。
2.根据权利要求1的装置，其中将所述第一个半渗透层安置于第一个框架元件上，并将第二个半渗透层安置于第二个框架元件上，且第一个和第二个框架元件相互连接以包围内室周边。
3.根据权利要求1或权利要求2的装置，其中第一个和第二个框架元件各自包含(a)与第一个或第二个半渗透层连接的安置区域和(b)间隔区域，由此当第一个和第二个框架元件相互连接时，各间隔区域被置于安置区域之间，并一起限定所述层之间的预定的间距。
4.根据权利要求1至3中任意一项的装置，其中第一个和第二个框架元件经超声焊接在一起。
5.根据权利要求1至3中任意一项的装置，其中第一个和/或第二个半渗透层经超声焊接至所述框架。
6.根据权利要求1至3中任意一项的装置，其还包含在第一个和/或第二个半渗透层和支撑框架之间的粘合封条。
7.根据权利要求1至3中任意一项的装置，其中所述支撑框架还包含装载口，经其可以将物质引入内室。
8.根据权利要求1至3中任意一项的装置，其还包含用于在体内将装置定位在组织内的锚定工具。
9.根据权利要求1至3中任意一项的装置，其中第一个和第二个半渗透层各自包含与内室接触的膜层和覆于膜层之上达到内室的外部的网状物层。
10.根据权利要求9的装置，其中所述膜层包含聚丙烯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯或聚四氟乙烯和/或网状物层包含尼龙、钛、不锈钢、聚对苯二甲酸乙二酯、聚四氟乙烯或聚酯。
11.适用于保持包封在内室中的哺乳动物细胞的根据权利要求1至10中任意一项的装置。
12.根据权利要求11的装置，其中所述包封细胞为人细胞。
13.根据权利要求11或权利要求12的装置，其中所述包封细胞为当植入活体哺乳动物体内时能够在所述装置中进一步成熟或分化的细胞。
14.根据权利要求11或权利要求12的装置，其中将包封细胞工程化以表达重组产物。
15.根据权利要求11或权利要求12的装置，其中所述包封细胞能够生成治疗剂。
16.根据权利要求11或权利要求12的装置，其中所述包封细胞用于免疫耐受或免疫接受者。
17.制备根据权利要求1至16中任意一项的生物分子包封装置的方法，其包括将第一个和第二个半渗透层安置于支撑框架上以在所述装置内围起内室，其中所述支撑框架包含第一个框架元件和第二个框架元件，且第一个和第二个框架元件，以预定的所述层之间的间距，决定第一个和第二个半渗透层的位置。
18.根据权利要求17的方法，其包括将第一个半渗透层安置于第一个框架元件上，将第二个半渗透层安置于第二个框架元件上，并衔接第一个和第二个框架元件以包围内室周边。
19.根据权利要求17或权利要求18的方法，其包括将第一个和/或第二个半渗透层超声焊接至第一个和/或第二个框架元件上。
20.根据权利要求17或权利要求18的方法，其包括将第一个和第二个框架元件超声焊接在一起。
21.分化细胞的方法，其包括将细胞包封在如权利要求1至10中任意一项所定义的装置中，并将装置植入活体哺乳动物中。
22.向活体哺乳动物中表达重组产物的方法，其包括包封工程化的细胞，以在如权利要求1至10中任意一项所定义的装置中表达重组产物。
23.在活体哺乳动物中生成治疗剂的方法，其包括包封工程化的细胞，以在如权利要求1至10中任意一项所定义的装置中生成治疗剂。
24.诱导免疫耐受或免疫活体哺乳动物的方法，其包括在如权利要求1至10中任意一项所定义的装置中包封细胞。
25.根据权利要求21至24中任意一项的方法，其中所述哺乳动物是非人动物。
26.根据权利要求21至24中任意一项的方法，其中所述包封细胞是人细胞。
27.根据权利要求21至24中任意一项的方法，其中所述装置被皮下、鞘内、骨内或脑内植入。
28.如权利要求1至10中任意一项所定义的装置用于在体内在哺乳动物中分化包封细胞的应用。
29.如权利要求1至10中任意一项所定义的装置用于在体内在哺乳动物中表达重组产物的应用。
30.如权利要求1至10中任意一项所定义的装置用于在体内在哺乳动物中生成治疗剂的应用。
31.如权利要求1至10中任意一项所定义的装置用于在体内免疫哺乳动物或免疫耐受的应用。
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