CN105112444A - 一种基于双菌株/双质粒遗传转化柑桔的共转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于双菌株/双质粒遗传转化柑桔的共转化方法，包括外植体预培养，农杆菌浸染步骤，其特征在于：预培养基础培养基为MS培养基，添加4mg/L？6-苄氨基腺嘌呤（6-？BA）、1mg/L吲哚乙酸(IAA)、100μM乙酰丁香酮（AS）。本发明填补了国内外柑桔多基因共转化的空白，解决了如何实现双菌株/？双质粒共转化柑桔的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种柑桔转基因研究的共转化方法，主要适用于农杆菌介导的双菌株/双质粒柑桔共转化。
背景技术
目前，大多数转基因技术是将单个目的基因构建在一个载体上遗传转化受体材料，利用这种策略已经培养出了许多具有新性状的转基因植株。然而生物体内许多的性状是由多基因协调完成的，单个基因的遗传转化已经满足不了作物品种改良的需要。为了获得具有优良性状的转基因作物，将多种功能的基因利用多基因共转化技术导入植株中进行植物品种改良将成为一种新的发展趋势。
农杆菌介导的多基因共转化法包含混合菌株法和单菌株法。混合菌株法所获得的共转化率比单菌株法要低，然而由于单菌株法构建载体的难度大，因而目前所进行的植物共转化研究中，以混合菌株法居多。混合菌株法是将2个或多个T-DNA(每个T-DNA区含有1个或多个外源基因)构建到不同的载体中，将这些载体分别导入到农杆菌的不同细胞，然后以含不同载体的农杆菌菌液的混合物进行转化。其中双菌株/双质粒法是混合菌株法中的一种，其体系是将2个T-DNA分别构建在2个不同的载体中。拟南芥、烟草、水稻等作物利用混合菌株法共转化都获得了较高的共转化率。
柑桔是一种木本植物，其转基因技术虽说比较成熟，然而相对于草本植物而言，其遗传转化率仍然较低。由于2个或多个菌株导入同一受体细胞的机会比1个菌株单独侵染受体细胞的机会要小得多，以及单菌株法载体构建难度大，至今未在柑桔中进行多基因共转化的报道。
发明内容
本发明填补了国内外柑桔多基因共转化的空白，解决了如何实现双菌株/双质粒共转化柑桔的问题。
本发明的目的是通过以下措施实现的：
一种基于双菌株/双质粒遗传转化柑桔的共转化方法，包括外植体预培养，农杆菌浸染步骤，其特征在于：预培养基础培养基为MS培养基，添加4mg/L6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、1mg/L吲哚乙酸(IAA)、100μM乙酰丁香酮(AS)。所述培养基不仅能有效地促使外植体伤口上的细胞进行分裂，在随后的转化中这种进行分裂的细胞易于接收外来信息。而且可使酚类化合物富集于外植体伤口的细胞上，从而在外植体伤口细胞与农杆菌进行共培养时有利于农杆菌内Ti质粒上Vir区基因的活化和高效表达，从而有利于共转化的成功。
上述农杆菌为双菌株，两种农杆菌菌液的比例为1∶1。这对于共转化效率有着重要的影响。本发明使两种菌系的细胞附着在同一个受体细胞上的机率相等，从而有利于共转化的成功。
上述农杆菌浸染外植体的时间为20分钟。有利于外植体受体细胞的表面附着充足而恰当的农杆菌，从而有助于共转化的成功。
上述农杆菌浸染后，对浸染后外植体进行筛选，筛选培养基为MS固体培养基附加2mg/L玉米素(ZEA)、60mg/L卡那霉素(Km)和300mg/L万古霉素(Van)。可有效的促进转化细胞的分裂，抑制非转化细胞和残存农杆菌的生长。
一种基于双菌株/双质粒遗传转化柑桔的共转化方法，包括以下步骤：
(1)外植体的准备
取出柑桔种子，清水洗净，用酒精表面消毒后，再用0.1％的升汞消毒10分钟，无菌水冲洗4次；剥去种皮，接种在已消毒的MS固体培养基中；28℃暗培养2周，然后转入16小时的光周期下光照培养1周，获得柑桔实生苗；将实生苗在无菌的条件下横切成1cm左右的茎段；
(2)外植体预培养
将步骤(1)所得茎段放入预培养基中，预培养基为MS液体培养基添加4mg/L6-BA、1mg/LIAA、100μMAS；在28℃、100r/min下振荡培养4小时；
(3)双菌株/双质粒混合菌液的制备
将质粒pLGNL和pLGFP分别转染两株农杆菌菌株EHA105中，pLGNL中含有选择标记基因NPTII和报告基因GUS，pLGFP中含有目的基因GFP；挑选转染成功的单菌落，分别接种于LB液体培养基中，28℃黑暗下220r/min振荡培养至OD600为0.8-1.0；将培养后的菌液用LB液体培养基稀释成OD600为0.1，相同培养条件下进行二次活化，继续振荡培养至OD600为0.5；
将经过二次活化的分别含有质粒pLGNL和pLGFP的菌液按体积比1∶1比例混合，在28℃、5000r/min的条件下离心10分钟；去除上清液，用MS液体培养基重新悬浮菌株；
(4)外植体感染。
将预培养后外植体放入培养皿，将步骤(3)重新悬浮的农杆菌混合菌液倒入培养皿中，使所有的外植体均浸入农杆菌菌液中，浸染20分钟；然后将外植体用镊子夹入含有滤纸的培养皿中；用滤纸吸干外植体表面多余的农杆菌混合菌液；
(5)共培养
将外植体放在附加2mg/L6-BA、0.5mg/LIAA、1mg/L2，4-D和100μMAS的MS固体培养基上，在26℃、黑暗的条件下共培养3天；
(6)不定芽的诱导
将共培养后的外植体转入筛选培养基中；筛选培养基为MS固体培养基并附加2mg/LZEA、60mg/LKm、300mg/LVan；在28℃条件下暗培养15天；然后对外植体进行16小时光周期的光照培养，培养温度为28℃；
(7)不定芽的GFP荧光检测和GUS染色
运用徕卡荧光体式显微镜(滤光片为GFP2)对所有的不定芽进行GFP荧光检测，不定芽呈绿色的，确定为GFP阳性芽；GFP荧光检测后，对所有的不定芽进行GUS染色；GUS染色呈蓝色的，确定为GUS阳性芽；对既有GFP荧光，同时GUS染色又呈蓝色的，确定为共转化芽；
(8)不定芽试管内嫁接和田间二次嫁接
待共转化芽的茎长约0.5cm时，水平切下，试管微嫁接在枳橙砧木上；待嫁接口充分愈合后，从枳橙砧木的基部水平切下共转化芽，按照田间切接的方法将其嫁接在田间枳橙砧木上，用塑料袋保湿2周，待其成活后去除塑料袋；
(9)共转化植株的分子生物学鉴定
提取共转化芽的DNA，进行GFP基因和GUS基因的PCR分析，GFP基因和GUS基因可以扩增出相应的目的带的，确定为共转化柑桔；
对共转化植株中的GFP基因和GUS基因进行Southernblot分析，确定GFP和GUS基因都以单拷贝的形式共同插入到锦橙基因组中；
对共转化植株中的GFP基因和GUS基因进行表达分析，确定GFP基因和GUS基因在共转化植株中都获得了高效的表达。
有益效果
1.本发明运用双菌株/双质粒共转化法进行柑桔的转基因研究，可获得3.5％的共转化率。
2.本发明柑桔共转化方法的建立，有利于将多种抗病、抗虫、抗逆的基因导入柑桔中获得多功能的转基因柑桔，有利于多基因控制的代谢途径的柑桔遗传性状的改良。
附图说明
图1外植体的预培养；
图2双菌株/双质粒的混合菌液；
图3外植体共培养；
图4不定芽的诱导；
图5GFP荧光的转基因芽；
图6叶片GUS染色(图6的叶片来源于图5中箭头所指的具有GFP荧光的叶片)；
图7共转化植株GFP基因的PCR分析：M-DL2000Marker，1-质粒pLGFP，2-非转基因对照，3～7-含GFP基因的转基因植株；
图8共转化植株GUS基因的PCR分析：M-DL2000Marker，1-质粒pLGNL，2-非转基因对照，3～7含GUS基因的转基因植株；
图9共转化植株正常生长图；
图10共转化植株中GFP基因和GUS基因的Southernblot分析：左图为GFP基因的整合分析，右图为GUS基因的整合分析；1-共转化植株1，2-共转化植株2，C-非转基因对照；
图11共转化植株中GFP基因和GUS基因的表达分析：1-GFP，共转化植株1中的GFP基因的表达；2-GFP，共转化植株2中的GFP基因的表达；1-GUS，共转化植株1中的GUS基因的表达；2-GUS，共转化植株2中GUS基因的表达；C，非转基因对照。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1双菌株/双质粒法共转化锦橙
1、外植体的准备
从锦橙成熟的果实中取出种子。种子用自来水冲洗干净，在超净工作台上用酒精表面消毒，用0.1％的升汞消毒10分钟，无菌水冲洗4次。剥去种皮，接种在已消毒的装有MS固体培养基的试管中。在28℃下暗培养2周，然后转入16小时的光周期下光照培养1周，获得锦橙实生苗。将锦橙实生苗在无菌的条件下横切成1cm左右的茎段。
MS基本培养基配方：(1)大量元素：NH4NO31650、KNO31900、CaCl2·2H2O440、MgSO4·7H2O370、KH2PO41700；(2)微量元素：KI0.83、H3BO36.2、MnSO4·4H2O22.3、ZnSO4·7H2O8.6、Na2MnO4·2H2O0.25、CuSO4·5H2O0.025、CoCl2·6H2O0.025、FeSO4·7H2O(27.8)+Na2-EDTA·2H2O(37.3)；(3)有机成分：肌醇100、烟酸0.5、盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5、盐酸硫胺素(维生素B1)0.5、甘氨酸2；以上成分单位为mg/L。
MS固体培养基为MS基本培养基附加8g/L的琼脂，30g/L的蔗糖，PH5.8。下同。
2、外植体预培养
将步骤(1)所得茎段放入预培养基中，预培养基为MS液体培养基附加4mg/L6-BA、1mg/LIAA、100μMAS；在28℃、100r/min下振荡培养4小时(参见图1)。
MS液体培养基为MS基本培养基附加30g/L的蔗糖，PH5.8。
3、双菌株/双质粒混合菌液的制备
本实施例含有两种质粒pLGNL和pLGFP，这两种质粒分别转入农杆菌菌株EHA105中。pLGNL中含有选择标记基因NPTII和报告基因GUS，pLGFP中含有目的基因GFP。
转化前分别挑选含有上述两种质粒的农杆菌菌株的单菌落各接种于10mLLB液体培养基中，28℃黑暗下220r/min振荡培养至OD600为0.8-1.0；然后，将培养后的农杆菌菌液用相同的LB液体培养基稀释成OD600为0.1，在相同的培养条件下进行二次活化，继续振荡培养至OD600为0.5。
将经过二次活化的分别含有质粒pLGNL和pLGFP的菌液各取25mL，一同倒入50mL的离心管中(参见图2)，在28℃、5000r/min的条件下离心10分钟；将上清液倒干净，用MS液体培养基重新悬浮农杆菌。
此步骤中的MS液体培养基与步骤(2)的MS液体培养基仅PH不同，其余的成分相同；此步骤pH值为5.4。
4、外植体感染。
将预培养的外植体从三角瓶中取出，放入直径10cm的培养皿中。将上述重新悬浮的农杆菌混合菌液倒入培养皿中，用手轻轻摇动，使所有的外植体均浸入农杆菌菌液中，浸染20分钟。然后将外植体用镊子夹入含有滤纸的培养皿中；用滤纸吸干外植体表面多余的农杆菌混合菌液。
5、共培养
将外植体放在附加2mg/L6-BA、0.5mg/LIAA、1mg/L2，4-D和100μMAS的MS固体培养基上，在26℃、黑暗的条件下共培养3天(参见图3)。
6、不定芽的诱导
共培养3天后，将外植体转入筛选培养基中。筛选培养基为MS固体培养基并附加2mg/LZEA、60mg/LKm、300mg/LVan；在28℃条件下暗培养15天。
暗培养结束后，对外植体进行16小时光周期的光照培养，培养温度为28℃(参见图4)。
7、不定芽的GFP荧光检测和GUS染色
运用徕卡荧光体式显微镜(滤光片为GFP2)对所有的不定芽进行GFP荧光检测，不定芽呈绿色的，确定为GFP阳性芽。GFP荧光检测后，对所有的不定芽进行GUS染色。GUS染色呈蓝色的，确定为GUS阳性芽。对既有GFP荧光，同时GUS染色又呈蓝色的，确定为共转化芽(参见图5，图6)。
GUS染液含有如下成分：100mMNaH2PO4，100mMNa2HPO4，0.5mMK4[Fe(CN)6]，0.5mMK3[Fe(CN)6]，10mMEDTA-Na2，1mMX-Gluc，0.1％Sodiumazide，0.1％Triton-100。
8、不定芽试管内嫁接和田间二次嫁接
待共转化芽的茎长约0.5cm时，水平切下，试管微嫁接在枳橙砧木上。待嫁接口充分愈合后，从枳橙砧木的基部水平切下共转化芽，按照田间切接的方法将其嫁接在田间枳橙砧木上，用塑料袋保湿2个星期，待其成活后去除塑料袋。
9、共转化植株的分子生物学鉴定
提取共转化芽的DNA，进行GFP基因和GUS基因的PCR分析，GFP基因和GUS基因可以扩增出相应的目的带的，确定为共转化锦橙(参见图7，图8)。共转化锦橙在田间生长正常，长势良好(参见图9)。共转化率的计算方法为GFP和GUS的PCR检测结果都呈阳性的植株的总数/接种的外植体总数，实验重复3次。本试验接种的外植体总数为1542个，共获得株PCR阳性植株54个，遗传转化率＝54/1542＝3.5％。
对共转化植株中的GFP基因和GUS基因进行Southernblot分析，结果表明GFP和GUS基因都以单拷贝的形式共同插入到锦橙基因组中(参见图10)。
对共转化植株中的GFP基因和GUS基因进行表达分析，结果表明GFP基因和GUS基因在共转化植株中都获得了高效的表达(参见图11)。
Claims (5)
1.一种基于双菌株/双质粒遗传转化柑桔的共转化方法，包括外植体预培养，农杆菌浸染步骤，其特征在于：预培养基础培养基为MS培养基，添加4mg/L6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、1mg/L吲哚乙酸(IAA)、100μM乙酰丁香酮（AS）。
2.如权利要求1所述的基于双菌株/双质粒遗传转化柑桔的共转化方法，所述农杆菌为双菌株，两种农杆菌菌液的比例为1:1。
3.如权利要求1所述的基于双菌株/双质粒遗传转化柑桔的共转化方法，所述农杆菌浸染外植体的时间为20分钟。
4.如权利要求1所述的基于双菌株/双质粒遗传转化柑桔的共转化方法，所述农杆菌浸染外植体后，对浸染后外植体进行筛选，筛选培养基为MS固体培养基附加2mg/L玉米素（ZEA）、60mg/L卡那霉素（Km）和300mg/L万古霉素（Van）。
5.如权利要求1所述的基于双菌株/双质粒遗传转化柑桔的共转化方法，包括以下步骤：
（1）外植体的准备
取出柑桔种子，清水洗净，用酒精表面消毒后，再用0.1%的升汞消毒10分钟，无菌水冲洗4次；剥去种皮，接种在已消毒的MS固体培养基中；28℃暗培养2周，然后转入16小时的光周期下光照培养1周，获得柑桔实生苗；将实生苗在无菌的条件下横切成1cm左右的茎段；
（2）外植体预培养
将步骤（1）所得茎段放入预培养基中，预培养基为MS液体培养基添加4mg/L6-BA、1mg/LIAA、100μMAS；在28℃、100r/min下振荡培养4小时；
（3）双菌株/双质粒混合菌液的制备
将质粒pLGNL和pLGFP分别转染两株农杆菌菌株EHA105中，pLGNL中含有选择标记基因NPTII和报告基因GUS,pLGFP中含有目的基因GFP；挑选转染成功的单菌落，分别接种于LB液体培养基中，28℃黑暗下220r/min振荡培养至OD600为0.8-1.0；然后将菌液用LB液体培养基稀释成OD600为0.1，在相同培养条件下进行二次活化，继续振荡培养至OD600为0.5；
将经过二次活化的分别含有质粒pLGNL和pLGFP的菌液按体积比1:1的比例混合，在28℃、5000r/min的条件下离心10分钟；去除上清液，用MS液体培养基重新悬浮菌株；
（4）外植体感染
将预培养后的外植体放入培养皿，将步骤（3）重新悬浮的农杆菌混合菌液倒入培养皿中，使所有的外植体均浸入农杆菌菌液中，浸染20分钟；然后将外植体用镊子夹入含有滤纸的培养皿中；用滤纸吸干外植体表面多余的农杆菌混合菌液；
（5）共培养
将外植体放在附加2mg/L6-BA、0.5mg/LIAA、1mg/L2，4-D和100μMAS的MS固体培养基上，在26℃、黑暗的条件下共培养3天；
（6）不定芽的诱导
将共培养后的外植体转入筛选培养基中；筛选培养基为MS固体培养基并附加2mg/LZEA、60mg/LKm、300mg/LVan；在28℃条件下暗培养15天；然后对外植体进行16小时光周期的光照培养，培养温度为28℃；
（7）不定芽的GFP荧光检测和GUS染色
运用徕卡荧光体式显微镜（滤光片为GFP2）对所有的不定芽进行GFP荧光检测，不定芽呈绿色的，确定为GFP阳性芽；GFP荧光检测后，对所有的不定芽进行GUS染色；GUS染色呈蓝色的，确定为GUS阳性芽；对既有GFP荧光，同时GUS染色又呈蓝色的，确定为共转化芽；
（8）不定芽试管内嫁接和田间二次嫁接
待共转化芽的茎长约0.5cm时，水平切下，试管微嫁接在枳橙砧木上；待嫁接口充分愈合后，从枳橙砧木的基部水平切下共转化芽，按照田间切接的方法将其嫁接在田间枳橙砧木上，用塑料袋保湿2周，待其成活后去除塑料袋；
（9）共转化植株的分子生物学鉴定
提取共转化芽的DNA，进行GFP基因和GUS基因的PCR分析，GFP基因和GUS基因可以扩增出相应的目的带的，确定为共转化柑桔；
对共转化植株中的GFP基因和GUS基因进行Southernblot分析，确定GFP和GUS基因都以单拷贝的形式共同插入到锦橙基因组中；
对共转化植株中的GFP基因和GUS基因进行表达分析，确定GFP基因和GUS基因在共转化植株中都获得了高效的表达。
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