CN115521963A - 一种谷氨酰胺肽及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种谷氨酰胺肽及其制备方法与应用。该谷氨酰胺肽的制备方法包括以下步骤：谷朊粉经加热处理后添加半胱氨酸搅拌；所得料液控温调节pH值，加入蛋白酶酶解2～8h；酶解结束后将反应体系灭酶，离心收集上清液，适度浓缩后喷雾干燥或冷冻干燥，得到谷氨酰胺肽。本发明得到的谷氨酰胺肽小分子肽段占比高，同时非氮端谷氨酰胺含量超过29％，明显高于以往报道的谷氨酰胺肽。

Description

一种谷氨酰胺肽及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物活性肽制备领域，具体涉及一种谷氨酰胺肽及其制备方法与应用。
背景技术
谷氨酰胺(Glutamine)是谷氨酸羟基酰胺化的氨基酸，其分子量为146.15Da，等电点5.65，是20种构成蛋白质的基本氨基酸之一，约占人体游离氨基酸总量的60％，主要存在于脑、血液和肌肉中。谷氨酰胺不是必需氨基酸，它在人体内可由谷氨酸、缬氨酸、异亮氨酸合成，但在疾病、营养状态不佳或高强度运动等应激状态下，机体对谷氨酰胺的需求量增加，以致自身合成不能满足需要，因此也被称为“条件必需氨基酸”。据报道，谷氨酰胺在提高免疫力、改善肠道健康、促进术后恢复、提高运动能力、促进肌肉生成、促进疲劳恢复都有着不错的效果，在临床上也有相关谷氨酰胺药物治疗肠胃病如过敏性肠炎、溃疡等。然而，因其自身在水中溶解度低，同时不稳定，在酸性条件下易分解为谷氨酸、加热会生成有毒的焦谷氨酸，使其在肠外营养液中的应用有所限制。谷氨酰胺肽，一种或一类含有谷氨酰胺的肽，可作为谷氨酰胺的稳态化供体，相较游离谷氨酰胺有着更高的溶解度、更好的稳定性与生理活性。其中，因为谷氨酰胺在肽链氮端时和游离谷氨酰胺一样存在不稳定的情况，因此谷氨酰胺肽的活性、谷氨酰胺的含量常用非氮端谷氨酰胺含量表示。
目前关于谷氨酰胺肽的制备主要有两种方法：化学合成法和酶解法。化学法合成目前已见上市的主要是二肽,有Ala-Gln和Gly-Gln两种,这两种肽主要以注射类液体药剂的形式存在,价格也相对高些；酶解法相对温和且无毒害作用，但存在着非氮端谷氨酰胺含量低的问题。近年来，随着人们对食品、药品安全重视程度的提高，酶解法制备谷氨酰胺肽将更具优势。1992年，日本学者首次以谷朊粉为原料，采用两种酶分步酶解的方法，制备出总谷氨酸(Glu+Gln)含量50.33％的谷氨酰胺肽，我国近年来也有学者相继通过各种工艺制备出谷氨酰胺肽，但以报道的谷氨酰胺肽中非氮端谷氨酰胺含量普遍低于28％。
小麦面筋蛋白(谷朊粉)是小麦粉经水洗去淀粉与可溶性物质后剩下的复杂黏性蛋白，是淀粉生产加工的副产物。小麦面筋蛋白的蛋白含量约为70％-80％，在其氨基酸组成中，总谷氨酸(Gln+Glu)含量达到35％以上，是制备谷氨酰胺肽的良好原料。然而，小麦面筋蛋白是主要由麦醇溶蛋白与麦谷蛋白构成的高分子蛋白聚合体，麦醇溶蛋白和麦谷蛋白间通过氢键、疏水作用、范德华力等次级作用和分子间、内二硫键相互作用,形成紧密的三维结构,这就决定了小麦面筋蛋白存在遇水发生团聚、溶解度低等问题，在酶解的过程中存在酶解进程较慢、酶解效率低的问题。使用物理化学改性可以提高小麦面筋蛋白酶解效率，通过此方法制备谷氨酰胺肽，具有更高的非氮端谷氨酰胺含量，具有很好的安全性和营养活性、并且具有很好的加工特性可以添加到很多食品当中，因此本发明具有很好的意义。
现有文献报道小麦面筋蛋白经半胱氨酸处理后，用碱性蛋白酶酶解，离心冻干得到的谷氨酰胺肽，其相较于较未经半胱氨酸处理的小麦面筋蛋白用蛋白酶酶解制得的谷氨酰胺肽，非氮端谷氨酰胺含量有所提高，但是存在制得的谷氨酰胺肽的非氮端谷氨酰胺含量较低，同时酶解效率不高等问题(张海华.小麦面筋蛋白源谷氨酰胺肽的酶解制备、结构分析与生理活性研究[D].江南大学,2011.)。
发明内容
本发明需要解决小麦面筋蛋白酶解制备谷氨酰胺肽的过程中，酶解效率过低，制得的谷氨酰胺肽非氮端含量低的技术问题，本发明的目的在于提供一种谷氨酰胺肽及其制备方法与应用。一种谷氨酰胺肽的制备方法是以小麦面筋蛋白(谷朊粉)为原料，采用物理化学改性协同酶解制备谷氨酰胺肽的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一种谷氨酰胺肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将水加热至60℃～90℃保温，将谷朊粉按质量比(谷朊粉:水＝1:8～1:12)缓慢加入水中同时搅拌，搅拌保温15～60min；
(2)将步骤(1)所得料液放至室温，加入谷朊粉质量0.5％～2％的半胱氨酸搅拌10～30min；
(3)调节步骤(2)所得料液pH值到7～9，控温45℃～60℃，加入谷朊粉质量0.5％～2％的蛋白酶，酶解2～8h；
(4)酶解结束后将反应体系灭酶，离心收集上清液，适度浓缩后喷雾干燥或冷冻干燥，得到谷氨酰胺肽。
进一步地，步骤(3)所述蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶或Protamex复合蛋白酶中的一种。
进一步地，步骤(4)所述灭酶为85～95℃保温10～15min；
进一步地，步骤(4)所述离心为4～10℃下，8000～10000g离心10～20min；
进一步地，步骤(4)所述浓缩为55℃抽真空浓缩，浓缩至固形物质量百分含量为30％～50％。
进一步地，步骤(4)所述喷雾干燥，进风温度160～210℃，出风温度70～120℃。
进一步地，步骤(4)所述冷冻干燥的温度为-50～-40℃。
本发明提供所述制备方法制备得到的一种谷氨酰胺肽。
进一步地，所述制备方法制得的谷氨酰胺肽中，分子量小于500Da的组分占比为58.24％-68.56％，分子量小于1000Da的组分占78.88％以上，非氮端谷氨酰胺含量在29％-31％之间，相较于仅通过步骤(3)蛋白酶酶解得到的谷氨酰胺肽，其酶解效率与非氮端谷氨酰胺含量均有明显提高。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
1、本发明通过结合物理化学改性的方法提高谷朊粉的酶解效率，降低了酶解时间和加酶量，节约了成本，具有更好的经济效应。
2、本发明得到的谷氨酰胺肽其非氮端谷氨酰胺含量均高于29％，明显高于以往报道的谷氨酰胺肽。
3、本发明结合加热处理和添加食品级半胱氨酸协同商业蛋白酶酶解食源性蛋白，产品安全，无毒副作用；而且本发明制备方法能得到更丰富且易吸收的小分子谷氨酰胺肽。
4、本发明工艺简单、设备要求低、可操作性强，有良好的应用价值。
附图说明
图1为实施例1-2、对比例1-2和对比例7-9得到的谷氨酰胺肽的蛋白回收率柱状图。
图2为实施例1-4和对比例1-6得到的谷氨酰胺肽的水解度柱状图。
图3为实施例1-4和对比例1-4得到的谷氨酰胺肽的分子量分布情况柱状图。
图4为实施例1-4、对比例1-6和对比例8得到的谷氨酰胺肽的非氮端谷氨酰胺含量柱状图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种谷氨酰胺肽的制备方法，具体包括：
(1)加热处理：将100g谷朊粉按质量比(谷朊粉:水＝1:10)加入1000g加热至90℃水中同时搅拌，搅拌保温30min。
(2)添加半胱氨酸：将步骤(1)所得料液放至室温，加入谷朊粉质量1.5％的半胱氨酸(1.5g)搅拌15min。
(3)酶解：调节步骤(2)所得料液pH到9.0，控温在60℃，加入谷朊粉质量1％的Alcalase2.4L碱性蛋白酶(1g)，酶解过程不停搅拌使谷朊粉在体系中分布均匀、与蛋白酶接触均匀，酶解4h。
(4)灭活灭酶：酶解完成得到酶解液后，升温至95℃加热10min进行灭酶处理，在4℃下，8000g离心15min除去沉淀，收集上清液。
(5)浓缩：55℃抽真空浓缩，将上清液浓缩至固形物质量百分含量为35％，浓缩结束。
(6)喷雾干燥：将固形物质量百分含量为35％的上清液进行喷雾干燥，得到谷氨酰胺肽。
实施例2
一种谷氨酰胺肽的制备方法，具体包括：
(1)加热处理：将100g谷朊粉按质量比(谷朊粉:水＝1:10)加入1000g加热至80℃的水中同时搅拌，搅拌保温60min。
(2)添加半胱氨酸：将步骤(1)所得料液放至室温，加入谷朊粉质量2.0％的半胱氨酸(2g)搅拌20min。
(3)酶解：调节步骤(2)所得料液pH到7.1，控温在50℃，加入谷朊粉质量2％的Protamex复合蛋白酶(2g)，酶解过程不停搅拌使谷朊粉在体系中分布均匀、与蛋白酶接触均匀，酶解2h。
(4)灭活灭酶：酶解完成得到酶解液后，升温至95℃加热10min进行灭酶处理，在4℃下，8000g离心15min除去沉淀，收集上清液。
(5)浓缩：55℃抽真空浓缩，将上清液浓缩至固形物质量百分含量为50％，浓缩结束。
(6)喷雾干燥：将固形物质量百分含量为50％的上清液进行喷雾干燥，得到谷氨酰胺肽。
实施例3
一种谷氨酰胺肽的制备方法，具体包括：
(1)加热处理：将100g谷朊粉按质量比(谷朊粉:水＝1:8)加入800g加热至85℃的水中同时搅拌，搅拌保温15min。
(2)添加半胱氨酸：将步骤(1)所得料液放至室温，加入谷朊粉质量0.5％的半胱氨酸(0.5g)搅拌30min。
(3)酶解：调节步骤(2)所得料液pH到7.0，控温在45℃，加入谷朊粉质量0.5％的Protamex复合蛋白酶(0.5g)，酶解过程不停搅拌使谷朊粉在体系中分布均匀、与蛋白酶接触均匀，酶解8h。
(4)灭活灭酶：酶解完成得到酶解液后，升温至95℃加热10min进行灭酶处理，在10℃下，10000g离心15min除去沉淀，收集上清液。
(5)浓缩：55℃抽真空浓缩，将上清液浓缩至固形物质量百分含量为35％，浓缩结束。
(6)喷雾干燥：将固形物质量百分含量为35％的上清液进行冷冻干燥，得到谷氨酰胺肽。
实施例4
一种谷氨酰胺肽的制备方法，具体包括：
(1)加热处理：将100g谷朊粉按质量比(谷朊粉:水＝1:10)加入1000g加热至60℃的水中同时搅拌，搅拌保温30min。
(2)添加半胱氨酸：将步骤(1)所得料液放至室温，加入谷朊粉质量2％的半胱氨酸(2g)搅拌10min。
(3)酶解：调节步骤(2)所得料液pH到7.2，控温在50℃，加入谷朊粉质量1％的中性蛋白酶(1g)，酶解过程不停搅拌使谷朊粉在体系中分布均匀、与蛋白酶接触均匀，酶解4h。
(4)灭活灭酶：酶解完成得到酶解液后，升温至95℃加热10min进行灭酶处理，在4℃下，8000g离心15min除去沉淀，收集上清液。
(5)浓缩：55℃抽真空浓缩，将上清液浓缩至固形物质量百分含量为30％，浓缩结束。
(6)喷雾干燥：将固形物质量百分含量为30％的上清液进行喷雾干燥，进风温度160～210℃，出风温度70～120℃，得到谷氨酰胺肽。
对比例1
一种谷氨酰胺肽的制备方法，具体包括：
(1)酶解：将100g谷朊粉按质量比(谷朊粉:水＝1:10)加入1000g常温的水中同时搅拌30min，调节体系pH到9.0，控温在60℃，加入谷朊粉质量1％的Alcalase 2.4L碱性蛋白酶(1g)，酶解过程不停搅拌使谷朊粉在体系中分布均匀、与蛋白酶接触均匀，酶解4h。
(2)灭活灭酶：酶解完成得到酶解液后，升温至95℃加热10min进行灭酶处理，在4℃下，8000g离心15min除去沉淀，收集上清液。
(3)浓缩：55℃抽真空浓缩，将上清液浓缩至固形物质量百分含量为35％，浓缩结束。
(4)喷雾干燥：将固形物质量百分含量为35％的上清液进行喷雾干燥，得到谷氨酰胺肽。
对比例2
一种谷氨酰胺肽的制备方法，具体包括：
(1)酶解：将100g谷朊粉按质量比(谷朊粉:水＝1:10)加入1000g常温的水中同时搅拌60min，调节体系pH到7.1，控温在50℃，加入谷朊粉质量2％的Protamex复合蛋白酶(2g)，酶解过程不停搅拌使谷朊粉在体系中分布均匀、与蛋白酶接触均匀，酶解2h。
(2)灭活灭酶：酶解完成得到酶解液后，升温至95℃加热10min进行灭酶处理，在4℃下，8000g离心15min除去沉淀，收集上清液。
(3)浓缩：55℃抽真空浓缩，将上清液浓缩至固形物质量百分含量为50％，浓缩结束。
(4)喷雾干燥：将固形物质量百分含量为50％的上清液进行喷雾干燥，得到谷氨酰胺肽。
对比例3
一种谷氨酰胺肽的制备方法，具体包括：
(1)酶解：将100g谷朊粉按质量比(谷朊粉:水＝1:8)加入800g常温的水中同时搅拌30min，调节体系pH到7.0，控温在45℃，加入谷朊粉质量0.5％的Protamex复合蛋白酶(0.5g)，酶解过程不停搅拌使谷朊粉在体系中分布均匀、与蛋白酶接触均匀，酶解8h。
(2)灭活灭酶：酶解完成得到酶解液后，升温至95℃加热10min进行灭酶处理，在10℃下，10000g离心15min除去沉淀，收集上清液。
(3)浓缩：55℃抽真空浓缩，将上清液浓缩至固形物质量百分含量为35％，浓缩结束。
(4)喷雾干燥：将固形物质量百分含量为35％的上清液进行冷冻干燥，得到谷氨酰胺肽。
对比例4
一种谷氨酰胺肽的制备方法，具体包括：
(1)酶解：将100g谷朊粉按质量比(谷朊粉:水＝1:10)加入1000g常温的水中同时搅拌30min，调节体系pH到7.2，控温在50℃，加入谷朊粉质量1％的中性蛋白酶(1g)，酶解过程不停搅拌使谷朊粉在体系中分布均匀、与蛋白酶接触均匀，酶解4h。
(2)灭活灭酶：酶解完成得到酶解液后，升温至95℃加热10min进行灭酶处理，在4℃下，8000g离心15min除去沉淀，收集上清液。
(3)浓缩：55℃抽真空浓缩，将上清液浓缩至固形物质量百分含量为30％，浓缩结束。
(4)喷雾干燥：将固形物质量百分含量为30％的上清液进行喷雾干燥，得到谷氨酰胺肽。
对比例5
一种谷氨酰胺肽的制备方法，具体包括：
(1)酶解：将100g谷朊粉按质量比(谷朊粉:水＝1:10)加入1000g常温的水中同时搅拌，调节体系pH到9.0，控温在55℃，加入谷朊粉质量1.5％的Alcalase 2.4L碱性蛋白酶(1.5g)，酶解过程不停搅拌使谷朊粉在体系中分布均匀、与蛋白酶接触均匀，酶解4h。
(2)灭活灭酶：酶解完成得到酶解液后，升温至95℃加热10min进行灭酶处理，在4℃下，8000g离心15min除去沉淀，收集上清液。
(3)浓缩：55℃抽真空浓缩，将上清液浓缩至固形物质量百分含量为35％，浓缩结束。
(4)喷雾干燥：将固形物质量百分含量为35％的上清液进行喷雾干燥，得到谷氨酰胺肽。
对比例6
一种谷氨酰胺肽的制备方法，具体包括：
(1)酶解：将100g谷朊粉按质量比(谷朊粉:水＝1:10)加入1000g常温的水中同时搅拌，调节体系pH到9.0，控温在55℃，加入谷朊粉质量1％的Alcalase 2.4L碱性蛋白酶(1g)，酶解过程不停搅拌使谷朊粉在体系中分布均匀、与蛋白酶接触均匀，酶解8h。
(2)灭活灭酶：酶解完成得到酶解液后，升温至95℃加热10min进行灭酶处理，在4℃下，8000g离心15min除去沉淀，收集上清液。
(3)浓缩：55℃抽真空浓缩，将上清液浓缩至固形物质量百分含量为35％，浓缩结束。
(4)喷雾干燥：将固形物质量百分含量为35％的上清液进行喷雾干燥，得到谷氨酰胺肽。
对比例7
一种谷氨酰胺肽的制备方法，具体包括：
(1)加热处理：将100g谷朊粉按质量比(谷朊粉:水＝1:10)加入1000g加热至90℃的水中同时搅拌，搅拌保温30min。
(2)酶解：调节步骤(1)所得料液pH到9.0，控温在60℃，加入谷朊粉质量1.0％的Alcalase 2.4L碱性蛋白酶(1g)，酶解过程不停搅拌使谷朊粉在体系中分布均匀、与蛋白酶接触均匀，酶解4h。
(3)灭活灭酶：酶解完成得到酶解液后，升温至95℃加热10min进行灭酶处理，在4℃下，8000g离心15min除去沉淀，收集上清液。
(4)浓缩：55℃抽真空浓缩，将上清液浓缩至固形物质量百分含量为35％，浓缩结束。
(5)喷雾干燥：将固形物质量百分含量为35％的上清液进行喷雾干燥，得到谷氨酰胺肽。
对比例8
一种谷氨酰胺肽的制备方法，具体包括：
(1)添加半胱氨酸：将100g谷朊粉按质量比(谷朊粉:水＝1:10)加入1000g常温的水中搅拌，加入谷朊粉质量1.5％的半胱氨酸(1.5g)搅拌15min。
(2)酶解：调节步骤(1)所得料液pH到9.0，控温在60℃，加入谷朊粉质量1％的Alcalase2.4L碱性蛋白酶(1g)，酶解过程不停搅拌使谷朊粉在体系中分布均匀、与蛋白酶接触均匀，酶解4h。
(3)灭活灭酶：酶解完成得到酶解液后，升温至95℃加热10min进行灭酶处理，在4℃下，8000g离心15min除去沉淀，收集上清液。
(4)浓缩：55℃抽真空浓缩，将上清液浓缩至固形物质量百分含量为35％，浓缩结束。
(5)喷雾干燥：将固形物质量百分含量为35％的上清液进行喷雾干燥，得到谷氨酰胺肽。
对比例9
一种谷氨酰胺肽的制备方法，具体包括：
(1)添加半胱氨酸：将100g谷朊粉按质量比(谷朊粉:水＝1:10)加入1000g常温的水中同时搅拌，加入谷朊粉质量1.5％的半胱氨酸(1.5g)搅拌15min。
(2)加热处理：将步骤(1)所得料液加热至90℃，搅拌保温30min。
(3)酶解：调节步骤(2)所得料液pH到9.0，控温在60℃，加入谷朊粉质量1％的Alcalase2.4L碱性蛋白酶(1g)，酶解过程不停搅拌使谷朊粉在体系中分布均匀、与蛋白酶接触均匀，酶解4h。
(4)灭活灭酶：酶解完成得到酶解液后，升温至95℃加热10min进行灭酶处理，在4℃下，8000g离心15min除去沉淀，收集上清液。
(5)浓缩：55℃抽真空浓缩，将上清液浓缩至固形物质量百分含量为35％，浓缩结束。
(6)喷雾干燥：将固形物质量百分含量为35％的上清液进行喷雾干燥，得到谷氨酰胺肽。
效果验证例1
小麦面筋蛋白酶解物的蛋白回收率
蛋白回收率测定方法如下：采用凯氏定氮法测定原料蛋白和酶解液上清中的蛋白含量，按公式计算蛋白回收率。
Figure BDA0003915765040000091
实验结果如图1：与对比例相比，实施例中酶解物蛋白含量均略有增加。其中，其中对比例8是仅添加半胱氨酸后酶解，其相比对比例1并无升高，对比例7是仅进行加热处理后酶解，对比例7相比对比例1有明显的下降，这说明仅通过添加半胱氨酸或加热处理对小麦面筋蛋白酶解前处理，并不能提高其蛋白回收率，反而会使蛋白回收率下降；同时对比例9是添加半胱氨酸后进行加热处理，对比例9相比对比例1也有明显下降，这说明先添加半胱氨酸后加热也不能提高其蛋白回收率。
效果验证例2
谷氨酰胺肽的水解度
水解度测定方法为OPA法测水解度，具体操作如下：称取谷氨酰胺肽配制成0.5mg/mL的样品溶液(溶剂为去离子水)，以0.9516mM丝氨酸标准溶液(溶剂为去离子水)作为标准品溶液，去离子水为空白。分别将24μL的去离子水、24μL标准品溶液和24μL样品溶液加入到96孔板中，然后加入180μL的OPA反应液(38.1mg/mL四硼酸钠；1mg/mL SDS(十二烷基磺酸钠)；0.8mg/mL OPA(邻苯二甲醛)；0.88mg/mLDTT(二硫苏糖醇))，反应两分钟后于340nm波长处测定吸光值。按公式计算样品中的水解度。
Figure BDA0003915765040000092
Figure BDA0003915765040000093
其中，样品的浓度单位是mg/mL，0.9516是丝氨酸标准溶液的浓度，单位是mM；小麦面筋蛋白的α、β和总肽键数值分别为1.00、0.40和8.3。
实验结果如图2：与相应的对比例相比，实施例中水解度有明显提高，实施例1相比对比例1水解度提高2％，实施例2相比对比例2水解度提高3％、实施例3、实施例4也分别较对比例3、对比例4水解度提高2％，同时可以看到实施例1的水解度还略高于对比例5、对比例6，这说明加热处理后添加半胱氨酸，可以改变实施例中谷朊粉的结构、使其在水中更加分散，加快了谷朊粉的酶解进程，提高的谷朊粉的水解度。
效果验证例3
谷氨酰胺肽的分子量分布
分子量测定方法如下：采用凝胶色谱法测定样品的分子量分布；标准肽样品为：三肽GGG(相对分子质量189Da)、四肽GGYR(相对分子质量451Da)、杆菌酶(MW1422.69)、抑肽酶(相对分子质量6512Da)、细胞色素C(相对分子质量12384Da)，以各标准品的分子量与高效液相色谱法检测的各标准品的保留时间拟合直线方程为：y＝-2.047x+14.342(R2＝0.993)，其中y为标准品的分子量对数，x为保留时间。通过比较样品的保留时间计算样品的分子量分布。高效液相色谱条件：色谱柱TSK-GEL G2000 SWXl 7.8mm×300mm，检测波长220nm，流速1mL/min，流动相为20％(体积分数)乙腈，79.92％(体积分数)超纯水和0.08％(体积分数)三氟乙酸。
实验结果如图3：与对比例相比，实施例中小于500Da的多肽占比明显高于对比例，实施例1、实施例2、实施例3、实施例4中小于500Da的多肽占比分别为68.56％、61.94％、60.24％、58.24％，另外实施例中的小于1000Da的组分占比都在78.88％以上；由于对比例没有进行酶解前加热后添加半胱氨酸处理，小分子组分明显低于其他组，大分子组分比例高，这说明酶解前进行加热后添加半胱氨酸处理，可以提高酶解过程中小分子肽的释放能力。
效果验证例4
谷氨酰胺肽的非氮端谷氨酰胺含量
非氮端谷氨酰胺含量的测定采用BTI保护法，具体方法如下：
谷氨酰胺的BTI保护反应：在安瓿瓶中加入250μL 10mg/mL谷氨酰胺溶液(溶剂为超纯水)，再加入1mL浓度为10mg/mL的BTI乙睛水溶液(乙腈和水的体积比为3:2)，同时加入62.5μL浓度为50mM毗咤水溶液，用酒精喷灯熔封瓶口，混合均匀，50℃反应4h，反应后打开安瓿瓶取450mL加入到新的安瓿瓶中氮吹吹干。
酸水解：BTI([二(三氟乙酰氧基)碘]苯)制备样中加入1mL浓度为6M盐酸，另取200μL浓度为10mg/mL谷氨酰胺水溶液(未经BTI保护)加入新的安瓿瓶中，再加入1mL浓度为6M盐酸，用酒精喷灯熔封瓶口，置于110℃烘箱中水解24h。取出打开安瓿瓶，转移至10mL容量瓶并用水定容至10mL，取2mL于干净玻璃皿中放入60℃烘箱烘干，加0.5mL样品稀释液(钠盐稀释液：27mg/mL三水合乙酸钠；0.07ml/mL乙醇；0.005mL/mL甲酸；0.01mL/mL乙酸；0.01474mL/mL三氟乙酸；溶剂为超纯水)，过0.22μm膜于进样瓶中，用A300全自动氨基酸分析仪测定谷氨酸的含量，未经BTI保护谷氨酰胺样品的谷氨酸含量减去BTI制备样中谷氨酸含量即为谷氨酰胺肽中非氮端谷氨酰胺含量。
实验结果如图4：实施例1、实施例2、实施例3、实施例4中谷氨酰胺肽的非氮端谷氨酰胺含量分别为30.83％、29.03％、29.98％、29.65％，均高于以往报道的谷氨酰胺肽的非氮端谷氨酰胺含量，同时均高于对比例，这说明在酶解前进行加热后添加半胱氨酸的处理可以在酶解过程中释放更多的非氮端谷氨酰胺，另外，对比例8的非氮端谷氨酰胺含量相较对比例1没有提升，这说明仅通过添加半胱氨酸对小麦面筋蛋白酶解前处理并不能提高其非氮端谷氨酰胺含量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种谷氨酰胺肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将水加热至60℃～90℃保温，将谷朊粉加入水中同时搅拌，搅拌保温15～60min；
(2)将步骤(1)所得料液冷却，加入谷朊粉质量0.5％～2％的半胱氨酸搅拌10～30min；
(3)调节步骤(2)所得料液pH值到7～9，控温45℃～60℃，加入谷朊粉质量0.5％～2％的蛋白酶，酶解2～8h；
(4)酶解结束后将反应体系灭酶，离心收集上清液，浓缩后干燥，得到谷氨酰胺肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述谷朊粉和水的质量比为(1:8)～(1:12)。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶或Protamex复合蛋白酶中的一种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述热处理是于85～95℃保温10～15min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述离心是于4～10℃下，8000～10000g离心10～20min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述浓缩为浓缩至固形物质量百分含量为30％～50％。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述干燥为喷雾干燥或冷冻干燥；其中喷雾干燥的条件为：进风温度160～210℃，出风温度70～120℃；冷冻干燥的温度为-50～-40℃。
8.权利要求1-7任一项所述制备方法制备得到的一种谷氨酰胺肽。
9.根据权利要求8所述的谷氨酰胺肽，其特征在于，所述谷氨酰胺肽中，分子量小于500Da的组分占比58.24％-68.56％，分子量小于1000Da的组分占78.88％以上，非氮端谷氨酰胺含量在29％-31％之间。
10.权利要求8所述谷氨酰胺肽在制备保健性功能食品或药品中的应用。
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