CN105102621A - 多系统萎缩症风险的检测方法、检测试剂盒以及多系统萎缩症的治疗或预防药物 - Google Patents

多系统萎缩症风险的检测方法、检测试剂盒以及多系统萎缩症的治疗或预防药物 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于通过确定MSA的致病基因而阐明发病机理，进而寻找出其治疗方法。本发明提供一种检测个体的多系统萎缩症风险的方法，包括步骤：检测从个体采取的样品中的使辅酶Q10生物合成低下的突变。作为使辅酶Q10生物合成低下的突变，例如可以举出抑制辅酶Q2的表达或功能的突变。

Description

多系统萎缩症风险的检测方法、检测试剂盒以及多系统萎缩症的治疗或预防药物
技术领域
本发明涉及多系统萎缩症的发病风险的检测方法等。
背景技术
多系统萎缩症(MultipleSystemAtrophy；MSA)是一种难以治疗的神经变性疾病。平均发病年龄为57.5±7.2岁，临床表现以小脑性共济失调、帕金森病、自律神经失调症候、锥体束障碍症候的各种组合出现。具代表性的包括以小脑性共济失调为主要症状的MSA-C以及以帕金森病为主要症状的MSA-P这两种临床分型，MSA-C对应橄榄体脑桥小脑萎缩症，MSA-P对应纹状体黑质变性症。此外，存在以自律神经失调障碍为主要症状的Shy-Drager综合征。日本人中，与MSA-P相比MSA-C的发病率较高，而欧美人中MSA-P的发病率更高。
病理学上，神经胶质细胞胞浆包涵体(glialcytoplasmicinclusion；GCI)为特征，α-突触核蛋白为主要成分。
MSA被视为具代表性的散发性神经变性疾病，虽然非常罕见，但是目前为止已发现多个MSA多发家系(非专利文献1-3)，启示着存在遗传性因素的参与。
目前为止，MSA的发病机理完全没有阐明，作为治疗实施着对应症状的对症治疗法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:HaraK等人ArchNeurol2007；64:545-51.
非专利文献2:WullnerU等人JNeurolNeurosurgPsychiatry2009；80:449-50.
非专利文献3:HohlerAD和SinghVJ.JClinNeurosci2012；19:479-80.
发明内容
技术问题
本发明的目的在于通过确定MSA的致病基因而阐明发病机理，进而寻找出其治疗方法。
技术方案
本发明的发明者们为解决上述技术问题，反复研究的结果发现MSA多发家系中存在对羟基苯甲酸酯聚戊烯转移酶(Para-hydroxybenzoate-polyprenyltransferase)基因(以下有时将Para-hydroxybenzoate-polyprenyltransferase(EC2.5.1.39)称为“辅酶Q2”或“CoQ2”，其基因称为“COQ2”或“COQ2基因”)突变的携带者，确认部分家族性多系统萎缩症中，只要出现COQ2突变的纯合型突变或者复合杂合型突变，即为充分条件而发病。并且，还发现在散发性MSA中，杂合的COQ2突变是MSA发病的巨大危险因素。而且，由于COQ2参与CoQ10的生物合成，因此对家族性以及散发性MSA患者的组织中的CoQ10量进行测定，其结果证实了CoQ10量变为低下，确认了在理论上极力启示CoQ10给药具有治疗效果，从而完成了本发明。
即，本发明涉及以下(1)至(9)：
(1)一种检测个体(subject)的多系统萎缩症风险的方法，包括步骤：检测从个体采取的样品中的使辅酶Q10生物合成低下的突变。
(2)如上述(1)所述的方法，所述的使辅酶Q10生物合成低下的突变，是抑制对羟基苯甲酸酯聚戊烯转移酶(Para-hydroxybenzoate-polyprenyltransferase)(辅酶Q2)的表达或功能的突变。
(3)如上述(2)所述的方法，所述的抑制辅酶Q2的表达或功能的突变选自由序列号1中的P49H、S57T、R69H、M78V、I97T、P107S、S113F、T267A、S297C、R337Q、R337X以及V343A组成的群。
(4)如上述(2)所述的方法，所述的抑制辅酶Q2的表达或功能的突变为V343A。
(5)一种检测多系统萎缩症风险的试剂盒，包括以下(i)至(iii)中的至少一个：
(i)与一种区域杂交的核酸，该区域包含辅酶Q2基因中的、编码从由辅酶Q2蛋白(序列号1)的49位、57位、69位、78位、97位、107位、113位、267位、297位、337位以及343位组成的群中选择的位点的氨基酸的核酸；
(ii)能够扩增一种区域的引物对，该区域包含辅酶Q2基因中的、编码从由辅酶Q2蛋白(序列号1)的49位、57位、69位、78位、97位、107位、113位、267位、297位、337位以及343位组成的群中选择的位点的氨基酸的核酸；
(iii)仅与在序列号1中具有从由P49H、S57T、R69H、M78V、I97T、P107S、S113F、T267A、S297C、R337Q、R337X以及V343A组成的群中选择的至少一个突变的辅酶Q2蛋白、和野生型辅酶Q2蛋白中的任意个结合的不发生交叉反应的抗体。
(6)一种包含辅酶Q10的多系统萎缩症的预防或治疗药剂。
(7)一种包括辅酶Q10给药步骤的多系统萎缩症的预防或治疗方法。
(8)一种多系统萎缩症的预防或治疗药剂的筛选方法，包括步骤：
使候选化合物和细胞相接触而进行培养(incubate)；
选择使细胞内的辅酶Q10量提高的候选化合物。
(9)一种编码包含V343A突变的辅酶Q2蛋白的核酸。
有益效果
根据本发明，通过检测个体的COQ2基因的特定突变的有无这一简便的方法，能够评估MSA发病风险。
如果被判断为高MSA发病风险，则认为通过补充CoQ10而抑制发病，并且极力启示CoQ10的补充可能对MSA的治疗也是有效的。
附图说明
图1A示出6个MSA多发家系的家系谱图。FMSA_1的父母是嫡亲兄妹婚(firstdegreecousin)。FMSA_1的患者(II-4以及II-8)两个人均患有视网膜色素变性，而其他的兄弟姐妹既未患MSA也未患视网膜色素变性。FMSA_1的II-4和II-8、以及FMSA_8的II-6通过活检被确诊为MSA。FMSA_8的另外2名兄弟姐妹是PD患者。□表示男性，○表示女性，黑色表示MSA患者，灰色表示PD患者，白色表示两种病皆未患有者，黑点表示已得到基因组DNA。MSA-C是以小脑性共济失调为主要症状的MSA，MSA-P是以帕金森病为主要症状的MSA，PD表示帕金森病。
图1B示出FMSA_1的多位点参数连锁分析。利用管道软件SNPHiTLink，通过遗传平衡(Hardy-Weinberg)检验选择p值＞0.05、就诊率(callrate)＞0.95、基因分型的置信度＜0.1、对照者的少见等位基因频率(minorallelefrequency)＞0、以及用于连锁分析的标记间距离为80kb到120kb的SNP。利用Allegroversion2进行多位点参数连锁分析(具有完全外显率的常染色体隐性遗传)以及单倍体的重建。LOD值(LODscore)的最大值为1.93，横跨包含染色体4上的区域(NCBI36/hg18组装(assembly)的72.795Mb到89.616Mbat)、5上的区域(149.50Mb到168.32Mb)、6上的区域(85.499Mb到87.382Mb)、7上的区域(62.754Mb到64.907Mb)、9上的区域(99.781Mb到115.484Mb)、以及13上的区域(75.849Mb到98.253Mb)的大约80Mb的区域。
图1C是筛选作为候选的突变的过程的说明图。通过全基因组测序共发现3,492,929个SNV和得失位(indel)，其中54,306个位于候选区域。其中，342个编码外显子或接合区域，78个为非同义突变或剪接区域突变。其中，在dbSNP130尚未登录的新型SNV仅有4个。
图1D示出FMSA_1的患者(II-4。上图)以及非患病者(II-7。下图)的直接测序的结果。患者具有M78V-V343A的纯合体。
图2A示出COQ2变异体的酵母互补分析(yeastcomplementationassay)的结果。包含野生型(wt)人类COQ2基因cDNA的pAUR123载体或者用mock载体转化的酵母coq2无效突变体的增殖曲线在左侧图表示。利用包含具有各种突变的人类COQ2的cDNA(L16V、P22L、F29L、N336H、V343A、I97T、T267A或S297C)的pAUR123载体而转化的酵母coq2无效突变体的增殖曲线在中间图表示。I97T、T267A、以及S297C与野生型COQ2相比增殖率低很多，但显示出比coq2无效株更高的增殖率(中度有害的突变)。L16V、P22L、F29L、N336H、以及V343A显示出与野生型COQ2相同水平的增殖率。利用包含具有各种突变的人类COQ2cDNA(P49H、S57T、R69H、M78V、M78V-V343A、P107S、S113F、R337X或R337Q)的pAUR123载体而转化的coq2无效突变体的增殖曲线在右侧图表示。这些与coq2无效株同样地表现出呼吸依赖性增殖率的显著下降(非常有害的突变)。各酵母株经YPD培养基的予培养，稀释到OD600为0.1，置于酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖(YPG)培养基中23℃下以200转/分钟振摇温育(incubate)4天。每10分钟测定一次OD600，按培养时间制作成图表。CoQ2的活性通过测定放射性对羟基苯甲酸(PHB)的聚十异戊二烯(decaprenyl)PHB的掺入而求出。
图2B示出CoQ2变异体的酶活性的测定结果。从具有COQ2基因的任何一个突变(R337Q/V343A、R337X/V343A、V343A/V343A、或者V343A/wt)的MSA患者以及无突变的对照者获得的淋巴母细胞样细胞的CoQ2活性进行测定。各对象的酶活性(pmol/mg-protein/minute)以9次单独实验的中间值(圆柱)和标准偏差(棒状)表示。群比较是利用Kruskal-Wallis检验进行，多重检验利用的是Steel法。对于1名对照者(野生型COQ2基因型)*p<0.05。
图2C示出MSA患者的冷冻小脑样品的CoQ10浓度的测定结果。测定了3名MSA患者(1名为M78V-V343A/M78V-V343A以及2名为V343A/wt)与3名对照者(wt/wt)的冷冻小脑样品的CoQ10浓度。将约100mg的脑组织在含10倍量(v/wt)的0.32M的蔗糖、1mM的EDTA以及20％的SDS的10mMTrisHCl(pH7.4)中均质。接着，正己烷/乙醇(5:2v/v)中抽提CoQ10，抽提物中的CoQ10浓度用HPLC测定，调整游离胆固醇浓度。
图3是AndrewJ.等,TheAmericanJournalofHumanGenetics84,558-566,May15,2009的图1。示出CoQ10的生物合成的简图。
图4示出将MSA患者为对象的泛醌醇的临床试验概要(outline)。
图5示出以各用量给予泛醌醇后的血浆CoQ10浓度(μg/ml)的测定结果。
图6示出以各用量给予泛醌醇后的单核细胞中的全CoQ10/游离胆固醇(nM/μM)的测定结果。
图7示出以各用量给予泛醌醇后的髓液CoQ10浓度(μg/ml)的测定结果。
图8示出以各用量给予泛醌醇后的尿中8-OHdG(ng/mg-Cre)的测定结果。
图9示出泛醌醇的临床评价量表。
图10示出泛醌醇的给药前后的脑血流量和氧代谢量的测定结果。
具体实施方式
[MSA风险的检测方法]
本发明所涉及的MSA发病风险的检测方法包括步骤：检测从个体(subject)采取的样品中的降低辅酶Q10生物合成的突变。
本说明书中，MSA风险的检测方法，是指为了收集用于判断个体的MSA发病可能性的高低、或者用于当个体出现MSA样症状时判断实际上是否是MSA而必要的信息，进行检测的方法。本发明所涉及的检测方法可以由检测公司等实施。
对于MSA的临床分型没有特别限定，但是如下面所述，本发明所涉及的方法中特定方式适用于MSA-C的特异性检测。
本说明书中，CoQ10是指又称为泛醌的苯醌衍生物。有时又将氧化型称为泛醌，还原型称为泛醌醇，但是本说明书中CoQ10可以是氧化型，也可以是还原型。
在图3中示出CoQ10生物合成途径的概略图。如果CoQ2酶作用下，对羟基苯甲酸(P-hydroxybenzoicacid；PHB)发生异戊烯基化(Prenylation)，则生成聚十异戊二烯(decaprenyl)PHB。该聚十异戊二烯PHB进一步因多种辅酶的作用而受到多种修饰，由此CoQ10被生物合成。
如下面所述的实施例所示，本发明的发明者们阐明了与CoQ10的生物合成有关的COQ2基因的突变，与MSA风险有关。因此，可以理解不仅COQ2的突变，只要使CoQ10生物合成低下的突变，可能提高MSA风险。作为使CoQ10的生物合成低下的突变，除了在下面说明的COQ2突变外，例如还可以举出参与CoQ10的生物合成的各种酶的突变，但是不限于此。本领域技术人员可以适宜选择使CoQ10的生物合成低下的公知的突变或新发现的突变，并检测这种突变。
在本说明书中，对于从个体采取的样品而言，只要能够检测出使CoQ10的生物合成低下的突变，无论何种样品均可，但是例如可以举出血液或其他体液、皮肤、组织、细胞等。
作为使CoQ10的生物合成低下的突变的一种例子，可以举出抑制CoQ2表达或功能的突变。
在本说明书中，CoQ2是具有以下的氨基酸序列的酶，由COQ2基因编码。也被称为对羟基苯甲酸酯聚戊烯转移酶(Para-hydroxybenzoate-polyprenyltransferase)，在CoQ10的生物合成中，催化从聚十异戊二烯焦磷酸向PHB转移聚十异戊二烯基的反应。
MLGSRAAGFARGLRALALAWLPGWRGRSFALARAAGAPHGGDLQPPACPEPRGRQLSLSAAAVVDSAPRPLQPYLRLMRLDKPIGTWLLYLPCTWSIGLAAEPGCFPDWYMLSLFGTGAILMRGAGCTINDMWDQDYDKKVTRTANRPIAAGDISTFQSFVFLGGQLTLALGVLLCLNYYSIALGAGSLLLVITYPLMKRISYWPQLALGLTFNWGALLGWSAIKGSCDPSVCLPLYFSGVMWTLIYDTIYAHQDKRDDVLIGLKSTALRFGENTKPWLSGFSVAMLGALSLVGVNSGQTAPYYAALGAVGAHLTHQIYTLDIHRPEDCWNKFISNRTLGLIVFLGIVLGNLWKEKKTDKTKKGIENKIEN(序列号1)
作为使CoQ10的生物合成低下的CoQ2的突变，例如可以举出P49H、S57T、R69H、M78V、I97T、P107S、S113F、T267A、S297C、R337Q、R337X以及V343A。在此，49、57等数字分别表示由序列号1表示的氨基酸序列的49位、57位等，在数字的左侧以一文字记载的氨基酸表示野生型的氨基酸残基，而在数字的右侧以一文字记载的氨基酸表示突变型的氨基酸残基。如R337X，当数字的右侧不存在字母、或者在数字的右侧的字母为X时，表示突变型中在该氨基酸部分产生终止密码子而之后的氨基酸序列缺失。
在这些突变中，V343A是日本人特有的突变。日本人与欧美人相比，由于MSA-C较多，因此被认为V343A的突变与MSA-C有高度相关。
进一步而言，人类COQ2基因在第一外显子包含四个ATG密码子。序列号1是以该四个ATG密码子中的第四个密码子为翻译起始密码子的、依据UniProt数据库(Q96H96,http://www.uniprot.org/uniprot/Q96H96)的序列。
分别利用将第一个ATG密码子为翻译起始密码子的NCBI参考序列(NCBIReferenceSequence)的NM_015697.7和NG_015825.1，以及基因库(GenBank)的BC008804.2，对各突变进行注释(annotation)而比较，示出在下列表中。
[表1]
这些氨基酸的突变被认为是基于核酸的突变，因此突变的检测可以通过检测基因组DNA上的突变而进行，也可以进行RNA水平或蛋白质水平的检测。也可以从来源于个体样品的RNA制备cDNA，检测cDNA中的突变。对于分离DNA或RNA的方法而言，不作特别限定，可以根据本领域技术人员所公知的方法提取、分离染色体DNA或RNA。
检测核酸突变时，本领域技术人员从上述的氨基酸突变能够容易地确定在核酸水平上应当检测哪一种突变。
在DNA水平检测突变的方法例如可以使用如下的方法。
(i)PCR-RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism：限制性酶切片段长度多态性)
该方法是利用具特定突变的基因由限制酶的酶切而产生的片段的长度不同，检测突变的方法。例如，可以根据以下顺序进行。对于从个体获得的基因组DNA，利用PCR方法扩增包含待测突变的区域。使识别突变位点的限制酶作用于扩增产物，通过如电泳方法等方法分离、鉴定酶切片段。根据生成的片段长度能够确认是否有限制酶的酶切，进而能够确认是否有突变。本方法也可以从个体样品提取RNA，利用逆转录酶制备cDNA，由此进行。
(ii)等位基因特异性PCR
该方法利用以下原理：当使用与包含突变的区域杂交的引物(等位基因特异性寡核苷酸(allele-specificoligonucleotide):ASO)进行PCR，具有突变时，在该引物与DNA模板之间产生错配，因此在退火温度高时不发生延伸反应。通过如电泳方法等方法分离、鉴定扩增产物，通过确认是否有扩增，能够获知样品DNA是否有突变。
(iii)单链构象多态性(singlestrandconformationpolymorphism：SSCP)方法
如果利用PCR扩增DNA后，解链为单链，则单链DNA因以碱基对形成为例的各种分子内相互作用而呈现依赖于碱基序列的固有的构象。与呈稳定的双螺旋结构的双链DNA相比，对于单链DNA构象而言，即使仅存在一个碱基差异也会有变化。因此，将单链DNA在聚丙烯酰胺中进行电泳，则根据构象的不同而迁移率也会有差异，通过检测该迁移率的差异，能够判断是否有突变。
具体而言，例如，利用用32P等标记的引物，通过PCR扩增从个体获得的染色体DNA。将所获得的标记DNA片段热变性为单链DNA，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离该单链DNA，用放射自显影检测条带的位置变化。
(iv)变性剂浓度梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis:DGGE)方法
该方法是利用以下原理而检测是否有突变的方法：如果双链DNA中存在错配，由变性剂引起的变性则会变得容易发生；以及双链DNA在部分熔解的状态下，电泳的迁移率会显著降低。
具体而言，在加入了尿素、甲酰胺等变性剂的浓度梯度的聚丙烯酰胺凝胶上，对根据需要而用限制酶等处理过的个体DNA样品、正常DNA片段以及它们的互补探针核酸的混合物进行电泳，分离样品。如果存在因突变而引起的错配，则由于在更低的浓度的变性剂中解链为单链，因此在变性剂浓度低下的凝胶区域，电泳速度会变慢。从而，通过与正常DNA样品的条带进行比较，能够检测出是否有错配，其结果能够检测出是否有突变。
变性剂的浓度梯度可以垂直加入(垂直梯度法)，也可以水平加入(水平梯度法)。另外，还研发有利用了与DGGE类似的原理的温度梯度凝胶电泳法(temperaturegradientgelelectrophoresis:TGGE)。
(v)利用微阵列的方法
检测在微阵列上固定的探针DNA与DNA或RNA样品的特异性杂交，分析是否有突变的办法。例如有以下等方法：检测是否有杂交的方法；将探针DNA的3'末端对应于突变预想位点而进行杂交，添加带标记的双脱氧核苷酸与DNA聚合酶，检测是否有延伸反应的方法。标记可以选择各种荧光染料、放射性物质、能够以电化学方法检测出的化合物等。
另外，特异性杂交是指在普通杂交条件下、优选地在高严格杂交条件下的特异性杂交。在本说明书中，高严格条件是指例如至少约6×SSC以及1％SDS的65℃溶液中，进行杂交，第一次清洗用42℃的20％(v/v)甲酰胺(0.1×SSC中)，清洗10分钟，之后的清洗用65℃的0.2×SSC以及0.1％SDS，虽然可以在前述条件下进行，但是不限于此，本领域技术人员可以选择适宜条件。
(vi)焦磷酸测序(Pyrosequencing)法
该方法是以化学发光检测测序反应的方法。用PCR扩增个体来源的DNA，然后纯化单链DNA，将适宜的引物杂交后，以一个一个碱基添加脱氧核苷酸。伴随延伸反应而产生的焦磷酸引发级联反应，因生成的ATP以荧光素为反应底物荧光素酶发光。通过检测该发光，能够确定被检DNA的碱基序列，能够以高精度检测突变(Alderborn,A.等人:GenomeRes.(2000)28:1249-1258)。
(vii)Sanger法
当使用靶DNA和引物而合成DNA时，一同加入4种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)与任意一种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，以使ddNTP掺入时合成终止，从而合成各种长度的DNA。分别用4种双脱氧核苷三磷酸进行该反应后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离各种长度DNA。即使一个碱基的差异都能通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定出，因此通过检测合成在哪一位置上终止，能够获知靶DNA的碱基序列。具体而言，各DNA通过各种方法被标记，使用热循环仪的热循环反应等确定碱基序列。DNA标记方法，包括荧光标记引物的DyePrimer法、荧光标记ddNTP的DyeTerminator法、荧光标记底物dNTP的Internal-label法。
在本发明中，以从个体获得的基因组DNA为模板，通过PCR法扩增包含待检测突变的区域，可以作为靶DNA。
(viii)通过第二代测序仪的方法
本发明中还可以使用以下方法：以从个体获得的基因组DNA为模板，通过PCR法扩增包含待检测突变的区域，使用第二代测序仪进行序列分型。第二代测序仪，是将使用Sanger法的测序仪作为“第一代测序仪”，与该测序仪比较而言的术语。原理上有许多种，但通过超高并行处理，能够以低成本且短时间内检测大量的碱基序列(例如，HoltR.A.和JonesS.J.:GenomeRes.,Vol.18(6):839-864,2008)。
用于检测突变的其他的方法，例如还可以举出如下方法：利用质量分析仪(MALDITOF-MS等)，以质量差异而检测多型的方法；使用用猝灭剂(quencher)和荧光染料标记的等位特异寡核苷酸以及TaqDNA聚合酶，通过PCR反应而进行分型(typing)的荧光定量PCR(TaqManPCR)法；所谓侵染探针(invader)法；滚环(rollingcircle)法；使用测序仪进行样品DNA序列分型的方法、变性HPLC(denaturedHPLC)法、解链温度(MeltingTemperature)分型、PCR-SSOP(sequence-specificoligonucleotideprobe；PCR-序列特异寡核苷酸探针)法、PCR-PHFA(preferentialhomoduplexformationassay；PCR-同源双链优先形成试验)法、PCR-RSCA(referencestrandconformationassay；参考链构象分析)法等，但是不限于这些方法。
作为在RNA水平上检测突变的方法，例如可以使用以下方法。
(i)Northern印迹杂交(Northernblot)法
从来源于个体的样品通过常规方法提取mRNA，在含有乙二醛、甲酰胺、甲醛、甲基汞等的溶液中加热，使分子内的氢键断裂，破坏构象而成为线状。然后，使用含甲醛的琼脂糖凝胶进行电泳。将凝胶在15～20×SSC的高碱性溶液中，转印到尼龙膜或硝酸纤维素膜。使用硝酸纤维素膜时，在80℃真空烘烤中处理2小时，固定RNA。使用尼龙膜时，例如照射紫外线，通过交联固定RNA。
接着，为了鉴定滤膜上的特定的mRNA，从克隆的cDNA制作探针加入标记，将探针与滤膜在特定条件下接触后，能够检测出只有与cDNA探针结合的mRNA。本领域技术人员可以根据盐浓度、温度、碱基长度、组合等而适宜选择杂交条件。
靶mRNA为微量时，还可以结合RT-PCR法。对于RNA样品，使用反转录酶和寡核苷酸(dT)引物进行反转录反应，将获得的cDNA通过PCR进行扩增后，使用标记的互补核酸检测cDNA。
(ii)斑点杂交(Dotblot)法
该方法是Northern印迹杂交法演变而来，将从个体来源的样品提取的mRNA通过甲基氢氧化汞方法等变性后，在多种浓度下，在硝酸纤维素等的滤膜上以斑点(dot)点样，与用放射性标记等标记的探针进行杂交，检测信号强度。虽然有可能还会检测出与探针具有同源性的其他的mRNA、或与目的mRNA长度不同的mRNA，但是比Northern印迹杂交法更为简便。
(iii)RNA酶(RNase)保护试验
该方法利用RNA酶不会分解与靶RNA完全一致而杂交的双链RNA，但如果存在错配，则在该处酶切的原理。首先，将用32P等标记的mRNA作为探针，与样品RNA进行杂交后，用RNA酶消化。反应产物用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等进行电泳，测定大小。如果转录产物与探针RNA完全互补，则会出现较大的1条条带，但是如果存在错配，则条带的大小变小，或者出现2条以上的条带，因此能够确认是否有目的RNA。
(iv)原位杂交(insituhybridization)
从个体获得的样品用蛋白降解酶、盐酸等进行预处理后，为了抑制探针的非特异性结合，用鲑鱼精DNA或白蛋白等封闭。然后，用标记物质标记的探针RNA和组织样本杂交约24小时，随后清洗组织样本，通过放射自显影或免疫组织化学方法，检测靶位。并且，靶mRNA为微量时，还可以使用原位RT-PCR法。使用反转录酶和寡核苷酸(dT)引物进行反转录反应，将获得的cDNA通过PCR进行扩增后，使用标记的互补核酸检测cDNA。
(v)实时荧光定量PCR(Real-TimePCR)法
实时荧光定量PCR法是通过荧光检测PCR扩增产物的检测方法。包括使用以SYBRGreen为代表的特异性插入到双链核酸中的荧光标记的插入法以及使用以荧光定量(TaqMan)探针为代表的荧光标记的突变序列特异性探针的方法。利用实时荧光定量PCR法时，也可以从样品中的RNA通过使用反转录酶获得cDNA，以此为模板。
(vi)DNA微阵列
除此以外，在RNA水平上的检测，也可以根据使用DNA微阵列的方法进行。从个体的样品提取总RNA，使用固定了与多个具有突变的目的RNA分别互补的DNA的DNA微阵列，能够一次检测出多个突变。
作为蛋白质水平的突变检测方法，例如可以举出免疫分析法(immunoassay)，该方法使用仅与具有突变的CoQ2和没有突变的CoQ2中的任意个结合的不发生交叉反应的抗体，确认是否有与抗体的结合。本领域技术人员可以根据公知的方法制备这种抗体。与抗体的结合，可以通过公知的方法标记抗体或抗抗体而进行检测。用于标记的物质，例如可以举出：过氧化物酶，碱性磷酸酶等酶；125I、131I、35S、3H等放射性物质；异硫氰酸荧光素、若丹明、丹磺酰氯(dansylchloride)、藻红蛋白、四甲基异硫氰酸罗丹明、近红外荧光材料等荧光物质；荧光素酶、荧光素、水母发光蛋白等发光物质；除此之外，金胶体、量子点等纳米粒子。
作为蛋白质水平的突变检测方法，还可以举出免疫印迹法(westernblottingmethod)。从个体获得的样品用SDS等处理，破坏蛋白的高级结构使其变性后，通过SDS-PAGE根据分子量分离蛋白。电泳结束后，将凝胶与滤膜(硝化纤维、尼龙、PVDF等)叠加放置于转印装置，在凝胶内展开的蛋白质条带以电性转印(印迹)到滤膜上。为防止与蛋白的非特异性吸附，进行封闭后，与特异性结合到有突变或无突变的CoQ2的抗体进行一次反应。接着，将特异性识别一抗体分子的用发色酶等标记的二抗体与一抗体反应，通过二抗体的检测，检测靶蛋白。
并且，在本发明中，作为使CoQ10的生物合成低下的突变的检测，也可以检测CoQ2蛋白功能的低下。
CoQ2功能的低下，例如可以通过测定对羟基苯甲酸的异戊烯化活性的低下而确认。如实施例的记载，可以通过用放射性物质标记PHB，检测十聚异戊二烯(decaprenyl)PHB而测定CoQ2活性。
〔MSA风险的检测试剂盒〕
本发明所涉及的MSA风险的检测试剂盒，包含以下(i)至(iii)中的至少一个。(i)与包含辅酶Q2基因中的、编码从由辅酶Q2蛋白的49位、57位、69位、78位、97位、107位、113位、267位、297位、337位以及343位构成的群中选择的位点的氨基酸的核酸的区域杂交的核酸；
(ii)能够扩增包含辅酶Q2基因中的、编码从由辅酶Q2蛋白的49位、57位、69位、78位、97位、107位、113位、267位、297位、337位以及343位构成的群中选择的位点的氨基酸的核酸的区域的引物对(primerset)；以及
(iii)仅与具有从由P49H、S57T、R69H、M78V、I97T、P107S、S113F、T267A、S297C、R337Q以及R337X、V343A构成的群中选择的至少一个突变的辅酶Q2蛋白、和野生型辅酶Q2蛋白中的任意个结合的不发生交叉反应的抗体。
这些核酸或抗体可以用于本发明所涉及的MSA风险的检测方法。
上述(i)核酸能够与核酸中的突变位点特异性结合而检测是否有突变。核酸例如可以是5～100碱基长度、10～50碱基长度、15～30碱基长度等。本领域技术人员可以根据检测序列而适宜设计核酸的序列。
这些核酸可以被固定于固相载体。本说明书中，固相载体只要是能够固定DNA的载体，没有特别限定，例如可以举出玻璃制、金属制、树脂制等的微量滴定板(microtiterplate)、基板、珠(bead)、硝酸纤维素膜、尼龙膜、PVDF膜等。DNA可以通过公知的方法固定于这些固相载体上。
上述(ii)核酸可以通过PCR法特异性地扩增具有突变的核酸而检测突变。各引物例如可以是5～100碱基长度、10～50碱基长度、15～30碱基长度等。本领域技术人员可以根据检测序列而适宜设计引物序列。
上述(iii)抗体可以通过与具有突变的蛋白和野生型蛋白中的任意个不发生交叉反应地结合而检测CoQ2蛋白的突变。本领域技术人员可以根据公知的方法而制备抗体。抗体可以被标记，也可以固定在固相载体上。本发明所涉及的试剂盒可以根据需要而包含抗抗体。
另外，该抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。单克隆抗体可以如下制备：通过从用抗原免疫的动物分离抗体产生细胞，使该细胞与骨髓瘤细胞等融合而制备杂交瘤细胞，使单克隆抗体在该杂交瘤细胞中产生。多克隆抗体可以从用抗原免疫的动物的血清等获得。本发明所涉及的检测试剂盒所包含的抗体还可以用荧光物质、放射性物质等标记。
这种试剂盒例如还可以具备检测用探针，反转录酶，各种反应、检测试剂，缓冲液，使用说明书，抗抗体等。
〔MSA的诊断方法〕
本发明还包括检测从个体采集的样品中的使CoQ10生物合成低下的突变的MSA诊断方法。使CoQ10生物合成低下的突变的检测，可以按照本发明所涉及的检测方法而进行，因此在此省略说明。
〔MSA的预防或治疗药剂、以及预防或治疗方法〕
本发明所涉及的MSA的治疗药剂作为有效成分而包含CoQ10。并且，本发明所涉及的MSA的预防或治疗方法包含CoQ10给药步骤。如上所述，在部分MSA中，因参与CoQ10的生物合成的酶的突变而导致CoQ10量减少，这与发病有关。
MSA的给药方式没有特别限定，无论口服给药，或非口服给药均可。作为非口服给药，例如可以举出肌肉注射、静脉注射、皮下注射等注射给药，经皮给药、黏膜给药(经鼻、口腔、眼睛、肺、阴道、直肠)给药等。
CoQ10可以直接给药，或者也可以添加药学上可接受的载体、赋形剂、添加剂等而制成药剂。作为剂型，例如可以举出液体制剂(如注射液)、分散剂、悬浮剂、片剂、丸剂、粉剂、栓剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、锭剂、吸入剂、软膏剂、滴眼剂、滴鼻剂、滴耳剂、巴布剂等。
例如可以适当使用赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、增溶剂、助溶剂、着色剂、调味剂、稳定剂、乳化剂、吸收促进剂、表面活性剂、pH调节剂、防腐剂、抗氧化剂等，根据常规方法制备药剂。
药剂制备时可使用的成分，例如可以举出去离子水、盐水、磷酸缓冲液、葡萄糖、甘油、乙醇等药学上可接受的有机溶液，动植物油、乳糖、甘露醇、葡萄糖、山梨醇、结晶纤维素、羟丙基纤维素、淀粉、玉米淀粉、无水硅酸、硅酸铝镁、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯树胶、黄蓍胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、辛基十二烷基肉豆蔻酸酯、异丙基肉豆蔻酸酯、高级醇、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白等，但是不限于此。
片剂或锭剂也可以用糖衣、胃溶性、肠溶性物质包衣。
注射剂可以包含注射用蒸馏水、生理盐水、丙二醇、聚乙二醇、植物油、乙醇类等。进一步地，还可以添加润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂、增溶剂、助溶剂、防腐剂等。
CoQ10也可以与对MSA有效的其他的药物或治疗方法同时给药。例如，可以与目前对症治疗中所用的药物组合。
CoQ10还对于预防MSA有效。在本发明所涉及的检测方法中被判断为高MSA风险时，即使尚未发病，也可以通过补充CoQ10而防止发病、或者推迟发病。CoQ10还用在所谓的保健食品，并且安全性高且副作用少，因此可以长期服用。
当向人给予CoQ10时，给药量可以根据患者的年龄、性别、体重、敏感性差别、给药方法、给药间隔、有效成分的种类、制剂的种类而不同，虽没有特别限定，但是例如可以将30MG～2000MG、40MG～1500MG、100MG～1200MG，一次或分为多次给药。
〔MSA的预防或治疗药物的筛选方法〕
本发明所涉及的MSA的预防或治疗药物的筛选方法，是筛选多系统萎缩症的预防或治疗药剂的方法，包括步骤：将候选化合物与细胞接触；选择提高细胞内的辅酶Q10量的候选化合物。
筛选方法中所使用的细胞只要是生物合成CoQ10的细胞，没有特别限定，但是例如可以举出淋巴母细胞样细胞等。
对于候选化合物也没有特别限定，可以是低分子化合物、高分子化合物、核酸、蛋白质等。本领域技术人员可以适宜决定包括将这些候选化合物和细胞接触而温育(incubate)时的温度或时间的实验条件。可以考虑例如使参与CoQ10的生物合成的物质的功能增强的候选化合物、或者可以考虑抑制使参与CoQ10的生物合成的物质的功能低下的物质的功能的候选化合物等。
关于是否提高细胞内的CoQ10量，本领域技术人员也可以通过公知的方法而进行。可以通过测定CoQ10活性而评价量。
〔编码CoQ2蛋白的核酸〕
V343A突变是日本人特有的，通过研究，进一步阐明发病机理，认为能够有助于MSA的治疗或预防方法的研究开发。包含V343A突变的核酸对于前述研究是有用的。本发明还包括：包含这种核酸的重组载体、包含该载体的转化子等。
在本说明书中所引用的所有的专利文献以及非专利文献所公开的内容，通过参照而整体加入于本说明书。
实施例
以下，根据实施例而详细说明本发明，但是本发明不受实施例的任何限制。本领域技术人员在不脱离本发明的内容的基础上，可以对本发明进行各种方式的变更，这种变更也包含于本发明的范围。
1.对象和方法
1-1.以人为对象的研究的审批
个体(subject)于由东京大学以及其他研究参与机关的审查委员会审批的研究计划上做了登记。取得了所有个体的书面的知情同意(informedconsent)。
1-2.MSA多发家系
根据目前已达成共识(consensus)的MSA诊断基准，进行MSA的诊断(GilmanS,等Neurology2008；71:670-6.)。
本发明的发明者们到目前为止发表过4个日本MSA多发家系(FMSA_1至FMSA_4)(文献12)。在本研究中登记了包括患有MSA的2组兄弟姐妹所在的2个新的日本MSA家系(FMSA_8以及FMSA_12)的、6个MSA多发家系(图1A)。FMSA_1中有血族婚(父母是嫡亲兄妹婚(firstdegreecousin))，启示可能是常染色体隐性遗传。6个MSA多发家系的临床表现示出在表2。对FMSA_1的II-4以及II-8、FMSA_8的II-6实施了活检，确诊为MSA。
[表2]
缩写：“+”表示阳性；“－”表示阴性；“？”表示未知；“N.E.”表示未评价；“MRI”表示磁共振成像；“MSA-C”表示小脑型多系统萎缩症；“MSA-P”表示具有显著的帕金森症的多系统萎缩症。
1-3.散发性MSA患者和对照者
根据目前已达成共识(consensus)的基准，进行MSA的诊断(GilmanS,等Neurology2008；71:670-6.)。日本人队列(cohort)包括从JapanMultipleSystemAtrophyResearchConsortium(JAMSAC)获得样品提供的195名MSA患者和113名健康者。进一步地，将东京大学、高龄者Brainbank、东京都健康长寿医疗中心、新泻大学脑研究所、北海道大学大学院医学研究科以及鹿儿岛大学大学院医齿科综合研究科的168名MSA患者和407名对照者，作为对象。
作为独立的MSA队列(cohort)，使用了欧洲和北美队列。欧洲人的基因组DNA样品中包含PitieSalpetriere医院(法国)的138名MSA患者和281名对照者、NaplesFedericoII大学(意大利)的34名MSA患者和34名对照者、Bonn大学(德国)的46名MSA患者的样品。欧洲人列队中还包含悉尼大学的5名MSA患者样品。北美人的基因组DNA样品中包含从北美多系统萎缩症研究组(NorthAmericanMultipleSystemAtrophyStudyGroup；NAMSA-SG)获得样品提供的172名MSA患者和294名对照者的样品。参加者的统计示出在表3。
[表3]
缩写：“MSA-C”表示小脑型多系统萎缩症；“MSA-P”表示具有显著的帕金森症的多系统萎缩症；“N.A.”表示未适用(notapplicable)；“N.D.”表示未提及(notdescribed)。
取样年龄和发病年龄以平均值、标准偏差表示。
1-4.对照者的独立队列和其他的神经变性疾病队列
用于复制研究(Replicationstudy)的对照者的独立列队(n＝2,383)，是从JapaneseGeneticStudyConsortiumforAlzheimerDisease(JGSCAD)以及JapaneseConsortiumforAmyotrophicLateralSclerosisresearch(JaCALS)得到提供。为了研究CoQ2变异体和MSA相关的特异性，将其他的神经变性疾病(阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)以及肌萎缩侧索硬化症(ALS)患者；来自JGSCAD的2,728名AD患者、来自东京大学以及JapaneseParkinsonDiseaseSusceptibilityGeneConsortium的659名PD患者、来自东京大学以及JaCALS的634名ALS患者)也作为研究对象。
1-5.关联分析和全基因组测序
使用AffymetrixSNP6.0arrays对于FMSA_1进行了关联分析。将FMSA_1的II-4基因组DNA样品，利用IlluminaGenomeAnalyzerIIx(100-bp-longpairedends)，分析了4次。对人类基因组参考序列(NCBI36/hg18assembly)的对准(alignment)和突变的检测中使用了BurrowsWheelerAligner(BWA)以及Smatools。
1-6.COQ2基因的突变分析
利用扩增COQ2基因的各外显子的引物对表4，进行PCR，接着进行核苷酸序列分析。
[表4]
使用引物对进行了聚合酶链反应(PCR)而扩增具有LATaq(TaKaRa)的COQ2的各外显子。使用ExoSAP-1T(USB，OH，USA)、BigDycTerminatorv3.1试剂盒以及使用ABI3130和3730GeneticAnalyzers(Lifeechnologies,CA,USA)的XTerminator，进行了直接核苷酸序列分析。
外显子1Forwardprimersequence序列号2
外显子1Reverseprimersequence序列号3
外显子2Forwardprimersequence序列号4
外显子2Reverseprimersequence序列号5
外显子3Forwardprimersequence序列号6
外显子3Reverseprimersequence序列号7
外显子4Forwardprimersequence序列号8
外显子4Reverseprimersequence序列号9
外显子5Forwardprimersequence序列号10
外显子5Reverseprimersequence序列号11
外显子6Forwardprimersequence序列号12
外显子6Reverseprimersequence序列号13
外显子7Forwardprimersequence序列号14
外显子7Reverseprimersequence序列号15
1-7.根据酵母互补系统(YeastComplementationSystem)的COQ2基因的功能分析
对于野生型人类COQ2基因，使用表5的引物(从上到下的顺序，序列号为16～47)，根据PCR进行位点特异性突变导入。接着将野生型和突变型的人类COQ2基因cDNA插入到酵母表达载体pAUR123(Takara公司)。将酵母coq2基因无效突变体的BY4741Δcoq2株用包含野生型或突变型人类COQ2基因cDNA的pAUR123载体，使用YeastmakerYeastTransformationSystem2(Clontech公司)进行转化。通过用ODmonitor(Titech公司)，监测培养基的600nm吸光度(OD600)，测定含非发酵性碳源的培养基(酵母膏、蛋白胨、甘油培养基)中的增殖。
[表5]
使用引物与QuickChangeSite-DirectedMutagenesis试剂盒(Stratagene,CA,USA)进行了野生型人类COQ2的基于PCR的定点诱变。
1-8.CoQ2活性的测定
CoQ2(EC2.5.1.39)的活性通过测定放射性对羟基苯甲酸(PHB)的聚十异戊二烯(decaprenyl)PHB的掺入而进行分析。具体而言，使用QProteomeMitochondriaIsolation试剂盒(Qiagen公司)，从淋巴母细胞样细胞制备的线粒体组分(fraction)作为酶源。根据Lopez-Martin等人的方法(Lopez-MartinJM,等HumMolGenet2007；16:1091-7.)，制备由500μg的线粒体富集组分(fraction)、1000μM[14C]PHB(1.85MBq/μmol)以及含5μM聚十异戊二烯焦磷酸的100μL的测定用缓冲液(含0.05％的3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate)；CHAPS)组成的反应液。反应在37℃下进行60分钟，在1000μL正己烷中抽提。正己烷相的放射性物质利用液体闪烁计数器Tri-Carb2000CA(PerkinElmer公司)进行测定。结果以9个独立的实验平均值表示。
1-9.组织中的CoQ10水平的测定
将由152名MSA患者和76名对照者建立的EB病毒永生化淋巴母细胞样细胞(由JAMSAC提供)，在含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。从约107～108个淋巴母细胞样细胞，在4倍量的2-丙醇中抽提游离胆固醇和CoQ10，或者从根据3名MSA患者以及3名对照者的活检而制备的小脑冻结样品，在9倍量的2-丙醇中抽提游离胆固醇和CoQ10。
通过高速液体层析柱测定抽提物中的游离胆固醇和总CoQ10浓度(泛醌10以及泛醌醇10)。
1-10.统计分析
所有的结果用平均±标准偏差表示。携带者和非携带者的发病年龄的平均值的显著性差异通过studentt检验；等位基因频率和列联表的显著性差异通过Yates矫正卡方检验或Fisher的确切概率法检验；与比值比对应的95％置信区间(CI)通过Fisher的确切概率法检验，分别进行评价。群比较利用了Kruskal-Wallis检验和Steel法。所有的统计采用双侧检验，显著性水平采用p＝0.05。
2.结果
2-1.家族性MSA的致病基因的鉴定
根据使用常染色体隐性遗传方式的遗传模型的FMSA_1的参数化的多位点连锁分析，包括横跨染色体4、5、6、7、9以及13的约80Mb的区域的LOD值(LODscore)的最高值为1.93(图1B)。
对于FMSA_1中的患者(II-4)进行了全基因组测序，其结果获得了总计为187.5Gb的短序列(shortread)。参考基因组的平均覆盖度(coverage)为58倍。从位于候选区域的47,830的一碱基的突变(SNVs)或增添/缺失(indels)开始，将该家族的突变候选的范围缩小到4个新型非同义SNV(图1C)。
4个SNV为SHROOM3基因(NM_020859,Q8TF72)的c.2120A>G、p.K707Rin；COQ2基因(NM_015697,Q96H96)的c.1178T>C,p.V343A；COQ2基因的c.382A>G,p.M78V；以及SCEL基因(NM_144777,O95171)的c.691A>G,p.R231G。
筛选180名日本人对照者，其结果只有COQ2基因的M78V没有在对照者中发现，SHROOM3基因的K706R、COQ2基因的V343A以及SCEL基因的R231G的等位基因频率分别是3/360、5/360以及3/360、5/360。由于家族性MSA非常罕见，因此认为编码参与CoQ10的生物合成的对羟基苯甲酸酯聚戊烯转移酶(Para-hydroxybenzoate-polyprenyltransferase)的COQ2基因的M78V突变是家族性MSA的常染色体隐性遗传的原因的可能性高。通过FMSA_1的同时分离分析，得知2名患者(II-4以及II-8)具有COQ2基因中的M78V和V343A的纯合体，未患病兄弟姐妹(II-7)具有野生型序列(图1D)。
根据这些见解，进行了其他多个MSA家系中COQ2基因的编码区域和与其相连的剪接区域的核苷酸的直接分析。进一步地，在FMSA_12中的患者兄弟姐妹(II-3以及II-4)中，发现了COQ2基因的无义突变(c.1159C>T,p.R337X)以及错义突变(c.1178T>C,p.V343A)的杂合体。通过FMSA_12的同时分离分析，发现了他们的母亲(I-2)具有V343A的杂合体，未患病兄弟姐妹(II-1)具有野生型序列，其他未病患兄弟姐妹(II-2)具有R337X的杂合体，确认了2名患者的兄弟姐妹(II-3以及II-4)具有R337X和V343A的复合杂合体。R337X在180名日本人对照者中没有发现。其他4个MSA家系(FMSA_2、FMSA_3、FMSA_4以及FMSA_8)中，没有发现COQ2基因的突变。
从以上结果，得知FMSA_1以及FMSA_12的2个家系的家族性MSA中，如果具有M78V和V343A的纯合体、或者R337X和V343A的复合杂合体，这将成为充分条件而MSA会发病。
2-2.CoQ2变异体与散发性MSA的关联
为了研究对于散发性MSA的COQ2基因突变的参与，对更大的日本人队列(cohort)(363名MSA患者和520名对照者)进行了COQ2基因的再测序。虽然在dbSNP130中登记的非同义COQ2基因突变体只有一个(L16V、rs6818847)，但是本发明的发明者们确认了L16V的等位基因频率在日本人MSA中为0.90，在日本人对照者为0.88，因此将该变异体未包含在之后的分析中。
根据COQ2基因的再测序，明确了4名MSA患者同时具有2个突变(1名是I97T/V343A、1名是R337Q/V343A、2名是V343A/V343A)，但是对照者中不存在在COQ2中具有两个突变的人(表6)。
[表6]
缩写：“wt”表示野生型序列；“MSA”表示多系统萎缩症；通过酵母互补系统(YeastComplementationSystem)而被鉴定的“*”轻度(mildly)或“**”重度(severely)有害的变异体；“§”表示通过酶分析确定的降低的COQ2活性。
通过亚克隆的突变等位基因的核苷酸序列分析，得知R337Q/V343A为复合杂合体。I97T和V343A由于距离过大而不能进行PCR扩增，并且也没能从父母获得基因组DNA样品，因此不能确定I97T/V343A的相。确定了29名MSA患者具有V343A的杂合体，2名MSA患者具有其他杂合突变(P107S以及S113F)，但还确认了17名对照者也具有V343A的杂合体，2名对照者具有其他杂合体突变(P22L以及N336H)。
在COQ2基因突变体中，V343A是日本人中比较常见的突变。如表7所示，确认了V343A的等位基因频率在日本人MSA患者中为35/726(4.8％)，在日本人对照者中为17/1,040(1.6％)，并且，与对照者比较的MSA患者的比值比为3.05(95％C.I.、1.65～5.85)而显著(p＝1.5×10-4)。进一步地，对于日本人的对照者的第二队列(cohort)进一步进行了V343A的基因分型(genotyping)，其结果，对照者中V343A的等位基因频率为106/4,766(2.2％)，与对照者的第二队列比较的MSA患者比值比成为2.23(95％C.I.、1.46～3.32、p＝6.0×10-5)。
[表7]
缩写：“wt”表示野生型序列；“MSA”表示多系统萎缩症；“AD”表示阿尔茨海默病；“PD”表示帕金森症；“ALS”表示肌萎缩侧索硬化；“C.I.”表示置信区间。
“*”通过酵母互补分析测出的P49H，S57T，R69H，I97T，P107S，S113F，T267A，S297C以及R337Q为功能上有害变异体。
通过包括AD、PD以及ALS的其他神经变性疾病的基因分型(genotyping)，V343A的等位基因频率在AD患者中为109/5,456(2.0％)(其中2名具有V343A纯合体)、PD患者中为33/1,318(2.5％)、ALS患患者中为31/1268(2.4％)。这些等位基因频率在对照者的第一以及第二队列中没有发现显著差异，能够确认COQ2基因的V343A突变对MSA的特异性。
接着，我们对欧美人的MSA队列进行了分析。在欧洲人队列中，在各MSA患者中发现了4个单突变(singletonsites)(F29L、S57T、T267A、以及S297C)，但不存在具有CoQ2突变的对照者(表6)。在北美队列中，1名MSA患者中发现了1个单突变(P49H)，1名对照者中也发现了1个单突变(R69H)(表6)。令人关注的是，日本人群中比较容易发现的V343A突变在欧美人中无论在MSA患者群中还是在对照者群中均没有发现。由于任意队列中，V343A以外的变异体均为少见(表6)，因此接着，组合队列，着眼于COQ2基因突变与功能障碍的关联，研究这些变异体与MSA的关系。
2-3.根据酵母互补分析(yeastcomplementationassay)的COQ2基因突变体的功能分析
为了研究对CoQ10的生物合成和好氧产能的、各突变的对功能的影响，将酵母coq2基因无效突变体转化到野生型或突变型人类COQ2基因cDNA，进行了功能互补分析(图2A)。BY4741Δcoq2酵母株的突变COQ2基因(包括P49H、S57T、R69H、M78V、M78V-V343A、P107S、S113F、R337Q以及R337X)的转化子中，如在coq2无效突变体中发现的那样，呼吸依赖性增殖显著低下(非常有害的突变)。进一步地，突变型COQ2cDNA(包括I97T、T267A以及S297C)的转化子与表达野生型CoQ2的转化子相比低很多，但比无效株表现出更高的增殖率(中度有害的突变)。突变型COQ2cDNA(包括L16V、P22L、F29L、N336H以及V343A)的转化子表现出与表达野生型CoQ2的转化子同等的增殖率。
如果着眼于患者-对照者队列中被鉴定的稀少的变异体，则根据酵母互补分析(yeastcomplementationassay)中，被认为9个变异体(P49H、S57T、R69H、I97T、P107S、S113F、T267A、S297C以及R337Q)为中度到重度有害的变异体。对于这些功能性有害的稀少变异体，结合3个队列进行了分析，其结果，8个突变(P49H、S57T、I97T、P107S、S113F、T267A、S297C以及R337Q)在MSA队列(n＝758)中被鉴定，对照者队列(n＝927)仅有1个突变被鉴定(R69H)。MSA患者中的、与对照者相比的、有害的变异体的等位基因频率的比值比为9.83(95％C.I.,1.31～436.4)而显著(p＝0.014)(表7)。
2-4.淋巴母细胞样细胞中的CoQ2活性
接着，对于能够获得具有COQ2突变的淋巴母细胞样细胞，因与V343A变异体关联而测定了CoQ2活性。V343A是与MSA关联较大的突变，该变异体在酵母互补分析(yeastcomplementationassay)中表现出通常的增殖，因此选择了该变异体。测定了从具有任意的CoQ2突变(R337Q/V343A、R337X/V343A、V343A/V343A或V343A/wt)的MSA患者获得的淋巴母细胞样细胞以及从不具有突变的对照者获得的淋巴母细胞样细胞中的CoQ2活性。这些患者中的CoQ2活性与不具有突变的对照者相比显著低下(图2B)。在酵母互补分析(yeastcomplementationassay)中，尽管用V343A突变COQ2cDNA转化的酵母coq2无效株表现出通常的增殖速度，但V343A变异体中的CoQ2活性显著减少。
2-5.基因型和表现型的关联
COQ2基因突变(酵母互补分析(yeastcomplementationassay)以及CoQ2活性测定中被确认的功能缺损的CoQ2)的携带者的散发型MSA患者和非携带者的散发型MSA患者的临床特征示出在表8。
[表8]
缩写：“wt”表示野生型序列；“MSA-C”表示小脑型多系统萎缩症；“MSA-P”表示具有显著的帕金森症的多系统萎缩症。
取样年龄以及发病年龄以平均值、标准偏差表示。
“*”COQ2变异体的携带者与非携带者相比，用2×2列联表通过Fisher确切概率法检验的MSA-C对MSA-P的比值显著地高。
携带者群的MSA发病平均年龄比非携带者更高，其相差是显著的(p＝0.0021)。临床分型分别如下：34名携带者为MSA-C、5名携带者为MSA-P、1名携带者为没有被分类于任一个分型的型、468名非携带者为MSA-C、209名非携带者为MSA-P、42名非携带者为没有被分类于任一个分型的型。对于MSA-P的MSA-C的比通过利用了2×2列联表的Fisher确切概率法检验而求出，其结果，CoQ2突变的携带者与非携带者相比显著地高(p＝0.018)(表8)。
2-6.淋巴母细胞样细胞中的细胞内CoQ10浓度
测定了从V343A携带者的MSA患者得到的淋巴母细胞样细胞、从不具有突变的MSA患者得到的淋巴母细胞样细胞、以及不具有突变的对照者得到的淋巴母细胞样细胞中的细胞内CoQ10浓度。对象被分为(1)2个突变等位基因(R337Q/V343A、R337X/V343A以及V343A/V343A)携带者的MSA患者、(2)V343A的杂合体携带者的16名MSA患者、(3)不具有突变的133名MSA患者以及(4)不具有突变的76名对照者(表9)。
[表9]
缩写：“MSA”表示多系统萎缩症；“CoQ10”表示辅酶q10。
总CoQ10/游离胆固醇的结果以平均值以及括号中的标准偏差(nmol/mol)表示。
从2个突变等位基因的携带者的MSA患者获得淋巴母细胞样细胞内的CoQ10浓度比不具有突变的对照者相比低很多。具有V343A的杂合体的MSA患者中，与不具有突变的对照者相比，发现存在细胞内CoQ10浓度低下的倾向，但差异不显著。不具有COQ2突变的MSA患者的淋巴母细胞样细胞内的CoQ10浓度与不具有COQ2突变的对照者大致相同。
2-7.脑组织中的细胞内CoQ10浓度
虽然能够从具有COQ2突变的MSA患者获得脑组织的数有限，但测定了具有COQ2突变的3名患者(1名为M78V-V343A/M78V-V343A、2名为V343A/wt)的冻结脑组织以及不具有突变的对照者的冻结脑组织中的CoQ10浓度(图2C)。具有M78V-V343A的纯合体的MSA患者中的CoQ10浓度与不具有突变的对照者相比显著低下。
3.以MSA患者为对象的泛醌醇的临床试验
3-1.试验药物与给药方法
在家族性MSA发病者中，将具有COQ2基因的R337X/V343A复合杂合突变的患者1例(图1中所示的FMSA_12的II-4)为对象，进行了泛醌醇的临床试验。
作为从kaneka(カネカ)获得提供的泛醌醇(2-[(2E,6E,10E,14E,18E,22E,26E,30E,34E)-3,7,11,15,19,23,27,31,35,39-十甲基-2,6,10,14,18,22,26,30,34,38-癸酰基]-5,6-二甲氧基-3-甲基环己烷-2,5-二烯-1,4-二醇(2-[(2E,6E,10E,14E,18E,22E,26E,30E,34E)-3,7,11,15,19,23,27,31,35,39-decamethyltetraconta-2,6,10,14,18,22,26,30,34,38-decaenyl]-5,6-dimethoxy-3-methylcyclohexa-2,5-diene-1,4-diol))，将含120mg的稳定性粉末以规定的用量(600mg、840mg、1200mg)，从胃造瘘管(gastrostomytube)每天早上给药一次。
3-2.试验的设计、目的
是1例对象的没有设定对照的非盲法(Unblinded)探索性临床试验，以研究以下项目为目的而进行。
1.确认高用量给药的安全性
2.研究药代动力学
3.从药代动力学判断长期给药用量
4.研究临床指标
3-3.试验的评价项目
试验的评价项目如下。
(1)主要评价项目(Primaryendpoint)
·血浆以及白血球中、髓液中辅酶Q10浓度
·有害现象的有无
(2)次要评价项目(Secondaryendpoint)
·UMSARSPartII(运动功能的评价)
·尿中8-OHdG
·基于15O-PET的氧代谢能力评价
(3)安全性评价项目
·肝功能检测(AST，ALT，γ-GTP，ALP，T.Bil)
由于有向大鼠以300mg/kg给予辅酶Q10的结果，AST、ALT轻微上升的研究报告。
·主观症状，根据身体诊断、神经学诊断的客观判断
·实施的各种检测值的异常
3-4.试验概要
试验概要示出在图4。
3-5.短期给药与试验结果
·关于有害现象
在试验期间中，按时间观察(chronologicalobservation)主观症状、客观症状的有无，临床检测(血液，生化学检验：AST、ALT、γ-GTP、ALP、T.Bil、BUN、Cre、Na、K、Cl、Glu、CK)。
没有发生判断为与试验药物有关的有害现象。
3-6.血浆CoQ10浓度
血浆CoQ10浓度的测定结果示出在图5。
基础血浆CoQ10浓度在低水平。通过给药1200mg，达到了已有报告中的坪值(plateau)。泛醌的高用量给药的既有报告中，通过给药泛醌2400mg以上，在7.5～8.0μg/ml达到坪值。本试验中，用泛醌醇1200mg，达到7.9μg/ml，参考既有报告的数据而判断为达到坪值。
3-7.对单核细胞中的游离胆固醇的全CoQ10量
单核细胞中的全CoQ10/游离胆固醇(nM/μM)的测定结果示出在图6。通过泛醌醇的给药，确认了用量依赖性地、单核细胞中的全CoQ10/游离胆固醇的提高。
3-8.髓液CoQ10浓度
髓液CoQ10浓度(μg/ml)的测定结果示出在图7。没有关于泛醌、泛醌醇的给药时的髓液CoQ10浓度变化的研究报告。虽然基础髓液CoQ10浓度在低水平，但840mg，1200mg的给药群中观察到好像达到了坪值(plateau)。
3-9.尿中8-OHdG
尿中8-OHdG(ng/mg-Cre)的测定结果示出在图8。虽然基础尿中8-OHdG(ng/mg-Cre)在高水平(平均8.4,n＝500)，但是通过泛醌醇的给药而下降。没有明确地发现用量依赖性。
3-10.临床评价量表
临床评价量表示出在图9。虽然有轻微的变动，但难以认定为统计学上能判断为显著的变化。获得了对主治医、家族(妻)呼叫的反应的改善、上肢举起的改善、四肢颤动减轻的所感。但是，由于存在主观偏见、入院中的复原效果等复合因素，因此难以判断。
3-11.脑血流量、氧代谢量
脑血流量和氧代谢量的测定结果示出在图10。发现任意个在给药后有上升的倾向。
3-12.总结
在本次试验中第一次明确了以下点。
1.即使在高用量给药中，泛醌醇比泛醌生物利用度(bioavailability)更高。
2.用泛醌醇1200mg，血浆CoQ10达到坪值。观察到与先前研究中观察到的血浆CoQ10的坪值相一致的结果。这表明给予的CoQ10进入血浆中。
3.通过泛醌醇的给药，能够确认末梢血单核细胞的CoQ10含量上升。这表明给予的CoQ10进入细胞内。
4.通过泛醌醇的给药，能够确认髓液CoQ10浓度上升到高于正常对照的髓液CoQ10浓度的值。这表明给予的CoQ10进入到髓液。
5.通过2～4，表明给予的CoQ10能够补偿CoQ10的低下。
5.在给药泛醌醇1200mg的2周期间，没有观察到有害现象。
6.根据[15O]O2PET的评价，脑氧消耗量与给药前相比，明显得到改善。启示可能成为通过补充CoQ10，评价中枢神经系统的功能改善的替代标记(surrogatemarker)。

Claims (9)

1.一种检测个体的多系统萎缩症风险的方法，包括步骤：检测从个体采取的样品中的使辅酶Q10生物合成低下的突变。
2.如权利要求1所述的方法，所述的使辅酶Q10生物合成低下的突变，是抑制对羟基苯甲酸酯聚戊烯转移酶(辅酶Q2)的表达或功能的突变。
3.如权利要求2所述的方法，所述的抑制辅酶Q2的表达或功能的突变选自由序列号1中的P49H、S57T、R69H、M78V、I97T、P107S、S113F、T267A、S297C、R337Q、R337X以及V343A组成的群。
4.如权利要求2所述的方法，所述的抑制辅酶Q2的表达或功能的突变为V343A。
5.一种检测多系统萎缩症风险的试剂盒，包括以下(i)至(iii)中的至少一个：
(i)与一种区域杂交的核酸，该区域包含辅酶Q2基因中的、编码从由辅酶Q2蛋白的序列号1的49位、57位、69位、78位、97位、107位、113位、267位、297位、337位以及343位组成的群中选择的位点的氨基酸的核酸；
(ii)能够扩增一种区域的引物对，该区域包含辅酶Q2基因中的、编码从由辅酶Q2蛋白的序列号1的49位、57位、69位、78位、97位、107位、113位、267位、297位、337位以及343位组成的群中选择的位点的氨基酸的核酸；
(iii)仅与在序列号1中具有从由P49H、S57T、R69H、M78V、I97T、P107S、S113F、T267A、S297C、R337Q、R337X以及V343A组成的群中选择的至少一个突变的辅酶Q2蛋白、和野生型辅酶Q2蛋白中的任意个结合的不发生交叉反应的抗体。
6.一种包含辅酶Q10的多系统萎缩症的预防或治疗药剂。
7.一种包括辅酶Q10给药步骤的多系统萎缩症的预防或治疗方法。
8.一种多系统萎缩症的预防或治疗药剂的筛选方法，包括步骤：
使候选化合物和细胞相接触而进行培养；
选择使细胞内的辅酶Q10量提高的候选化合物。
9.一种编码包含V343A突变的辅酶Q2蛋白的核酸。
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