CN105132504A - 高浓底物体系制备谷氨酰胺肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了高浓底物体系制备谷氨酰胺肽的方法。本发明以谷朊粉为原料，通过提高酶解体系中谷朊粉的浓度水解制备富含谷氨酰胺的小肽，具体包括步骤：（1）谷朊粉的酶解：将谷朊粉与水按质量比1:1～1:1.5混合，加入蛋白酶，在50～60℃酶解4-12h，得谷朊粉酶解液；（2）将谷朊粉酶解液灭酶，喷雾干燥，得到谷氨酰胺肽。本发明制备的谷氨酰胺肽中谷氨酰胺的含量在27-29%之间，明显高于目前商业化的谷氨酰胺肽。

Description

高浓底物体系制备谷氨酰胺肽的方法

技术领域

本发明涉及谷氨酰胺肽制备技术领域，具体涉及高浓底物体系制备谷氨酰胺肽的方法。

背景技术

谷氨酰胺(Glutamine)是谷氨酸的γ-羧基酰胺化的氨基酸，是构成蛋白质的氨基酸之一，分子量146.15Da，分解温度185℃，等电点5.65，属中性氨基酸。作为20种构成蛋白质的基本氨基酸之一，谷氨酰胺占人体全身游离氨基酸一半以上，是机体含量最丰富的氨基酸，人体内的谷氨酰胺主要储存于脑、骨骼肌和血液中。因此，谷氨酰胺被认为是目前所知的最重要的氨基酸之一，并被称为“条件性必需氨基酸”。谷氨酰胺肽是一类含有谷氨酰胺肽的总称。由于谷氨酰胺在肽链的氮端时不稳定，易转化为焦谷氨酸，因此，谷氨酰胺肽常指当含有非氮端谷氨酰胺的肽类。与游离谷氨酰胺相比，谷氨酰胺肽的稳定性和溶解性都会大大提高，因此谷氨酰胺肽是实现游离谷氨酰胺稳定化的有效途径。谷氨酰胺肽的活性常用肽中非氮端谷氨酰胺的含量和肽的分子量来表征。

以谷朊粉为原料，经调浆、蛋白酶酶解、分离、过滤、喷雾干燥等工艺制成小麦面筋蛋白酶解产物，商品名为小麦低聚肽。面筋蛋白酶解产物或小麦低聚肽中均含有大量谷氨酰胺肽。2012年中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会根据《中华人民共和国食品安全法》和《新资源食品管理办法》有关规定，批准了小麦低聚肽作为新资源食品。

据报道，小麦低聚肽具有保护胃肠粘膜、抗氧化、增强免疫力、缓解运动疲劳和提升耐缺氧能力等活性。杨小军等发现对SD大鼠灌喂小麦蛋白的胃蛋白酶解物，能够提高SD大鼠免疫器官的重量，增加肠道SIgA的分泌量，改善肠道免疫功能。周业飞等利用弹性蛋白酶制得的小麦蛋白酶解物可提高AA肉鸡免疫器官的重量和免疫器官指数。王石等研究表明，在仔猪断乳日粮中添加小麦蛋白酶解物能有效降低仔猪的腹泻率，且效果优于血浆蛋白添加组。

关于谷氨酰胺肽的制备主要有两种途径:一是通过化学法合成，目前已见上市的主要是二肽，有丙氨酰谷氨酰胺(Ala-Gln)和甘氨酰谷氨酰胺(Gly-Gln)两种,这两种肽主要以注射类液体药剂的形式存在；二是通过蛋白酶控制酶解植物蛋白如小面面筋蛋白获得富含谷氨酰胺的肽段。这两种方法各有利弊:化学合成法存在价格高和有机试剂难以完全去除等潜在安全隐患，优点是产品中谷氨酰胺含量较高，目前主要用于医药领域；蛋白酶酶解谷朊粉制备谷氨酰胺肽反应条件温和，无有毒有害成分生成，但酶解产物中谷氨酰胺含量相对低，目前酶解产物主要用于食品及保健食品领域。根据面筋蛋白控制酶解制备谷氨酰胺肽体系溶剂的不同，可分为水体系和乙醇体系。下面分别进行介绍。

1992年,日本学者Tanabe等人首次以小麦面筋蛋白水溶液为原料,采用Molsin在37℃酶解24h，之后采用Actinase E在pH 7.0、37℃酶解24h制得谷氨酰胺肽，经SephadexG-15纯化后得到谷氨酰胺肽中非氮端Glx(谷氨酰胺+谷氨酸)含量达50.33g/100g。将该谷氨酰胺肽喂养节食大鼠和饲料中添加甲氨蝶呤的大鼠，结果发现谷氨酰胺肽与模拟氨基酸混合物相比，能增加节食大鼠的粘膜蛋白质含量，改善甲氨蝶呤诱导的小肠结肠炎。近年来,中国学者对谷氨酰胺肽的酶解制备工艺进行了深入的研究。吉林农业大学马洪龙利用碱性蛋白酶水解小麦面筋蛋白的最适条件：pH 8.0，温度70℃，酶浓度4％，底物浓度7％，反应时间150min。在此条件下，酶解产物中的有效谷氨酰胺含量为17.65％，占酶解样品中Glx(Gln与Glu之和,含量22.83％)的77.31％，三氯乙酸氮溶指数为77.86％，蛋白含量76.03％，游离氨基酸含量2.06％，说明酶解产物的有效Gln含量高，且肽含量高。刘文豪采用胰蛋白酶和碱性蛋白酶双酶连续酶解小麦面筋蛋白制备谷氨酰胺肽，在底物浓度3g/100mL、pH8.0的条件下，先经胰蛋白酶在48℃下酶解2h，再用碱性蛋白酶在68℃条件下酶解时间80min后制得较高含量的谷氨酰胺肽，经10000Da透析后产品有效谷氨酰胺含量为21.35g/100g。蔡木易等人公开了一种以小麦谷朊粉为原料，采用Alcalase和木瓜蛋白酶两次分步酶解制得小麦谷氨酰胺肽的方法。其制备工艺如下：将小麦谷朊粉以100：6-12(L：kg)的液料比与水混配调浆，调整pH值范围为9-11，加热至50-80℃，保温搅拌20-60min。然后将反应罐中的碱性料液泵入片式离心机中，分离成清液和渣料。收集渣料，将渣料加水稀释，加热至50-80℃，搅拌并分离。同样的处理方式重复3次。纯化后的渣料以100：40-50的水渣比加水混合、搅拌，调pH至7-9，加热至40-60℃，按每克蛋白质2000-5000U加入Alcalase，反应3-5小时。然后，按每克蛋白质1000-2000U酶量加入木瓜蛋白酶，温度45-55℃，酶解1-2小时。最后，将酶解液加热灭酶。小麦蛋白酶解液用管式离心机离心，取离心清液，用孔径0.05-0.1μm的微滤和超滤设备进行过滤。小麦蛋白酶解液经浓缩、脱色、膜过滤和喷雾干燥，得小麦谷氨酰胺肽粉。经检测，该方法所制备的谷氨酰胺肽混合物中分子量小于1000Da的组分占90％以上，谷氨酰胺-精氨酸-谷氨酰胺(Gln-Arg-Gln，QRQ)的含量在2.0％以上。谷氨酰胺肽其中的谷氨酰胺含量达到23.54％。

上述工艺制备的面筋蛋白酶解物中谷氨酰胺含量普遍在20％-25％左右，明显低于母体谷朊粉中谷氨酰胺的含量，其原因是：(1)部分蛋白酶有一定的谷氨酰胺酶活力；(2)酶解产生部分游离谷氨酰胺和氮端含谷氨酰胺的肽，这两者均不稳定。(3)热处理和酸碱处理导致面筋蛋白发生脱酰胺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高浓底物体系制备谷氨酰胺肽的方法，克服现有技术存在的上述不足。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

高浓底物体系制备谷氨酰胺肽的方法，该方法包括如下步骤：

(1)谷朊粉的酶解：将谷朊粉与水按质量比1:1～1:1.5混合，加入蛋白酶，在50～60℃酶解4-12h，得谷朊粉酶解液；

(2)将谷朊粉酶解液灭酶，喷雾干燥，得到谷氨酰胺肽。

进一步地，步骤(1)中所述的蛋白酶的谷氨酰胺酶活力小于1GTU/ml或1GTU/g。

进一步地，步骤(1)中所述的蛋白酶为Alcalase2.4L、 37071、风味蛋白酶500MG和诺维信Neutrase中任意一种。

进一步地，步骤(1)中所述的蛋白酶的添加量为谷朊粉重量的0.5％-2％。

进一步地，步骤(2)中所述的灭酶条件85～95℃灭酶10～15min。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

本发明提供的谷氨酰胺肽的制备方法，其氮溶指数、分子量分布以及TCA可溶性氮含量与传统方法无明显差异，但水解产物中谷氨酰胺含量明显提高。本发明制备的谷氨酰胺肽中谷氨酰胺的含量在27-29％之间，明显高于目前商业化的谷氨酰胺肽。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。

谷氨酰胺酶活力定义为：催化谷氨酰胺酶水解产生谷氨酸和氨离子。一个谷氨酰胺酶单位(GTU)定义为：在37℃，pH6.0条件下将L-谷氨酰胺(浓度1％)转化为1μmol的L-谷氨酸所需要的酶量。测定方法参照：Wakayamam,Yamagata T,Kamemura A,et al.Characterizationof salt-tolerant glutaminase from StenotrophomonasmaltophiliaNYW-81 and itsapplication in Japanese soy sauce fermentation[J].IndMicrobiolBiotechnol,2005,32(9):383-390.

实施例1

将谷朊粉与1.5倍水混合，添加谷朊粉重量1％的不同蛋白酶，55℃水解10h，95℃灭酶10min，喷雾干燥得谷氨酰胺肽。不同商品化蛋白酶的谷氨酰胺酶活力测定结果见表1，谷氨酰胺含量如表2。申请人发现大部分商品化的蛋白酶均有一定的谷氨酰胺催化讲解活力。

表1

由表1可见，大部分商品化蛋白酶酶制剂具有一定的谷氨酰胺酶催化活力，说明商品化酶制剂中本身含有谷氨酰胺酶或是蛋白酶具有谷氨酰胺酶催化活力。其中性蛋白酶6号的谷氨酰胺酶活力达到18.49GTU/g。谷氨酰胺酶为来自日本味之素公司，标注活力为100GTU/g，测定结果为112.05GTU/g。

表2

由表2可见，众多蛋白酶中谷氨酰胺酶活力较高的中性蛋白酶6号、木瓜蛋白酶和丹尼斯克碱性蛋白酶所制备的谷氨酰胺肽中谷氨酰胺含量均低于25％，而蛋白酶中谷氨酰胺酶活力较低的诺维信37071、诺维信Neutrase、诺维信Alcalase和风味蛋白酶500MG所制备的谷氨酰胺肽中谷氨酰胺含量一般在26％-29％。

实施例2

将谷朊粉与不同比例重量水混合，添加谷朊粉重量1％的诺维信37071，60℃水解7h，90℃灭酶15min，喷雾干燥得谷氨酰胺肽。

表3

由表3可见，随着酶解体系中加水比例的增加，谷氨酰胺肽中谷氨酰胺的含量呈下降趋势。当谷朊粉与水按质量比1:1～1:1.5混合时，谷氨酰胺肽中谷氨酰胺的含量在27％左右。

实施例3

将谷朊粉与1.5重量水混合，添加谷朊粉重量2％的风味蛋白酶500MG，60℃水解12h，92℃灭酶13min，喷雾干燥得谷氨酰胺肽。谷氨酰胺肽中谷氨酰胺的含量为26.8％。

Claims (5)

1.高浓底物体系制备谷氨酰胺肽的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

（1）谷朊粉的酶解：将谷朊粉与水按质量比1:1～1:1.5混合，加入蛋白酶，在50～60℃酶解4-12h，得谷朊粉酶解液；

（2）将谷朊粉酶解液灭酶，喷雾干燥，得到谷氨酰胺肽。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述的蛋白酶的谷氨酰胺酶活力小于1GTU/ml或1GTU/g。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述的蛋白酶为Alcalase2.4L、Novozym® 37071、风味蛋白酶500MG和诺维信Neutrase中任意一种。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述的蛋白酶的添加量为谷朊粉重量的0.5%-2%。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（2）中所述的灭酶条件85～95ºC灭酶10～15min。