CN110208231A - 基于纳米孔膜/Au@ZIF检测8-羟基脱氧鸟苷的荧光生物传感器的制备方法 - Google Patents

基于纳米孔膜/Au@ZIF检测8-羟基脱氧鸟苷的荧光生物传感器的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种基于纳米孔膜/Au@ZIF检测8‑羟基脱氧鸟苷(8‑OHdG)的荧光生物传感器的制备方法，以3‑(2,3‑环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPMS)处理的氧化铝纳米多孔膜为载体，固定碳量子点并修饰8‑OHdG抗体，碳量子点和Au@ZIF组成荧光生物传感器的供体‑受体对；8‑OHdG与抗体修饰的碳量子点和Au@ZIF结合，使得碳量子点和Au@ZIF的距离10nm以内；当碳量子点受到波长为350nm的激发光激发时，碳量子点的荧光被Au@ZIF淬灭，比较检测到8‑OHdG前后荧光强度的变化测得8‑OHdG。本发明可实现8‑OHdG的快速检测，传感器检测灵敏度高，检测下限低，特异性强。

Description

基于纳米孔膜/Au@ZIF检测8-羟基脱氧鸟苷的荧光生物传感 器的制备方法
技术领域
本发明涉及一种传感器件的制备技术，尤其涉及一种基于纳米孔膜/Au@ZIF检测8-羟基脱氧鸟苷的荧光生物传感器的制备方法。
背景技术
8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)是机体内的活性氧物质(ROS)介导的DNA氧化损伤产物。在ROS介导的DNA氧化损伤过程中，鸟苷是DNA核碱基中最易被氧化的碱基，羟基自由基和超氧阴离子会直接攻击DNA分子中鸟嘌呤碱基的第8位碳原子，从而生成氧化性加合物8-OHdG。8-OHdG是被广泛认可的DNA氧化损伤的生物标志物之一，它具有同任何碱基配对的能力，会导致DNA复制时碱基的错配从而出现多种基因突变形式，可以直接引起基因的突变和癌基因的表达。也有研究表明它在体液中的表达水平与多种疾病相关。
目前8-OHdG的检测方法主要有高效液相色谱-电化学检测器分析(HPLC-ECD)法、酶联免疫吸附(ELISA)法、32P后标记法、气质联用分析(GC-MS)法。HPLC-ECD法检测费用昂贵、设备体积大；ELISA法存在交叉反应，可能导致检测值比真实值偏高；32P后标记法特异性还有待提高，且容易造成放射性污染。GC-MS法由于质谱仪价格昂贵，一般实验室难以应用，同时DNA碱基必须首先进行衍生化反应，这一过程容易导致副产物的形成，从而导致假阳性结果。
近年来，生物传感器由于其灵敏度高、特异性好、成本低等优势在分析检测领域有广阔的应用前景。量子点由于特殊的结构尺寸具有优良的荧光特性，即高荧光量子产率、耐光漂白、长荧光寿命等，使其在生物传感器中的应用十分普遍。金属有机骨架材料(MOFs)由于其具有微孔性、高比表面积、高结晶度、孔道结构规整等优点在储存、催化、检测等方面应用十分广泛的一种纳米材料ZIF-8作为MOFs中有代表性的一种骨架结构，因其晶体构造相对简单，具有较好的稳定性和相对大的孔容，再加之原料易得、成本低廉，成为目前研究最广泛的ZIFs。
氧化铝纳米多孔膜蜂窝状结构使得氧化铝纳米多孔膜比表面积大且容易修饰。基于氧化铝纳米多孔膜的荧光生物传感器，主要在膜上固定量子点及检测物所对应的抗体，捕获目标分子，再利用目标分子与连有抗体的Au@ZIF材料相连，使其发生荧光共振能量转移，表现为荧光强度的变化。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于纳米孔膜/Au@ZIF检测8-羟基脱氧鸟苷的荧光生物传感器的制备方法，实现8-OHdG的快速检测，传感器检测灵敏度高，检测下限低，特异性强。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种基于纳米孔膜/Au@ZIF检测8-羟基脱氧鸟苷的荧光生物传感器的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)制备以纳米孔膜为核心传感芯片的荧光生物传感器：直径为8～20mm的氧化铝纳米多孔膜，在沸腾双氧水中处理半个小时后，用去离子水清洗烘干，再用3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷进行硅烷化处理；
(2)固定8-OHdG抗体：往步骤(1)中得到的荧光生物传感器中加入碳量子点溶液150～250μL，浓度为40μg/mL，0～4℃下静置6～12h，使得碳量子点与经3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷修饰的多孔膜上的功能基团环氧基进行反应后固定在多孔膜上；用去离子水洗涤后再加入戊二醛溶液75～125μL，浓度0.00125％，静置半小时后用去离子水洗涤，再加入8-OHdG抗体，75～125μL，浓度为1ng/mL，4℃下静置8h，将准备好的传感器放在4℃条件下备用，其中碳量子点通过水热法合成：0.44g柠檬酸与168.8μL二乙烯三胺溶于15～25mL水中，转移到50mL聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中，在180～220℃下保持4～7h，所得产物自然冷却，得到棕色透明的液体为15～25mg/mL的碳量子点溶液；
(3)Au@ZIF的合成，过程如下：
ZIF悬浮液的合成：Zn(NO3)2·6H2O(9.6mL，0.070M)溶液与2-甲基咪唑溶液(9.6mL，0.43M)搅拌5～10min，其中溶剂为N’N-二甲基甲酰胺，转移到50mL聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中120℃反应5～7h，用甲醇洗涤后分散在20mL甲醇中；
Au-MPA的合成：HAuCl4·3H2O甲醇溶液(3.0mL，0.010M)与3-巯基丙酸(MPA)甲醇溶液(0.9mL，0.10M)混合，室温搅拌2～4h，离心后用甲醇洗涤两次，用超声将产物分散到4mL甲醇中；
Au@ZIF的合成：0.5mL Au-MPA用甲醇稀释至1.0mL，加入四丁基硼氢化铵甲醇溶液(1.0mL，0.25M)，搅拌20～40min后加入2.0mL ZIF悬浮液，搅拌1～2h后离心用甲醇洗涤，将产物分散在4mL去离子水中，其中四丁基硼氢化铵甲醇溶液需在配制后5～10分钟内使用；
(4)抗体修饰Au@ZIF：将Au@ZIF的溶液离心后稀释四倍制成25％Au@ZIF溶液，与0.1μg/mL的8-OHdG抗体按体积比20:1混合后4℃下静置8h；
(5)向步骤(2)制得的荧光生物传感器中加入1.75nM～3500nM 8-OHdG，4℃下静置4h，去离子水洗涤后测量荧光生物传感器的荧光强度，再加21μL经抗体修饰的Au@ZIF，4℃下静置4h，去离子水洗涤后测量荧光强度。
本发明有益的效果是，将8-OHdG抗体固定在氧化铝纳米多孔膜上，用于8-OHdG的检测。表面负载金纳米颗粒的ZIF材料连接抗体，用于荧光淬灭。实验表明该方法构建的荧光生物传感器灵敏度高、检测下限低且特异性强。
附图说明
图1为本发明检测原理示意图；
图2为本发明Au@ZIF的合成方法示意图；
图3为本发明8-OHdG浓度为350nM时加入Au@ZIF-Ab前后的荧光强度曲线图；
图4为本发明荧光传感器检测不同浓度8-OHdG前后的荧光强度曲线图；
图5为本发明荧光传感器检测不同浓度8-OHdG前后的荧光淬灭率与8-OHdG浓度的对数之间的线性关系。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步说明。
参照图1～图5，一种基于纳米孔膜/Au@ZIF检测8-羟基脱氧鸟苷的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备以纳米孔膜为核心传感芯片的荧光生物传感器：直径为8～20mm的氧化铝纳米多孔膜，在沸腾双氧水中处理半个小时后，用去离子水清洗烘干，再用3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷进行硅烷化处理；
(2)固定8-OHdG抗体：往步骤(1)中得到的荧光生物传感器中加入碳量子点溶液150～250μL，浓度为40μg/mL，0～4℃下静置6～12h，使得碳量子点与经3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷修饰的多孔膜上的功能基团环氧基进行反应后固定在多孔膜上；用去离子水洗涤后再加入戊二醛溶液75～125μL，浓度0.00125％，静置半小时后用去离子水洗涤，再加入8-OHdG抗体，75～125μL，浓度为1ng/mL，4℃下静置8h，将准备好的传感器放在4℃条件下备用，其中碳量子点通过水热法合成：0.44g柠檬酸与168.8μL二乙烯三胺溶于15～25mL水中，转移到50mL聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中，在180～220℃下保持4～7h，所得产物自然冷却，得到棕色透明的液体为15～25mg/mL的碳量子点溶液；
(3)Au@ZIF的合成，过程如下：
ZIF悬浮液的合成：Zn(NO3)2·6H2O(9.6mL，0.070M)溶液与2-甲基咪唑溶液(9.6mL，0.43M)搅拌5～10min，其中溶剂为N’N-二甲基甲酰胺，转移到50mL聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中120℃反应5～7h，用甲醇洗涤后分散在20mL甲醇中；
Au-MPA的合成：HAuCl4·3H2O甲醇溶液(3.0mL，0.010M)与3-巯基丙酸(MPA)甲醇溶液(0.9mL，0.10M)混合，室温搅拌2～4h，离心后用甲醇洗涤两次，用超声将产物分散到4mL甲醇中；
Au@ZIF的合成：0.5mL Au-MPA用甲醇稀释至1.0mL，加入四丁基硼氢化铵甲醇溶液(1.0mL，0.25M)，搅拌20～40min后加入2.0mL ZIF悬浮液，搅拌1～2h后离心用甲醇洗涤，将产物分散在4mL去离子水中，其中四丁基硼氢化铵甲醇溶液需在配制后5～10分钟内使用；
(4)抗体修饰Au@ZIF：将Au@ZIF的溶液离心后稀释四倍制成25％Au@ZIF溶液，与0.1μg/mL的8-OHdG抗体按体积比20:1混合后4℃下静置8h；
(5)向步骤(2)制得的荧光生物传感器中加入1.75nM～3500nM 8-OHdG，4℃下静置4h，去离子水洗涤后测量荧光生物传感器的荧光强度，再加21μL经抗体修饰的Au@ZIF，4℃下静置4h，去离子水洗涤后测量荧光强度。
本发明利用3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷修饰的氧化铝纳米多孔膜表面的环氧基团共价结合碳量子点，再将抗体与量子点相连，固定到氧化铝纳米多孔膜表面。表面负载AuNPs的ZIF颗粒与抗体连接。当8-OHdG与抗体结合后Au@ZIF与量子点距离缩短从而发生荧光共振能量转移，使量子点的荧光强度降低。与传统的8-OHdG检测相比，操作过程简单，灵敏度高。本发明所述的荧光传感器灵敏度下限为0.05nM。
以下结合附图及具体实施例对本发明作详细描述，但并不是限制本发明。
1、纳米多孔膜的修饰：直径为13mm的氧化铝纳米多孔膜，在沸腾双氧水中处理半个小时后，用去离子水清洗烘干，再用3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷进行硅烷化处理。
2、固定8-OHdG抗体：荧光生物传感器中加入碳量子点溶液(200μL，40μg/mL)，4℃下静置8h，使得碳量子点与经3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷修饰的多孔膜上的功能基团环氧基进行反应后固定在多孔膜上。用去离子水洗涤后再加入戊二醛溶液(100μL，0.00125％)，静置半小时后用去离子水洗涤，再加入8-OHdG抗体(100μL，1ng/mL)，4℃下静置8h，将准备好的传感器放在4℃条件下备用。其中碳量子点通过水热法合成：0.44g柠檬酸与168.8μL二乙烯三胺(摩尔比为1：3)溶于20mL水中，转移到50mL聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中，在200℃下保持5h，所得产物自然冷却，得到棕色透明的液体为20mg/mL的碳量子点溶液。
Au@ZIF的合成过程如图2所示：
ZIF悬浮液的合成：Zn(NO3)2·6H2O(9.6mL，0.070M)溶液与2-甲基咪唑溶液(9.6mL，0.43M)搅拌5min，其中溶剂为N’N-二甲基甲酰胺，转移到50mL聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中120℃反应6h，用甲醇洗涤后分散在20mL甲醇中。
Au-MPA的合成：HAuCl4·3H2O甲醇溶液(3.0mL，0.010M)与3-巯基丙酸(MPA)甲醇溶液(0.9mL，0.10M)混合，室温搅拌3h，离心后用甲醇洗涤两次，用超声将产物分散到4mL甲醇中。
Au@ZIF的合成：0.5mL Au-MPA用甲醇稀释至1.0mL，加入四丁基硼氢化铵甲醇溶液(1.0mL，0.25M)，搅拌30min后加入2.0mL ZIF悬浮液，搅拌1h后离心用甲醇洗涤，将产物分散在4mL去离子水中。其中四丁基硼氢化铵甲醇溶液需在配制后立即使用。
Au@ZIF-Ab的制备：将Au@ZIF的溶液离心后稀释四倍制成25％Au@ZIF溶液，与0.1μg/mL的8-OHdG抗体按体积比20:1混合后4℃下静置8h。
向荧光生物传感器中加入1.75nM～3500nM 8-OHdG，4℃下静置4h，去离子水洗涤后测量荧光生物传感器的荧光强度，再加21μL Au@ZIF-Ab，4℃下静置4h，去离子水洗涤后测量荧光强度。具体测试参数为：激发波长360nm，发射波长扫描范围400nm～600nm，激发狭缝5nm，发射狭缝5nm，光电倍增管电压400V。8-OHdG浓度为350nM的检测曲线如图3所示。
以氧化铝纳米多孔膜为传感器载体，以碳量子点为荧光供体，Au@ZIF为荧光受体，以荧光分光光度计为仪器平台对纳米多孔膜进行荧光强度扫描。具体测试参数为：激发波长360nm，发射波长扫描范围400nm～600nm，激发狭缝5nm，发射狭缝5nm，光电倍增管电压400V，得到荧光强度变化曲线。8-OHdG浓度不同时加入等量Au@ZIF-Ab的荧光强度曲线如图4所示。随着8-OHdG浓度的增加，荧光强度的淬灭率增加。以荧光强度的淬灭率为纵坐标，8-OHdG浓度为横坐标，制作线性曲线，如图5所示。线性关系公式为Y＝0.0264ln[X]+0.2106，线性度为0.94。

Claims (1)

1.一种基于纳米孔膜/Au@ZIF检测8-羟基脱氧鸟苷的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)制备以纳米孔膜为核心传感芯片的荧光生物传感器：直径为8～20mm的氧化铝纳米多孔膜，在沸腾双氧水中处理半个小时后，用去离子水清洗烘干，再用3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷进行硅烷化处理；
(2)固定8-OHdG抗体：往步骤(1)中得到的荧光生物传感器中加入碳量子点溶液150～250μL，浓度为40μg/mL，0～4℃下静置6～12h，使得碳量子点与经3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷修饰的多孔膜上的功能基团环氧基进行反应后固定在多孔膜上；用去离子水洗涤后再加入戊二醛溶液75～125μL，浓度0.00125％，静置半小时后用去离子水洗涤，再加入8-OHdG抗体，75～125μL，浓度为1ng/mL，4℃下静置8h，将准备好的传感器放在4℃条件下备用，其中碳量子点通过水热法合成：0.44g柠檬酸与168.8μL二乙烯三胺溶于15～25mL水中，转移到50mL聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中，在180～220℃下保持4～7h，所得产物自然冷却，得到棕色透明的液体为15～25mg/mL的碳量子点溶液；
(3)Au@ZIF的合成，过程如下：
ZIF悬浮液的合成：Zn(NO3)2·6H2O(9.6mL，0.070M)溶液与2-甲基咪唑溶液(9.6mL，0.43M)搅拌5～10min，其中溶剂为N’N-二甲基甲酰胺，转移到50mL聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中120℃反应5～7h，用甲醇洗涤后分散在20mL甲醇中；
Au-MPA的合成：HAuCl4·3H2O甲醇溶液(3.0mL，0.010M)与3-巯基丙酸(MPA)甲醇溶液(0.9mL，0.10M)混合，室温搅拌2～4h，离心后用甲醇洗涤两次，用超声将产物分散到4mL甲醇中；
Au@ZIF的合成：0.5mL Au-MPA用甲醇稀释至1.0mL，加入四丁基硼氢化铵甲醇溶液(1.0mL，0.25M)，搅拌20～40min后加入2.0mL ZIF悬浮液，搅拌1～2h后离心用甲醇洗涤，将产物分散在4mL去离子水中，其中四丁基硼氢化铵甲醇溶液需在配制后5～10分钟内使用；
(4)抗体修饰Au@ZIF：将Au@ZIF的溶液离心后稀释四倍制成25％Au@ZIF溶液，与0.1μg/mL的8-OHdG抗体按体积比20:1混合后4℃下静置8h；
(5)向步骤(2)制得的荧光生物传感器中加入1.75nM～3500nM8-OHdG，4℃下静置4h，去离子水洗涤后测量荧光生物传感器的荧光强度，再加21μL经抗体修饰的Au@ZIF，4℃下静置4h，去离子水洗涤后测量荧光强度。
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