CN105131096A - 香椿子蛋白质提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明适用于有机物提取工艺技术领域，提供了一种香椿子蛋白质提取方法，包括以下步骤：A：将香椿子脱脂处理，除去脂溶性成分；B：将脱脂后的香椿子加水回流提取，并进行抽滤减压处理获得滤渣；C：将经抽滤处理的滤渣加蒸馏水混匀，在30℃～50℃下，调节PH至碱性，保持35min～55min，离心分离处理获得上清液；D：向所述上清液中加酸，离心分离去掉上清液，得到沉积物，用蒸馏水调至中性并洗净；E：将所述沉积物进行冻干处理，即得香椿子粗蛋白质。本发明可以高效的提取香椿子中的蛋白质，工艺简单，成本低廉，易于实现工业大规模生产，提高香椿子的附加值，其经济效益和社会效益显著，市场前景广阔。

Description

香椿子蛋白质提取方法

技术领域

本发明涉及有机物提取工艺技术领域，尤其涉及一种香椿子蛋白质的提取方法。

背景技术

香椿子为楝科植物香椿的果实。香椿收载于《唐本草》^[1]，在我国广泛分布，是著名药食同源植物，香椿根皮、树皮、芽、叶、果实均可作为药用。香椿子是我国传统中药材，具有祛风、散寒、止痛之功效，主治风寒外感、心胃气痛、风湿性关节疼痛、病气、胸痛、痔漏、慢性胃炎、治疗头痛、偏头痛等症^[1-2]。

香椿子中含有酚类、鞣质、生物碱、皂苷、甾体、萜类、挥发油等活性成分^[3-6]。植物源蛋白质具有独特生理功能，逐步引起营养学界关注。植物蛋白质具有降低胆固醇^[7-8]、减少癌症发生^[9]、改善心血管疾病和肾脏病^[10-11]、对肝硬化患者的营养支持作用等生理功能^[12]。

目前对于香椿子蛋白质研究尚少，对其提取纯化及在保健品、食品、医药等领域应用处于探索阶段。本研究初步探讨香椿子蛋白质提取工艺，对所得蛋白质进行理化性质表征，为了综合开发香椿子资源，挖掘植物蛋白质营养与功能特性，具有重要现实意义和广阔市场前景。

综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。

发明内容

针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种香椿子蛋白质提取方法，本发明可以高效的提取香椿子中的蛋白质，工艺简单，成本低廉，易于实现工业大规模生产，提高香椿子的附加值，其经济效益和社会效益显著，市场前景广阔。

为了实现上述目的，本发明提供了一种香椿子蛋白质提取方法。

本发明提供了一种香椿子蛋白质提取方法，包括以下步骤：步骤A：将香椿子脱脂处理，除去脂溶性成分；步骤B：将脱脂后的香椿子加水回流提取，并进行抽滤减压处理获得滤渣；步骤C：将经抽滤处理的所述滤渣加蒸馏水混匀，在温度30℃～50℃下，调节PH至碱性，保持35min～55min，离心分离处理获得上清液；步骤D：向所述上清液中加酸，离心分离处理去掉上清液，得到沉积物，用蒸馏水将所述沉积物调至中性并冲洗干净；步骤E：将所述沉积物进行冻干处理，即得香椿子粗蛋白质。

根据本发明的香椿子蛋白质提取方法，所述步骤A之前还包括：将所述香椿子粉碎处理。

根据本发明的香椿子蛋白质提取方法，所述步骤A中，所述香椿子通过95％乙醇脱脂处理。

根据本发明的香椿子蛋白质提取方法，所述步骤B中，加水回流提取的料液比为25:1g/mL。

根据本发明的香椿子蛋白质提取方法，所述步骤B中，加水回流提取的提取次数为3次。

根据本发明的香椿子蛋白质提取方法，所述步骤C中，所述温度为40℃。

根据本发明的香椿子蛋白质提取方法，所述步骤C中，所述时间为40min。

根据本发明的香椿子蛋白质提取方法，所述步骤C中，调节PH至碱性，具体的PH值为8.5～10.5。

本发明提供的一种香椿子蛋白质提取方法，包括以下步骤：步骤A：将香椿子脱脂处理，以除去脂溶性成分；步骤B：将脱脂后的香椿子加水回流提取，并进行抽滤减压处理获得滤渣；步骤C：将经抽滤处理的所述滤渣加蒸馏水混匀，在30℃～50℃下，调节PH至碱性，保持35min～55min，离心分离处理获得上清液；步骤D：向所述上清液中加酸，离心分离处理去掉上清液，得到沉积物，用蒸馏水将所述沉积物调节至中性并冲洗干净；步骤E：将所述沉积物进行冻干处理，即得香椿子粗蛋白质。本发明可以高效地提取香椿子中的蛋白质，其工艺简单，成本低廉，易于实现工业大规模生产，提高香椿子的附加值，其经济效益和社会效益显著，市场前景广阔。

附图说明

图1为蛋白质含量测定标准曲线图；

图2为香椿子蛋白质水解氨基酸色谱图；

图3为香椿子蛋白质等电点测定图；

图4为香椿子蛋白质红外色谱图；

图5为香椿子蛋白质SDS-PAGE电泳图；

图6为提取时间对香椿子蛋白质提取量的影响图；

图7为PH值对香椿子蛋白质提取量的影响图；

图8为提取温度对香椿子蛋白质提取量的影响图；

图9为料液比对香椿子蛋白质提取量的影响图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

蛋白质含测方法^[13]部分

1试液配制

(1)牛血清蛋白质标准溶液制备

精密称取10.0mg牛血清蛋白质，加水定容至100mL，摇匀，即得。

(2)考马斯亮蓝G250溶液制备

精密称取10mg考马斯亮蓝G250，先加90％乙醇5.0mL溶解，再加85％(W/V)磷酸10.0mL，最后定容至100mL棕色瓶，备用；

2标准曲线建立

分别精密移取牛血清蛋白质标准液0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL于试管中，加蒸馏水至1.0mL，混匀后加5.0mL考马斯亮蓝G250溶液，振摇后静置5min，于595nm处测定吸光度。以蛋白质标准溶液浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，见图1。

由图1可知：在0～0.09mg/mL浓度范围，吸光度随牛血清蛋白质标准液浓度增加而增加，呈显线性关系，所得方程为y＝7.7931x+0.0152，r＝0.9994。

3蛋白质含量测定

精密称取香椿子粗蛋白质适量，按照建立方法测定样品吸光度，计算香椿子蛋白质含量。

正交实验设计及结果部分

1正交试验设计

根据单因素实验结果，选择提取时间、pH值、提取温度、液料比为考察因素，运用L₉(3⁴)正交表安排试验，确定香椿子蛋白质提取工艺，见表1、2、3。

2正交试验结果

表1香椿子蛋白质提取工艺因素水平表

表2L₉(3⁴)正交实验结果

表3方差分析

注：F_0.05(1,2)＝19

由表2可知：以香椿子蛋白质含量为指标，在四个提取因素中，液料比影响为大，其次分别为提取时间、提取温度、pH值，即C>B>D>A。香椿子蛋白质提取优化方案为A₃B₁C₂D₂，即pH值为10.5，提取40min，液料比25:1，提取温度40℃。

香椿子蛋白质理化性质表征

1香椿子蛋白质总氮含量测定

精密称取3份香椿子蛋白质，每份28mg，按照《中国药典》(2010年版附录IXL)，运用全自动凯氏定氮仪，测得香椿子蛋白质总氮含量为13.8g/100g、13.9g/100g、13.7g/100g，均值为13.8g/100g。

2香椿子蛋白质中氨基酸组成分析

(1)蛋白质前处理

取样品0.02816g于20mL水解管中，加入6NHCL15mL真空脱气30min，充氮，封管，110℃烘箱中水解22h；冷却后开管，转移到50mL容量瓶中，超纯水定容并混匀；准确取1mL水解液于5mL小瓶中，50℃真空干燥箱中脱酸干燥，抽干后加1mL超纯水再抽干。准确加0.02N盐酸1mL复溶，0.22μm水膜过滤备用。

(2)色谱分析条件

2622#PH离子交换色谱柱，规格4.5*60mm；进样量为20μl；除脯氨酸为440nm外，其他氨基酸检测波长为570nm；茚三酮、缓冲液流速为0.35mL/min，流速为0.4mL/min；衍生反应器温度为57℃；本实验为单点校正，各标准氨基酸的浓度均为2nmol/20μl，结果见表4与图2。

表4香椿子蛋白质水解氨基酸含量结果

按照GB/T18246-2000进行水解法氨基酸分析，由表4与图2可知：香椿子蛋白质样品中含有17种氨基酸，其中谷氨酸含量最高，占总量的35.37％；其次为精氨酸，占总量的15.31％；蛋氨酸含量最小，占总量的1.02％。

3香椿子蛋白质等电点测定^[14]

取相同体积香椿子蛋白质提取液，用0.2mol/LNaOH和0.2mol/LHCl分别调节提取液pH值，在pH1.5～11.5内设置12个点，考察最小吸光度时pH值。

由图3可知：考马斯亮蓝法测定同一批香椿子上清液蛋白质含量，在pH1.5～11.5范围内出现两个明显波峰，说明存在两种不同等电点蛋白质，pH值大约在6.0和10.0，上清液吸光度较低，此pH下香椿子蛋白质沉淀量较大。

4香椿子蛋白质红外光谱分析

取冷冻干燥多糖样品适量，与干燥KBr粉末充分研磨后压片，于4000cm^-1～400cm^-1波段扫描。

由图3可知：3395.79cm^-1强而宽的吸收峰为N-H键伸缩振动；2933.19cm^-1处吸收峰为费米共振；1655.68cm^-1处强吸收峰为C＝O键的伸缩振动；1536.10cm^-1处为N-H弯曲振动与C-N伸缩振动吸收峰；1322.25cm^-1、1281.50cm^-1和1238.61cm^-1处为C-N和N-H弯曲振动吸收峰；594.82cm^-1处吸收峰为C＝O面外弯曲振动吸收峰。

5香椿子蛋白质分子量测定

测定蛋白质相对分子量常用技术之一为SDS-PAG电泳。按照LaemmLi法^[15]凝胶电泳法，电泳条件为：5％浓缩胶，12％分离胶，采用200mA电流，进行2.5h，确定香椿子蛋白质相对分子量。

由图5可知：香椿子蛋白质分子量主要集中在66.2kDa～18.4kDa范围，主要有66.2kDa～45.0kDa和25.0kDa～18.4kDa三条带组成，香椿子蛋白质分子量约为55kDa、51kDa和22kDa。

具体实施例部分

香椿子蛋白质提取方法之提取时间对香椿子蛋白质提取量影响的实施例(实施例1～实施例6)：

本发明提供一种香椿子蛋白质提取方法，将所述香椿子粉碎处理，包括以下步骤：步骤A：将香椿子脱脂处理，除去脂溶性成分；步骤B：将脱脂后的香椿子加水回流提取，并进行抽滤减压处理获得滤渣；步骤C：将经抽滤处理的所述滤渣加蒸馏水混匀，在温度30℃～50℃下，调节PH至碱性，保持35min～55min，离心分离处理获得上清液；步骤D：向所述上清液中加酸，离心分离处理去掉上清液，得到沉积物，用蒸馏水将所述沉积物调至中性并冲洗干净；步骤E：将所述沉积物进行冻干处理，即得香椿子粗蛋白质。

具体的，精密称取脱脂香椿子滤渣5g，固定液料比25:1，pH为10.0，温度为40℃。采用不同提取时间，实施例1～实施例6的提取时间分别为35min、40min、45min、50min、55min，按照上述香椿子蛋白质提取方法，测定提取液蛋白质含量，见图6。

由图6可知：当提取时间小于45min时，香椿子蛋白质含量随提取时间增加而增加；当提取时间超过45min，蛋白质含量基本趋于不变，基于此，香椿子蛋白质提取时间暂定为45min。

香椿子蛋白质提取方法之PH值对香椿子蛋白质提取量影响的实施例(实施例6～实施例10)：

精密称取脱脂香椿子滤渣5g，固定提取时间45min，液料比为25:1，温度为40℃。选取不同pH值，实施例6～实施例10的PH值分别取8.5、9.0、9.5、10.0、10.5，按照上述香椿子蛋白质提取方法，测定提取液蛋白质含量，见图7。

由图7可知：在pH值8.5～9.5范围内，香椿子蛋白质含量随pH增大而增大；当pH超过9.5，蛋白质含量逐步下降，初步判定碱性溶液中，蛋白质所带负电荷增加，影响蛋白质与溶剂之间或者蛋白质分子之间相互作用，从而影响香椿子蛋白质溶解性。

香椿子蛋白质提取方法之提取温度对香椿子蛋白质提取量影响的实施例(实施例11～实施例15)：

精密称取脱脂香椿子滤渣5g，固定提取时间45min，pH值9.5.，液料比为25:1，采用不同提取温度，实施例11～实施例15采用的提取温度分别为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，按照上述香椿子蛋白质提取方法，测定提取液蛋白质含量，见图8。

由图8可知：在不超过40℃范围内，香椿子蛋白质含量随温度增加而变大；当温度超过40℃，蛋白质含量随之降低，基于此，香椿子蛋白质提取温度暂定为40℃。

香椿子蛋白质提取方法之料液比对香椿子蛋白质提取量影响的实施例(实施例16～实施例22)：

精密称取脱脂香椿子滤渣5g，固定提取时间45min、pH值9.5、提取温度40℃，采用不同液料比，实施例16～实施例22采用的料液比分别为10:1g/mL、15:1g/mL、20:1g/mL、25:1g/mL、30:1g/mL、35:1g/mL、40:1g/mL，按照上述香椿子蛋白质提取方法，测定提取液蛋白质含量，见图9。

由图9可知：香椿子蛋白质含量随液料比增加而增加，当液料比为25:1g/mL时，香椿子蛋白质含量趋于最大值，综合提取量与成本，香椿子蛋白质料液比暂定为25:1g/mL。

综上所述，本发明提供的一种香椿子蛋白质提取方法，包括以下步骤：步骤A：将香椿子脱脂处理，除去脂溶性成分；步骤B：将脱脂后的香椿子加水回流提取，并进行抽滤减压处理获得滤渣；步骤C：将经抽滤处理的所述滤渣加蒸馏水混匀，在30℃～50℃下，调节PH至碱性，保持35min～55min，离心分离处理获得上清液；步骤D：向所述上清液中加酸，离心分离处理去掉上清液，得到沉积物，用蒸馏水将所述沉积物调节至中性并冲洗干净；步骤E：将所述沉积物进行冻干处理，即得香椿子粗蛋白质。本发明可以高效提取香椿子中蛋白质，其工艺简单，成本低廉，易于实现工业大规模生产，提高香椿子的附加值，其经济效益和社会效益显著，市场前景广阔。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

参考文献

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Claims (8)

1.一种香椿子蛋白质提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤A：将香椿子脱脂处理，除去脂溶性成分；

步骤B：将脱脂后的香椿子加水回流提取，并进行抽滤减压处理获得滤渣；

步骤C：将经抽滤处理的所述滤渣加蒸馏水混匀，在温度30℃～50℃下，调节PH至碱性，保持35min～55min，离心分离处理获得上清液；

步骤D：向所述上清液中加酸，离心分离处理去掉上清液，得到沉积物，用蒸馏水将所述沉积物调节至中性并冲洗干净；

步骤E：将所述沉积物进行冻干处理，即得香椿子粗蛋白质。

2.根据权利要求1所述的香椿子蛋白质提取方法，其特征在于，所述步骤A之前还包括：

将所述香椿子粉碎处理。

3.根据权利要求1所述的香椿子蛋白质提取方法，其特征在于，所述步骤A中，所述香椿子通过95％乙醇脱脂处理。

4.根据权利要求1所述的香椿子蛋白质提取方法，其特征在于，所述步骤B中，加水回流提取的料液比为25:1g/mL。

5.根据权利要求4所述的香椿子蛋白质提取方法，其特征在于，所述步骤B中，加水回流提取的提取次数为3次。

6.根据权利要求1所述的香椿子蛋白质提取方法，其特征在于，所述步骤C中，所述温度为40℃。

7.根据权利要求1所述的香椿子蛋白质提取方法，其特征在于，所述步骤C中，所述时间为40min。

8.根据权利要求1所述的香椿子蛋白质提取方法，其特征在于，所述步骤C中，调节PH至碱性，具体的PH值为8.5～10.5。