CN105092339B - 一种藻体中富里酸亚组分的分级提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种藻体中富里酸亚组分的分级提取方法，所述分级提取方法包括如下步骤：藻体预处理、藻体索氏提取、藻体氯化钙及酸洗、藻体碳酸钠处理、藻体碱液提取、分级富里酸亚组分粗品的浓缩。通过上述方式，本发明能够通过利用不同的溶液连续萃取技术从藻体中分级提取出富里酸亚组分溶液，富集和纯化后，最终得到分级的富里酸亚组分固体样品。
Description
技术领域
本发明涉及藻体分离提取技术领域，具体涉及一种藻体中富里酸亚组分的分级提取方法。
背景技术
富里酸是腐殖质的一个重要组分部分，它能溶于酸、碱和中性溶液，是水体、土壤有机质重要组成部分。富里酸的结构非常复杂，元素组成和化学结构随时空和来源而变化。富里酸在环境地球化学及全球生态系统中具有重要作用，前人对于海洋、河水、废水等各种来源富里酸的地球化学特征开展了广泛的研究，已经取得了一系列进展。一般认为：富里酸是由动植残体经过复杂的物理、化学及生物过程形成的大分子有机混合物，而对活体生物体，包括藻体中富里酸的研究较少。
为了更近一步的研究富里酸的结构和组成，前人将富里酸亚组分进行分级分离，从而减小其异质性，取得一系列成果。目前针对土壤富里酸亚组分的分级分离技术有一定的报道，土壤富里酸分离方法分为两个过程：（1）富里酸的提取过程：从土壤中提取富里酸；（2）富里酸亚组分分级过程：基于不同组成和结构富里酸亚组分与XAD—8的结合能力不同进行分离。例如Dai等首先将土壤富里酸吸附在XAD—8树脂上，然后利用三种不同pH有机缓冲液、水及乙醇淋洗树脂，得到5种富里酸亚组分分级样品（Dai, J., Ran, W., Xing, B., Gu, M. & Wang, L.
Characterization of fulvic acid fractions obtained by sequential extractions
with pH buffers, water, and ethanol from paddy soils. Geoderma 135, 284–295 (2006).）；Li等利用四种不同比例甲醇和盐酸溶液淋洗树脂，得到4种土壤富里酸亚组分分级样品（Li,
A., Hu, J., Li, W., Zhang,W. & Wang, X. Polarity based fractionation of
fulvic acids. Chemosphere. 77, 1419–1426
(2009).）；Bai等利用5种不同pH的焦磷酸钠缓冲溶液淋滤树脂，得到5种土壤富里酸亚组分分级样品（Bai Y., Wu F., Xing B., Meng W., Shi G., Ma Y. &
Giesy J. Isolation and Characterization of Chinese Standard Fulvic Acid
Sub-fractions Separated from Forest Soil by Stepwise Elution with Pyrophosphat.
Scientific Reports. 5, 8723 | DOI: 10.1038/srep08723(2015)）。但针对藻体富里酸的分级提取尚无报道。藻体中富里酸亚组分可能和藻体组分分为不同的结合形态和不同的结合强度。前人的富里酸亚组分分级过程与富里酸亚组分存在状态无关，不能反映富里酸亚组分的赋存状态和理化性质；也不能实现富里酸亚组分的提取过程和分级过程的统一。
本发明专利利用焦磷酸钠和氢氧化钠分别对富里酸亚组分进行多次分级提取，通过多次分离完成对藻体中的富里酸亚组分的充分提取，同时实现了富里酸亚组分分级过程与提取过程。
发明内容
为充分实现对藻体中的富里酸亚组分的分离富集，本发明公开了一种藻体中富里酸亚组分的分级提取方法，通过该方法，分级提取藻体中的富里酸亚组分，并制备了一系列分级提取的富里酸亚组分样品，以供后续研究使用。
本发明公开了一种藻体中富里酸亚组分的分级提取方法，所述分级提取方法包括如下步骤：
步骤a、藻体预处理：取风干后的藻体剔除杂物，在40-50oC温度条件下烘干，碾磨过筛，得到藻体粉末；
步骤b、藻体索氏提取:将藻体粉末置于索式提取器中，依次用乙醚、丙酮、95%乙醇、二氧杂环己烷和去离子水为提取液进行索氏提取，所得固体标记为索提藻体；
步骤c、藻体氯化钙及酸洗：用氯化钙溶液连续三次提取索提藻体，每次提取时均保持固液比为1：10，在40-60oC条件下连续搅拌15-40 min后，离心得到固体，标记为氯化钙处理藻体；
用盐酸溶液连续三次提取氯化钙处理藻体，每次提取时均保持固液比为1：10，连续搅拌10-30 min后，离心得到固体，标记为盐酸处理藻体；
向盐酸处理藻体中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10 -30min后，离心得到固体，标记为水洗盐酸处理藻体；
步骤d、藻体碳酸钠处理：用碳酸钠溶液连续三次提取水洗盐酸处理藻体，每次提取时均保持固液比为1：10，在30-45oC条件下连续搅拌30-50 min后，离心得到固体，标记为碳酸钠处理藻体；
向碳酸钠处理藻体中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10 -30 min后，离心得到固体，标记为水洗碳酸钠处理藻体；
步骤e、藻体碱液提取：
向水洗碳酸钠处理藻体中加入去离子水，使其固液比达到1:3，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH值=6.0～8.0，然后在氮气保护下，向溶液中加入焦磷酸钠溶液，使溶液中固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1 mol/L，然后将溶液连续搅拌4 -6h，静置20-28 h后，离心分离，得到上层清液1及焦磷酸钠提取藻体1；
在氮气保护下，向焦磷酸钠提取藻体1中加入焦磷酸钠溶液，使溶液中固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1 mol/L，然后将溶液连续搅拌4 -6h，静置20-28 h后，离心分离，得到上层清液2及焦磷酸钠提取藻体2；
在氮气保护下，向焦磷酸钠提取藻体2中加入焦磷酸钠溶液，使溶液中固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1 mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6 h，静置20-28 h后，离心分离，得到上层清液3及焦磷酸钠提取藻体3；
在氮气保护下，向焦磷酸钠提取藻体3中加入去离子水，使溶液中固液比达到1:5，用盐酸和氢氧化钠调节其pH值介于6.0～8.0之间，然后向溶液中加入氢氧化钠溶液，使溶液中固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1 mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6 h，静置20-28 h后，离心分离，得到上层清液4及氢氧化钠提取藻体1；
在氮气保护下，向氢氧化钠提取藻体1中加入氢氧化钠溶液，使溶液中固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1 mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6 h，静置20-28 h后，离心分离，得到上层清液5及氢氧化钠提取藻体2；
在氮气保护下，向氢氧化钠提取藻体2中加入氢氧化钠溶液，使溶液中固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1 mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6 h，静置20-28h后，离心分离，得到上层清液6及氢氧化钠提取藻体3；
步骤f：分级富里酸亚组分粗品的浓缩：
用盐酸将步骤e中的上层清液1-6，共计6份上清液分别调节至pH值等于1.0，然后分别加入氢氟酸，使每份酸化液中的氢氟酸浓度为0.3
mol/L时，再分别搅拌4-6 h，分别静置20-28
h，离心分离，得到六份上层清液，分别将其标记为无硅富里酸亚组分溶液1～无硅富里酸亚组分溶液6，共计6份无硅富里酸亚组分溶液；
将上述6份无硅富里酸亚组分溶液分别以15倍柱体积/h流速通过XAD—8树脂柱进行吸附；吸附完成后，用去离子水以15倍柱体积/h的流速分别淋洗每份无硅富里酸亚组分所吸附的XAD—8树脂柱，弃去流出液，然后再依次用1倍柱体积的0.1 mol/L氢氧化钠溶液和2倍柱体积的去离子水以3倍柱体积/h的流速淋洗每份无硅富里酸亚组分所吸附的XAD—8树脂柱，得到的流出液再通过氢离子饱和的氢型阳离子交换树脂交换，最终流出液分别标记为富里酸亚组分1～富里酸亚组分6，共计六份富里酸亚组分溶液；
将富里酸亚组分1～富里酸亚组分6溶液分别冷冻干燥，最终得到六份固体富里酸亚组分分级样品。优选的，所述步骤b中，当以其中一种提取液进行索氏提取时，则每隔5h，在220nm波长的紫外可见光下测定索提液的吸光度，当测得的索提液的吸光度大于或等于0.01时，则继续该索提过程；当测得的吸光度小于0.01时，更换下一个索提液进行索提。
优选的，所述分级提取方法还包括步骤g：富里酸亚组分分级样品纯度测定：取步骤f中的任一份富里酸亚组分分级样品，在700～750℃条件下灼烧5～6 h，测定其灰分含量；若该富里酸亚组分分级样品的灰分含量大于1.0%，则将其溶解后用盐酸调节至pH=1.0～3.0，然后按照步骤f重复操作，直到测得灰分小于1.0%。
优选的，所述步骤c中的氯化钙溶液的质量百分数为1%；盐酸的浓度为0.1 mol/L。
优选的，所述步骤d中的碳酸钠溶液的质量百分数为0.5%。
本发明中步骤b中，采用乙醚、丙酮、95%乙醇、二氧杂环己烷、去离子水提取液依次进行索氏提取，其目的是去除藻体中非腐殖物质；
本发明中步骤c中，用氯化钙处理索提藻体的目的是去除藻体中的多糖，酸洗目的是去除剩余氯化钙及部分金属离子；
本发明中步骤d中，碳酸钠溶液处理的目的是去除藻体中的藻酸；
本发明步骤f中加入氢氟酸的操作是：利用氢氟酸和硅酸盐及硅单质反应，生产四氟合硅气体，从而去除腐殖酸亚组分样品中的含硅杂质。并利用在pH=1.0的条件下，富里酸为可溶态而部分杂质（主要为腐殖酸）是沉淀的区别，在步骤f中去除腐殖酸等杂质。该除杂操作具有以下优点：（1）pH=1.0时，腐殖酸为沉淀，可通过离心分离去除；（2）pH=1.0时，富里酸可溶于溶液中，不会造成富里酸的损失。
本发明的有益效果是：本发明藻体中腐殖酸的分级提取方法能够克服现有技术对腐殖酸分级提取过程的不足，获得纯度较高的腐殖酸各级亚组分，便于对藻体的研究。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1：海洋褐藻藻样品中富里酸的分级提取：
于2014年6月份取黄海褐藻藻样品；
XAD-8树脂柱；Sigma公司；
氢氧化钠：分析纯；盐酸：分析纯；
本实施例的具体操作步骤如下：
步骤a、藻体预处理：
取风干后的藻体剔除杂物，在45oC温度条件下烘干，碾磨过40目筛，得到7 Kg 藻体粉末；
步骤b、藻体索氏提取：
将7 Kg藻体粉末置于索式提取器中，依次用乙醚、丙酮、95%乙醇、二氧杂环己烷和去离子水为提取液进行索氏提取，所得固体标记为索提藻体，得到6.74 Kg索提藻体；该步骤中，当以其中一种提取液进行索氏提取时，则每隔5 h，在220
nm波长的紫外可见光下测定索提液的吸光度，当测得的索提液的吸光度大于或等于0.01时，则继续该索提过程；当测得的吸光度小于0.01时，更换下一个索提液进行索提。
步骤c、藻体氯化钙及酸洗：
用质量百分数为1%的氯化钙溶液连续三次提取步骤b中得到的索提藻体，每次提取时均保持固液比为1：10，在60oC条件下连续搅拌15
min后，离心得到固体，标记为氯化钙处理藻体；
用0.1mol/L的盐酸溶液连续三次提取氯化钙处理藻体，每次提取时均保持固液比为1：10，每次均连续搅拌10 min，离心得到的固体，标记为盐酸处理藻体；
向盐酸处理藻体中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10 min后，离心得到6.1 Kg固体，标记为水洗盐酸处理藻体；
步骤d、藻体碳酸钠处理：
用质量百分数为0.5%的碳酸钠溶液连续三次提取水洗盐酸处理藻体，每次提取时均保持固液比为1：10，每次提取时均在45oC条件下连续搅拌30min；离心得到的固体，标记为碳酸钠处理藻体；
向碳酸钠处理藻体中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10 min后，离心得到5.4 Kg固体，标记为水洗碳酸钠处理藻体；
步骤e、藻体碱液提取：
向水洗碳酸钠处理藻体中加入去离子水，使其固液比达到1:3，用6 mol/L的盐酸和6 mol/L的氢氧化钠调节溶液pH值=6.0～8.0，然后在氮气保护下，向溶液中加入0.2
mol/L的焦磷酸钠溶液并稀释，使溶液中固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1 mol/L，然后将溶液连续搅拌4 h，静置24 h后，离心分离，得到上层清液1及焦磷酸钠提取藻体1；
在氮气保护下，向焦磷酸钠提取藻体1中加入0.2
mol/L的焦磷酸钠溶液并稀释，使溶液中固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1 mol/L，然后将溶液连续搅拌4 h，静置24 h后，离心分离，得到上层清液2及焦磷酸钠提取藻体2；
在氮气保护下，向焦磷酸钠提取藻体2中加入0.2
mol/L的焦磷酸钠溶液并稀释，使溶液中固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1 mol/L，然后将溶液连续搅拌4 h，静置24h后，离心分离，得到上层清液3及焦磷酸钠提取藻体3；
在氮气保护下，向焦磷酸钠提取藻体中3加入去离子水，使溶液中固液比达到1:5，用6
mol/L的盐酸和6 mol/L的氢氧化钠调节其pH值介于6.0～8.0之间，然后向溶液中加入0.3 mol/L的氢氧化钠溶液并稀释，使溶液中固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1 mol/L，然后将溶液连续搅拌4 h，静置24 h后，离心分离，得到上层清液4及氢氧化钠提取藻体1；
在氮气保护下，向氢氧化钠提取藻体1中加入0.2
mol/L的氢氧化钠溶液，使溶液中固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1 mol/L，然后将溶液连续搅拌4 h，静置24 h后，离心分离，得到上层清液5及氢氧化钠提取藻体2；
在氮气保护下，向氢氧化钠提取藻体2中加入0.2
mol/L的氢氧化钠溶液，使溶液中固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1 mol/L，然后将溶液连续搅拌4 h，静置24 h后，离心分离，得到上层清液6及氢氧化钠提取藻体3；
步骤f：分级富里酸亚组分粗品的浓缩：
用6 mol/L的盐酸将步骤e中的上层清液1-6，共计6份上清液分别调节至pH值等于1.0，然后分别加入10 mol/L的氢氟酸，使每份酸化液中的氢氟酸浓度为0.3
mol/L时，再分别搅拌4 h，分别静置24 h，离心分离，得到六份上层清液，分别将其标记为无硅富里酸亚组分溶液1～无硅富里酸亚组分溶液6，共计6份无硅富里酸亚组分溶液；
将上述6份无硅富里酸亚组分溶液分别以15倍柱体积/h流速通过XAD—8树脂柱进行吸附；吸附完成后，用去离子水以15倍柱体积/h的流速分别淋洗每份无硅富里酸亚组分所吸附的XAD—8树脂柱，弃去流出液，然后再依次用1倍柱体积的0.1 mol/L氢氧化钠溶液和2倍柱体积的去离子水以3倍柱体积/h的流速淋洗每份无硅富里酸亚组分所吸附的XAD—8树脂柱，得到的流出液再通过氢离子饱和的氢型阳离子交换树脂交换，最终流出液分别标记为富里酸亚组分1～富里酸亚组分6，共计六份富里酸亚组分溶液；
将富里酸亚组分1～富里酸亚组分6溶液分别冷冻干燥，最终得到六份固体富里酸亚组分分级样品。
本实施例中，最终得到份固体富里酸亚组分分级样品质量依次为18.5g、8.1g、2.1g、 4.7g、1.4g、1.0g。
结合富里酸自身特点，利用元素分析法和13C-NMR光谱分析法对富里酸亚组分进行定量-半定量分析；利用FTIR、UV-Vis和三维荧光光谱对富里酸亚组分进行定性分析，结果如下：
元素分析结果显示，该方法提取的褐藻富里酸亚组分中碳、氢、氧、硫元素含量及碳氢元素比、碳氧元素比，符合国际腐殖酸协会标准富里酸元素含量要求。FTIR光谱分析显示，该方法提取的褐藻富里酸亚组分均包含羟基、烷基和羧基等官能团，这与国际腐殖酸协会标准富里酸红外光谱结论一致。UV-Vis光谱分析显示，该方法提取的褐藻富里酸亚组分紫外吸光度均随着紫外波长增大而降低，紫外光谱符合指数递减规律，这与国际腐殖酸协会标准富里酸紫外光谱结论一致。13C-NMR光谱分析显示，该方法提取的褐藻富里酸亚组分均包含饱和脂肪碳峰、烷氧基碳、芳香碳、羧基碳，这与国际腐殖酸协会标准富里酸一致。三维荧光光谱分析显示，该方法提取的褐藻富里酸亚组分的三维荧光光谱峰均坐落于褐藻类富里酸荧光峰范围，与国际腐殖酸协会标准富里酸一致。
进一步分析表明：该方法提取的不同富里酸亚组分中的氢碳元素比存在明显变化，富里酸亚组分1-6的氢碳元素比分别为0.77、0.90、0.99、1.04、1.08、1.17；
13C-NMR光谱分析结果显示，该方法提取的不同富里酸亚组分中的羧基碳比例存在明显变化，富里酸亚组分1-6的羧基碳比例为27.0、24.2、21.5、18.3、18.0、17.7；
该方法提取的不同富里酸亚组分中的芳香碳含量存在明显变化，富里酸亚组分1-6的芳香碳比例为25.6、28.9、33.1、30.7、26.9、25.1。
实施例2：本实施例公开了一种藻体中富里酸亚组分的分级提取方法，所述分级提取方法包括如下步骤：
步骤a、藻体预处理：取风干后的藻体剔除杂物，在40-50oC温度条件下烘干，碾磨过筛，得到藻体粉末；
步骤b、藻体索氏提取：将藻体粉末置于索式提取器中，依次用乙醚、丙酮、95%乙醇、二氧杂环己烷和去离子水为提取液进行索氏提取，所得固体标记为索提藻体；
步骤c、藻体氯化钙及酸洗：用氯化钙溶液连续三次提取索提藻体，每次提取时均保持固液比为1：10，在40-60oC条件下连续搅拌15-40 min后，离心得到固体，标记为氯化钙处理藻体；用盐酸溶液连续三次提取氯化钙处理藻体，每次提取时均保持固液比为1：10，每次均连续搅拌10-30 min后，离心得到的固体，标记为盐酸处理藻体；向盐酸处理藻体中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10 -30min后，离心得到固体，标记为水洗盐酸处理藻体；
步骤d、藻体碳酸钠处理：用碳酸钠溶液连续三次提取水洗盐酸处理藻体，每次提取时均保持固液比为1：10，每次提取时均在30-45oC条件下连续搅拌30-50 min；离心得到的固体，标记为碳酸钠处理藻体；向碳酸钠处理藻体中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10 -30 min后，离心得到固体，标记为水洗碳酸钠处理藻体；
步骤e、藻体碱液提取：向水洗碳酸钠处理藻体中加入去离子水，使其固液比达到1:3，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH值=6.0～8.0，然后在氮气保护下，向溶液中加入焦磷酸钠溶液，使溶液中固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1 mol/L，然后将溶液连续搅拌4 -6h，静置20-28 h后，离心分离，得到上层清液1及焦磷酸钠提取藻体1；
在氮气保护下，向焦磷酸钠提取藻体1中加入焦磷酸钠溶液，使溶液中固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1 mol/L，然后将溶液连续搅拌4 -6h，静置20-28 h后，离心分离，得到上层清液2及焦磷酸钠提取藻体2；
在氮气保护下，向焦磷酸钠提取藻体2中加入焦磷酸钠溶液，使溶液中固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1 mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6 h，静置20-28 h后，离心分离，得到上层清液3及焦磷酸钠提取藻体3；
在氮气保护下，向焦磷酸钠提取藻体3中加入去离子水，使溶液中固液比达到1:5，用盐酸和氢氧化钠调节其pH值介于6.0～8.0之间，然后向溶液中加入氢氧化钠溶液，使溶液中固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1 mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6 h，静置20-28 h后，离心分离，得到上层清液4及氢氧化钠提取藻体1；
在氮气保护下，向氢氧化钠提取藻体1中加入氢氧化钠溶液，使溶液中固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1 mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6 h，静置20-28 h后，离心分离，得到上层清液5及氢氧化钠提取藻体2；
在氮气保护下，向氢氧化钠提取藻体2中加入氢氧化钠溶液，使溶液中固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1 mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6 h，静置20-28h后，离心分离，得到上层清液6及氢氧化钠提取藻体3；
步骤f：分级富里酸亚组分粗品的浓缩：
用盐酸将步骤e中的上层清液1-6，共计6份上层清液分别调节至pH值等于1.0，然后分别加入氢氟酸，使每份酸化液中的氢氟酸浓度为0.3
mol/L时，再分别搅拌4-6 h，分别静置20-28
h，离心分离，得到六份上层清液，分别将其标记为无硅富里酸亚组分溶液1～无硅富里酸亚组分溶液6，共计6份无硅富里酸亚组分溶液；
将上述6份无硅富里酸亚组分溶液分别以15倍柱体积/h流速通过XAD—8树脂柱进行吸附；吸附完成后，用去离子水以15倍柱体积/h的流速分别淋洗每份无硅富里酸亚组分所吸附的XAD—8树脂柱，弃去流出液，然后再依次用1倍柱体积的0.1 mol/L氢氧化钠溶液和2倍柱体积的去离子水以3倍柱体积/h的流速淋洗每份无硅富里酸亚组分所吸附的XAD—8树脂柱，得到的流出液再通过氢离子饱和的氢型阳离子交换树脂交换，最终流出液分别标记为富里酸亚组分1～富里酸亚组分6，共计六份富里酸亚组分溶液；
将富里酸亚组分1～富里酸亚组分6溶液分别冷冻干燥，最终得到六份固体富里酸亚组分分级样品。
实施例3：本实施例与实施例2的不同之处在于，本实施例步骤b中，当以其中一种提取液进行索氏提取时，则每隔5h，在220nm波长的紫外可见光下测定索提液的吸光度，当测得的索提液的吸光度大于或等于0.01时，则继续该索提过程；当测得的吸光度小于0.01时，更换下一个索提液进行索提。
实施例4：本实施例与实施例2的不同之处在于，本实施例还包括步骤g：富里酸亚组分分级样品纯度测定：取步骤f中的任一份富里酸亚组分分级样品，在700～750℃条件下灼烧5～6 h，测定其灰分含量；若该富里酸亚组分分级样品的灰分含量大于1.0%，则将其溶解后用盐酸调节至pH=1.0～3.0，然后按照步骤f重复操作，直到测得灰分小于1.0%。
实施例5：本实施例与实施例2的不同之处在于，本实施例所述步骤c中的碳酸钠溶液的质量百分数为1%；盐酸的浓度为0.1 mol/L。所述步骤d中的碳酸钠溶液的质量百分数为0.5%。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (5)
1.一种藻体中富里酸亚组分的分级提取方法，其特征在于，所述分级提取方法包括如下步骤：
步骤a、藻体预处理：
取风干后的藻体剔除杂物，在40-50oC温度条件下烘干，碾磨过筛，得到藻体粉末；
步骤b、藻体索氏提取：
将藻体粉末置于索式提取器中，依次用乙醚、丙酮、95%乙醇、二氧杂环己烷和去离子水为提取液进行索氏提取，所得固体标记为索提藻体；
步骤c、藻体氯化钙及酸洗：
用氯化钙溶液连续三次提取索提藻体，每次提取时均保持固液比为1：10，在40-60oC条件下连续搅拌15-40min后，离心得到固体，标记为氯化钙处理藻体；
用盐酸溶液连续三次提取氯化钙处理藻体，每次提取时均保持固液比为1：10，每次均连续搅拌10-30min后，离心得到的固体，标记为盐酸处理藻体；
向盐酸处理藻体中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10-30min后，离心得到固体，标记为水洗盐酸处理藻体；
步骤d、藻体碳酸钠处理：
用碳酸钠溶液连续三次提取水洗盐酸处理藻体，每次提取时均保持固液比为1：10，每次提取时均在30-45oC条件下连续搅拌30-50min；离心得到的固体，标记为碳酸钠处理藻体；
向碳酸钠处理藻体中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10-30min后，离心得到固体，标记为水洗碳酸钠处理藻体；
步骤e、藻体碱液提取：
向水洗碳酸钠处理藻体中加入去离子水，使其固液比达到1:3，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH值=6.0～8.0，然后在氮气保护下，向溶液中加入焦磷酸钠溶液，使溶液中固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6h，静置20-28h后，离心分离，得到上层清液1及焦磷酸钠提取藻体1；
在氮气保护下，向焦磷酸钠提取藻体1中加入焦磷酸钠溶液，使溶液中固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6h，静置20-28h后，离心分离，得到上层清液2及焦磷酸钠提取藻体2；
在氮气保护下，向焦磷酸钠提取藻体2中加入焦磷酸钠溶液，使溶液中固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6h，静置20-28h后，离心分离，得到上层清液3及焦磷酸钠提取藻体3；
在氮气保护下，向焦磷酸钠提取藻体3中加入去离子水，使溶液中固液比达到1:5，用盐酸和氢氧化钠调节其pH值介于6.0～8.0之间，然后向溶液中加入氢氧化钠溶液，使溶液中固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6h，静置20-28h后，离心分离，得到上层清液4及氢氧化钠提取藻体1；
在氮气保护下，向氢氧化钠提取藻体1中加入氢氧化钠溶液，使溶液中固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6h，静置20-28h后，离心分离，得到上层清液5及氢氧化钠提取藻体2；
在氮气保护下，向氢氧化钠提取藻体2中加入氢氧化钠溶液，使溶液中固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6h，静置20-28h后，离心分离，得到上层清液6及氢氧化钠提取藻体3；
步骤f：分级富里酸亚组分粗品的浓缩：
用盐酸将步骤e中的上层清液1-6，共计6份上层清液分别调节至pH值等于1.0，然后分别加入氢氟酸，使每份酸化液中的氢氟酸浓度为0.3mol/L时，再分别搅拌4-6h，分别静置20-28h，离心分离，得到六份上层清液，分别将其标记为无硅富里酸亚组分溶液1～无硅富里酸亚组分溶液6，共计6份无硅富里酸亚组分溶液；
将上述6份无硅富里酸亚组分溶液分别以15倍柱体积/h流速通过XAD—8树脂柱进行吸附；吸附完成后，用去离子水以15倍柱体积/h的流速分别淋洗每份无硅富里酸亚组分所吸附的XAD—8树脂柱，弃去流出液，然后再依次用1倍柱体积的0.1mol/L氢氧化钠溶液和2倍柱体积的去离子水以3倍柱体积/h的流速淋洗每份无硅富里酸亚组分所吸附的XAD—8树脂柱，得到的流出液再通过氢离子饱和的氢型阳离子交换树脂交换，最终流出液分别标记为富里酸亚组分1～富里酸亚组分6，共计六份富里酸亚组分溶液；
将富里酸亚组分1～富里酸亚组分6溶液分别冷冻干燥，最终得到六份固体富里酸亚组分分级样品。
2.根据权利要求1所述的一种藻体中富里酸亚组分的分级提取方法，其特征在于，所述步骤b中，当以其中一种提取液进行索氏提取时，则每隔5h，在220nm波长的紫外可见光下测定索提液的吸光度，当测得的索提液的吸光度大于或等于0.01时，则继续该索氏提取过程；当测得的吸光度小于0.01时，更换下一个索提液进行索氏提取。
3.根据权利要求1所述的一种藻体中富里酸亚组分的分级提取方法，其特征在于，所述分级提取方法还包括步骤g：富里酸亚组分分级样品纯度测定：取步骤f中的任一份富里酸亚组分分级样品，在700～750℃条件下灼烧5～6h，测定其灰分含量；若该富里酸亚组分分级样品的灰分含量大于1.0%，则将其溶解后用盐酸调节至pH=1.0～3.0，然后按照步骤f重复操作，直到测得灰分小于1.0%。
4.根据权利要求1所述的一种藻体中富里酸亚组分的分级提取方法，其特征在于，所述步骤c中的碳酸钠溶液的质量百分数为1%；盐酸的浓度为0.1mol/L。
5.根据权利要求1所述的一种藻体中富里酸亚组分的分级提取方法，其特征在于，所述步骤d中的碳酸钠溶液的质量百分数为0.5%。
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