CN105085935A - 藻体富里酸的xad-8树脂分级方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了藻体富里酸的XAD-8树脂分级方法，所述方法包括如下步骤：藻体预处理、藻体索氏提取、藻体的氯化钙处理、藻体的碳酸钠处理、藻体的碱液提取、藻体中富里酸的树脂吸附、富里酸亚组分分级淋洗、富里酸亚组分样品的纯化。通过上述方式，本发明能够从藻体中提取富里酸，并利用XAD-8树脂分离技术进行亚组分分级分离，最终得到分级的藻体富里酸亚组分。
Description
技术领域
本发明涉及富里酸的提取及树脂分级方法，具体涉及藻体富里酸的XAD-8树脂分级方法。
背景技术
腐殖质或腐殖物质可以分为富里酸和腐殖酸。其中富里酸（fulvicacid）是一种天然大分子有机混合物，它广泛存在于土壤、水体、沉积物等环境介质中。富里酸能溶于酸、碱和中性溶液。富里酸中含有大量活性官能团如羧基、酚羟基、羰基、氨基和巯基，从而具有很高的反应活性。例如在天然环境中，能与环境中的有毒重金属离子和有机污染物（如农药，PPCPs和PAHs）发生相互作用，从而改变污染物迁移、转化规律和生物有效性。
一般认为，富里酸来自于动植物残体的物理、化学和生物降解，但大量研究表明海洋藻体中含有大量富里酸。活体中，特别是藻体中富里酸的提取对研究水体中富里酸来源和归趋具有重要意义。现代仪器分析技术的发展，为富里酸的研究提供了先进的手段，取得大量突破性创新。人们已经熟知富里酸的元素含量、红外特征、紫外特征等基本理化性质。但是由于富里酸的组成和结构极其复杂，它的元素组成、分子量、芳香度及官能团含量等结构随着时空不同而发生变化。为了更近一步的研究富里酸的结构和组成，前人将富里酸进行分级分离，从而减小其异质性，取得一些列成果。然而，藻体富里酸的分级分离尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供藻体富里酸的XAD-8树脂分级方法，该方法能够克服现有技术对藻体富里酸分级提取过程的不足，获得富里酸各级亚组分。
本发明中公开了藻体富里酸的XAD-8树脂分级方法，包括如下步骤：
步骤a、藻体预处理：
取风干后的藻体剔除杂物，在30-50oC条件下烘干20-28h，碾磨过筛，得到藻体粉末；
步骤b、藻体索氏提取：
将藻体粉末置于索式提取器中，用乙醚为提取液进行索氏提取，所得固体标记为乙醚索提藻体；
将乙醇索提藻体置于索式提取器中，用丙酮为提取液进行索氏提取，所得固体标记为丙酮索提藻体；
将丙酮索提藻体置于索式提取器中，用95%乙醇为提取液进行索氏提取，所得固体标记为乙醇索提藻体；
将乙醇索提藻体置于索式提取器中，用二氧杂环己烷为提取液进行索氏提取，所得固体标记为二氧杂环己烷索提藻体；
将二氧杂环己烷索提藻体置于索式提取器中，用去离子水为提取液进行索氏提取，所得固体标记为去离子水索提藻体；
步骤c、藻体的氯化钙处理：
向去离子水索提藻体中加入氯化钙溶液，使固液比达到1：10，在50-70oC条件下连续搅拌15-30min，离心分离后弃去上层清液，得到氯化钙处理藻体1；
向氯化钙处理藻体1中加入氯化钙溶液，使固液比达到1：10，在50-70oC条件下连续搅拌15-30min后，离心分离后弃去上层清液，得到氯化钙处理藻体2；
向氯化钙处理藻体2中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10-30min后，离心分离后弃去上层清液，得到去离子水处理藻体；
向去离子水处理藻体中加入盐酸，使固液比达到1：10，连续搅拌10-30min后，离心分离后弃去上层清液，得到盐酸处理藻体1；
向盐酸处理藻体1中加入盐酸，使固液比达到1：10，连续搅拌10-30min后，离心分离后弃去上层清液，得到盐酸处理藻体2；
向盐酸处理藻体2中加入盐酸，使固液比达到1：10，连续搅拌10-30min后，离心分离后弃去上层清液，得到盐酸处理藻体3；
向盐酸处理藻体3中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10-30min后，离心分离后弃去上层清液，得到水洗盐酸处理藻体；
步骤d、藻体的碳酸钠处理：
向水洗盐酸处理藻体中加入碳酸钠溶液，使固液比达到1：10，在30-45oC条件下连续搅拌30-60min后，离心所得固体标记为碳酸钠处理藻体1；
向碳酸钠处理藻体1中加入碳酸钠溶液，使固液比达到1：10，在30-45oC条件下连续搅拌30-60min后，离心所得固体标记为碳酸钠处理藻体2；
向碳酸钠处理藻体2中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10-30min后，离心所得固体标记为水洗碳酸钠处理藻体；
步骤e、藻体的碱液提取：
氮气保护条件下，向水洗碳酸钠处理藻体中加入氢氧化钠和焦磷酸钠，并用去离子水稀释，使氢氧化钠和焦磷酸钠浓度均为0.1mol/L且固液比为1:10，搅拌4-6h，静置20-28h后，离心得到上层清液1和藻体残渣1；
氮气保护条件下，向上层清液1中加入盐酸，使其pH=1.0-3.0，搅拌30-60min，静置20-28h后，离心得上层清液标记为富里酸1；
氮气保护条件下，向藻体残渣1中加入氢氧化钠和焦磷酸钠，并用去离子水稀释，使氢氧化钠和焦磷酸钠浓度均为0.1mol/L且固液比为1:10，搅拌4-6h，静置20-28h后，离心得到上层清液2和藻体残渣2；
氮气保护条件下，向上层清液2中加入盐酸，使其pH=1.0-3.0，搅拌30-60min，静置20-28h后，离心得上清液标记为富里酸2；
将富里酸1和富里酸2合并，标记为粗提富里酸溶液；
步骤f：藻体富里酸的树脂吸附：
将粗提富里酸溶液以10-15倍柱体积/h的流速通过XAD-8树脂柱，弃去流出液；
步骤g：富里酸亚组分分级淋洗：
用pH=2的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度，淋洗步骤f中的XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当测得流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=2的焦磷酸钠缓冲液的淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4-6h后，静置20-28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分1；
然后用pH=3的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4-6h后，静置20-28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分2；
然后用pH=4的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=4的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4-6h后，静置20-28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分3；
然后，用pH=5的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4-6h后，静置20-28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分4；
然后用pH=6的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=6的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4-6h后，静置20-28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分5；
然后用pH=7的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4-6h后，静置20-28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分6；
然后在氮气保护条件下，用pH=8的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当测得流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=8的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4-6h后，静置20-28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分7；
然后在氮气保护条件下，用pH=9的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2-50mL流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当测得流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4-6h后，静置20-28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分8；
然后在氮气保护条件下，用pH=10的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=10的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4-6h后，静置20-28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分9；
然后在氮气保护条件下，用pH=11的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当测得流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4-6h后，静置20-28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分10；
然后在氮气保护条件下，用pH=12的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=12的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到上清液，标记为粗提富里酸亚组分11；
然后在氮气保护条件下，用pH=13的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当测得流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到上清液，标记为粗提富里酸亚组分12；
步骤h：富里酸亚组分样品的纯化：
将上述12份粗提富里酸亚组分分别加入氢氟酸，当每份酸化液中的氢氟酸浓度为0.3mol/L时，将其静置20-28h，然后分别标记为无硅溶液1～无硅溶液12，共计12份无硅溶液；
将上述12份无硅溶液分别以5倍柱体积/h流速通过XAD—8树脂柱进行吸附；
吸附完成后，分别用0.65倍柱体积去离子水以15倍柱体积/h的流速淋洗每份无硅溶液对应的XAD—8树脂柱，弃去流出液，再依次用1倍柱体积0.1mol/L氢氧化钠溶液和2倍柱体积去离子水分别以3倍柱体积/h的流速淋洗XAD—8树脂柱，流出液通过氢离子饱和的氢型阳离子交换树脂交换最终得到的流出液分别标记为富里酸亚组分1～富里酸亚组分12，共计12份富里酸亚组分溶液；
将富里酸亚组分1～富里酸亚组分溶液12分别冷冻干燥，最终得到12份固体富里酸亚组分分级样品。
优选的，所述步骤b中，将藻体粉末置于索式提取器中，依次用乙醚、丙酮、95%乙醇、二氧杂环己烷作为提取液进行索提；索提过程中，当采用其中一种索提液索提时，则每隔5h，在220nm波长的紫外可见光下测定索提液的吸光度，当测得的索提液的吸光度大于或等于0.01时，则继续该索提过程；当测得的吸光度小于0.01时，更换下一个索提液进行索提。
优选的，所述分级提取方法还包括步骤i：取步骤h所得的12份固体富里酸亚组分分级样品，分别在80-100℃下烘干24h后，测定所得灰分；如果其中某份富里酸亚组分以干重计灰分大于0.1%，则将该富里酸亚组分，加入去离子水使富里酸溶液浓度=1—3g/L后，加入浓盐酸和去离子水，使固液比为1:10且盐酸浓度为0.1mol/L后重复操作步骤h，直到测得的灰分小于或等于0.1%。
本发明中步骤b中，用乙醚、丙酮、95%乙醇、二氧杂环己烷、去离子水作为提取液依次对藻体进行索氏提取，其目的是去除藻体中非腐殖物质。
本发明中步骤c中，用氯化钙溶液处理的目的是去除藻体中的多糖，用盐酸酸洗的目的是去除剩余氯化钙及部分金属离子。
本发明中步骤d中，用碳酸钠溶液处理的目的是去除藻体中的藻酸。
本发明中步骤e中，利用焦磷酸钠和氢氧化钠混合提取藻体中富里酸，与单一氢氧化钠或焦磷酸钠方法相比提取速度更快、效率更高；通过两次连续焦磷酸钠和氢氧化钠混合提取从而实现对藻体中富里酸的完全提取；
本发明步骤h中加入氢氟酸的操作是：利用氢氟酸和硅酸盐及硅单质反应生产四氟合硅气体的性质，从而去除富里酸亚组分样品中的含硅杂质。
本发明步骤e和步骤g中，利用在pH=1.0的条件下富里酸为可溶状态，而腐殖酸等杂质为沉淀状态的区别，在步骤e和g中进行离心去除腐殖酸；这种除杂方法具有以下优点：pH=1.0时，富里酸可溶，通过离心分离去除部分腐殖酸酸，不会损失富里酸；
本发明的有益效果是：本发明藻体中富里酸提取及树脂分级方法能够克服现有技术对富里酸分级提取过程的不足，获得纯度较高的富里酸各级亚组分，便于对藻体的研究。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1：海洋褐藻样品中富里酸的分级提取：
于2015年6月份取渤海海域褐藻样品；
XAD-8树脂柱；Sigma公司；
氢氧化钠：分析纯；盐酸：分析纯；
本实施例中，具体操作如下：
步骤a、藻体预处理：
取风干后的藻体剔除杂物，在40oC条件下烘干24h，碾磨过40目筛，得到5Kg藻体粉末；
步骤b、藻体索氏提取：
将藻体粉末置于索式提取器中，用乙醚为提取液进行索氏提取，所得固体标记为乙醚索提藻体；
将乙醇索提藻体置于索式提取器中，用丙酮为提取液进行索氏提取，所得固体标记为丙酮索提藻体；
将丙酮索提藻体置于索式提取器中，用95%乙醇为提取液进行索氏提取，所得固体标记为乙醇索提藻体；
将乙醇索提藻体置于索式提取器中，用二氧杂环己烷为提取液进行索氏提取，所得固体标记为二氧杂环己烷索提藻体；
将二氧杂环己烷索提藻体置于索式提取器中，用去离子水为提取液进行索氏提取，得到4.77Kg固体，标记为去离子水索提藻体；
该索提过程中，当采用乙醚作为索提液索提时，则每隔5h，在220nm波长的紫外可见光下测定乙醚索提液的吸光度，当测得的乙醚索提液的吸光度大于或等于0.01时，则继续乙醚索提过程；当测得的吸光度小于0.01时，更换下一个索提液丙酮进行索提；依次类推，依次用乙醚、丙酮、95%乙醇、二氧杂环己烷、去离子水作为索提液索提。
步骤c、藻体的氯化钙处理：
向4.77Kg去离子水索提藻体中加入质量百分数为1%的氯化钙溶液，使固液比达到1：10，在60oC条件下连续搅拌15min，离心分离后弃去上层清液，得到氯化钙处理藻体1；
向氯化钙处理藻体1中加入质量百分数为1%的氯化钙溶液，使固液比达到1：10，在60oC条件下连续搅拌15min后，离心分离后弃去上层清液，得到氯化钙处理藻体2；
向氯化钙处理藻体2中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10min后，离心分离后弃去上层清液，得到去离子水处理藻体；
向去离子水处理藻体中加入0.1mol/L盐酸，使固液比达到1：10，连续搅拌10min后，离心分离后弃去上层清液，得到盐酸处理藻体1；
向盐酸处理藻体1中加入0.1mol/L盐酸，使固液比达到1：10，连续搅拌10min后，离心分离后弃去上层清液，得到盐酸处理藻体2；
向盐酸处理藻体2中加入0.1mol/L盐酸，使固液比达到1：10，连续搅拌10min后，离心分离后弃去上层清液，得到盐酸处理藻体3；
向盐酸处理藻体3中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10min后，离心分离后弃去上层清液，得到4.5Kg水洗盐酸处理藻体；
步骤d、藻体的碳酸钠处理：
向水洗盐酸处理藻体中加入质量百分数为0.5%的碳酸钠溶液，使固液比达到1：10，在45oC条件下连续搅拌30min后，离心所得固体标记为碳酸钠处理藻体1；
向碳酸钠处理藻体1中加入质量百分数为0.5%的碳酸钠溶液，使固液比达到1：10，在45oC条件下连续搅拌30min后，离心所得固体标记为碳酸钠处理藻体2；
向碳酸钠处理藻体2中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10min后，离心分离得到4.3Kg固体，标记为水洗碳酸钠处理藻体；
步骤e、藻体的碱液提取：
氮气保护条件下，向水洗碳酸钠处理藻体中加入0.2mol/L氢氧化钠和0.2mol/L焦磷酸钠，并用去离子水稀释，使溶液中氢氧化钠和焦磷酸钠浓度均为0.1mol/L且固液比为1:10，搅拌4h，静置24h后，离心得到上层清液1和藻体残渣1；
氮气保护条件下，向上层清液1中加入6mol/L盐酸，使其pH=1.0，搅拌30min，静置24h后，离心得上层清液标记为富里酸1；
氮气保护条件下，向藻体残渣1中加入0.2mol/L氢氧化钠和0.2mol/L焦磷酸钠，并用去离子水稀释，使溶液中氢氧化钠和焦磷酸钠浓度均为0.1mol/L且固液比为1:10，搅拌4h，静置24h后，离心得到上层清液2和藻体残渣2；
氮气保护条件下，向上层清液2中加入6mol/L盐酸，使其pH=1.0，搅拌30min，静置24h后，离心得上清液标记为富里酸2；
将富里酸1和富里酸2合并，标记为粗提富里酸溶液，共计81L；
步骤f：藻体中富里酸的树脂吸附：
将81L粗提富里酸溶液以10倍柱体积/h的流速通过XAD-8树脂柱，弃去流出液；
步骤g：富里酸亚组分分级淋洗：
用pH=2的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5倍柱体积/h的速度，淋洗步骤f中的XAD-8树脂柱，每收集25ml流出液，用紫外分光光度计在450nm波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当测得流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=2的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分1；
然后用pH=3的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集25ml流出液，用紫外分光光度计在450nm波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分2；
然后用pH=4的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集25ml流出液，用紫外分光光度计在450nm波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=4的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分3；
然后，用pH=5的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5倍柱体积/h的速度淋洗树脂柱，每收集25ml流出液，用紫外分光光度计在450nm波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=5的焦磷酸钠缓冲液的淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分4；
然后用pH=6的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集25ml流出液，用紫外分光光度计在450nm波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=6的焦磷酸钠缓冲液的淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分5；
然后用pH=7的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集25ml流出液，用紫外分光光度计在450nm波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分6；
然后在氮气保护条件下，用pH=8的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集25ml流出液，用紫外分光光度计在450nm波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=8的焦磷酸钠缓冲液的淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分7；
然后在氮气保护条件下，用pH=9的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集25mL流出液，用紫外分光光度计在450nm波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分8；
然后在氮气保护条件下，用pH=10的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集25ml流出液，用紫外分光光度计在450nm波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=10的焦磷酸钠缓冲液的淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分9；
然后在氮气保护条件下，用pH=11的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集25-ml流出液，用紫外分光光度计在450nm波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液的吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分10；
然后在氮气保护条件下，用pH=12的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集25ml流出液，用紫外分光光度计在450nm波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=12的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到上清液，标记为粗提富里酸亚组分11；
然后在氮气保护条件下，用pH=13的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用450nm波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到上清液，标记为粗提富里酸亚组分12；
步骤h：富里酸亚组分样品的纯化：
将上述12份粗提富里酸亚组分分别加入6mol/L氢氟酸，当每份酸化液中的氢氟酸浓度为0.3mol/L时，将其静置24h，然后分别标记为无硅溶液1～无硅溶液12，共计12份无硅溶液；
将上述12份无硅溶液分别以5倍柱体积/h流速通过XAD—8树脂柱进行吸附；
吸附完成后，分别用0.65倍柱体积去离子水以15倍柱体积/h的流速淋洗每份无硅溶液对应的XAD—8树脂柱，弃去流出液，再依次用1倍柱体积0.1mol/L氢氧化钠溶液和2倍柱体积去离子水以3倍柱体积/h的流速淋洗每份无硅溶液对应的XAD—8树脂柱，将流出液通过氢离子饱和的氢型阳离子交换树脂交换，最终得到的流出液分别标记为富里酸亚组分1～富里酸亚组分12，共计12份富里酸亚组分溶液；
将富里酸亚组分1～富里酸亚组分溶液12分别冷冻干燥，最终得到12份固体富里酸亚组分分级样品；
步骤i：灰分测定：取步骤h所得的12份固体富里酸亚组分分级样品，分别在100℃下烘干24h后，测定所得灰分；如果其中某份富里酸亚组分以干重计灰分大于0.1%，则将该富里酸亚组分，加入去离子水使溶液富里酸浓度=1g/L后，加入浓盐酸和去离子水，使溶液中固液比为1:10且盐酸浓度为0.1mol/L后重复操作步骤h，直到测得的灰分小于或等于0.1%。
本实施例中，最终得到藻体富里酸亚组分1---藻体富里酸亚组分12质量依次为158.5g、126.5g、103.8g、71.7g、4.58g、25.35g、17.09g、10.5g、6.5g、3.8g、1.17g、0.58g。
结合富里酸自身特点，利用元素分析法和13C-NMR光谱分析法对富里酸亚组分进行定量-半定量分析；利用FTIR、UV-Vis和三维荧光光谱对富里酸亚组分进行定性分析，结果如下：
元素分析结果显示，该方法提取的褐藻富里酸亚组分中碳、氢、氧、硫元素含量及碳氢元素比、碳氧元素比，符合国际腐殖酸协会要求。FTIR光谱分析显示，该方法提取的褐藻富里酸亚组分均包含羟基、烷基和羧基等官能团，这与国际腐殖酸协会结论一致。UV-Vis光谱分析显示，该方法提取的褐藻富里酸亚组分紫外吸光度均随着紫外波长增大而降低，紫外光谱符合指数递减规律，这与国际腐殖酸协会标准富里酸紫外光谱结论一致。13C-NMR光谱分析显示，该方法提取的褐藻富里酸亚组分均包含饱和脂肪碳峰、烷氧基碳、芳香碳、羧基碳，这与国际腐殖酸协会标准富里酸一致。三维荧光光谱分析显示，该方法提取的褐藻富里酸亚组分的三维荧光光谱峰均坐落于褐藻类富里酸荧光峰范围，与国际腐殖酸协会标准富里酸一致。
进一步分析表明：该方法提取的不同富里酸亚组分中的氢碳元素比存在明显变化，富里酸亚组分1-12的氢碳元素比分别为0.77、0.78、0.79、0.84、0.97、1.04、1.07、1.09、1.17、1.19、1.22、1.23；
13C-NMR光谱分析结果显示，该方法提取的不同富里酸亚组分中的羧基碳比例存在明显变化，富里酸亚组分1-12的羧基碳比例为27.0、27.2、26.5、26.3、25.0、24.7、23.9、21.5、21.5、21.0、19.8、19.5；
该方法提取的不同富里酸亚组分中的芳香碳含量存在明显变化，富里酸亚组分1-12的芳香碳比例为25.6、25.9、26.1、26.7、26.9、25.1、26.7、29.9、31.9、32.0、31.1、27.7。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (3)
1.藻体富里酸的XAD-8树脂分级方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤a、藻体预处理：
取风干后的藻体剔除杂物，在30-50oC条件下烘干20-28h，碾磨过筛，得到藻体粉末；
步骤b、藻体索氏提取：
将藻体粉末置于索式提取器中，用乙醚为提取液进行索氏提取，所得固体标记为乙醚索提藻体；
将乙醚索提藻体置于索式提取器中，用丙酮为提取液进行索氏提取，所得固体标记为丙酮索提藻体；
将丙酮索提藻体置于索式提取器中，用95%乙醇为提取液进行索氏提取，所得固体标记为乙醇索提藻体；
将乙醇索提藻体置于索式提取器中，用二氧杂环己烷为提取液进行索氏提取，所得固体标记为二氧杂环己烷索提藻体；
将二氧杂环己烷索提藻体置于索式提取器中，用去离子水为提取液进行索氏提取，所得固体标记为去离子水索提藻体；
步骤c、藻体的氯化钙处理：
向去离子水索提藻体中加入氯化钙溶液，使固液比达到1：10，在50-70oC条件下连续搅拌15-30min，离心分离后弃去上层清液，得到氯化钙处理藻体1；
向氯化钙处理藻体1中加入氯化钙溶液，使固液比达到1：10，在50-70oC条件下连续搅拌15-30min后，离心分离后弃去上层清液，得到氯化钙处理藻体2；
向氯化钙处理藻体2中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10-30min后，离心分离后弃去上层清液，得到去离子水处理藻体；
向去离子水处理藻体中加入盐酸，使固液比达到1：10，连续搅拌10-30min后，离心分离后弃去上层清液，得到盐酸处理藻体1；
向盐酸处理藻体1中加入盐酸，使固液比达到1：10，连续搅拌10-30min后，离心分离后弃去上层清液，得到盐酸处理藻体2；
向盐酸处理藻体2中加入盐酸，使固液比达到1：10，连续搅拌10-30min后，离心分离后弃去上层清液，得到盐酸处理藻体3；
向盐酸处理藻体3中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10-30min后，离心分离后弃去上层清液，得到水洗盐酸处理藻体；
步骤d、藻体的碳酸钠处理：
向水洗盐酸处理藻体中加入碳酸钠溶液，使固液比达到1：10，在30-45oC条件下连续搅拌30-60min后，离心所得固体标记为碳酸钠处理藻体1；
向碳酸钠处理藻体1中加入碳酸钠溶液，使固液比达到1：10，在30-45oC条件下连续搅拌30-60min后，离心所得固体标记为碳酸钠处理藻体2；
向碳酸钠处理藻体2中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10-30min后，离心所得固体标记为水洗碳酸钠处理藻体藻体；
步骤e、藻体的碱液提取：
氮气保护条件下，向水洗碳酸钠处理藻体中加入氢氧化钠和焦磷酸钠，并用去离子水稀释，使氢氧化钠和焦磷酸钠浓度均为0.1mol/L且固液比为1:10，搅拌4-6h，静置20-28h后，离心得到上层清液1和藻体残渣1；；
氮气保护条件下，向上层清液1中加入盐酸，使其pH=1.0-3.0，搅拌30-60min，静置20-28h后，离心得上层清液标记为富里酸1；
氮气保护条件下，向藻体残渣1中加入氢氧化钠和焦磷酸钠，并用去离子水稀释，使氢氧化钠和焦磷酸钠浓度均为0.1mol/L且固液比为1:10，搅拌4-6h，静置20-28h后，离心得到上层清液2和藻体残渣2；
氮气保护条件下，向上层清液2中加入盐酸，使其pH=1.0-3.0，搅拌30-60min，静置20-28h后，离心得上清液标记为富里酸2；
将富里酸1和富里酸2合并，标记为粗提富里酸溶液；
步骤f：藻体富里酸的树脂吸附：
将粗提富里酸溶液以10-15倍柱体积/h的流速通过XAD-8树脂柱，弃去流出液；
步骤g：富里酸亚组分分级淋洗：
用pH=2的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度，淋洗步骤f中的XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当测得流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=2的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4-6h后，静置20-28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分1；
然后用pH=3的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当测得流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4-6h后，静置20-28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分2；
然后用pH=4的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当测得流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=4的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4-6h后，静置20-28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分3；
然后，用pH=5的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当测得流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4-6h后，静置20-28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分4；
然后用pH=6的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当测得流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=6的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4-6h后，静置20-28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分5；
然后用pH=7的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4-6h后，静置20-28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分6；
然后在氮气保护条件下，用pH=8的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=8的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4-6h后，静置20-28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分7；
然后在氮气保护条件下，用pH=9的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2-50mL流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4-6h后，静置20-28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分8；
然后在氮气保护条件下，用pH=10的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=10的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4-6h后，静置20-28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分9；
然后在氮气保护条件下，用pH=11的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4-6h后，静置20-28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分10；
然后在氮气保护条件下，用pH=12的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=12的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到上清液，标记为粗提富里酸亚组分11；
然后在氮气保护条件下，用pH=13的0.1mol/L焦磷酸钠缓冲液以5-10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到上清液，标记为粗提富里酸亚组分12；
步骤h：富里酸亚组分样品的纯化：
将上述12份粗提富里酸亚组分分别加入氢氟酸，当每份酸化液中的氢氟酸浓度为0.3mol/L时，将其静置20-28h，然后分别标记为无硅溶液1～无硅溶液12，共计12份无硅溶液；
将上述12份无硅溶液分别以5倍柱体积/h流速通过XAD—8树脂柱进行吸附；
吸附完成后，分别用0.65倍柱体积去离子水以15倍柱体积/h的流速淋洗每份无硅溶液对应的XAD—8树脂柱，弃去流出液，再依次用1倍柱体积0.1mol/L氢氧化钠溶液和2倍柱体积去离子水以3倍柱体积/h的流速淋洗XAD—8树脂柱，流出液通过氢离子饱和的氢型阳离子交换树脂交换最终得到的流出液分别标记为富里酸亚组分1～富里酸亚组分12，共计12份富里酸亚组分溶液；
将富里酸亚组分1～富里酸亚组分1212分别冷冻干燥，最终得到12份固体富里酸亚组分分级样品。
2.根据权利要求1所述的藻体中富里酸提取及树脂分级方法，其特征在于，所述步骤b中，将藻体粉末置于索式提取器中，依次用乙醚、丙酮、95%乙醇、二氧杂环己烷作为提取液进行索提；索提过程中，当采用其中一种索提液索提时，则每隔5h，在220nm波长的紫外可见光下测定索提液的吸光度，当测得的索提液的吸光度大于或等于0.01时，则继续该索提过程；当测得的吸光度小于0.01时，更换下一个索提液进行索提。
3.根据权利要求1所述的藻体中富里酸提取及树脂分级方法，其特征在于，所述分级提取方法还包括步骤i：取步骤h所得的12份固体富里酸亚组分分级样品，分别在80-100℃下烘干24h后，测定所得灰分；如果其中某份富里酸亚组分以干重计灰分大于0.1%，则将该富里酸亚组分，加入去离子水使富里酸溶液浓度=1—3g/L后，加入浓盐酸和去离子水，使固液比为1:10且盐酸浓度为0.1mol/L后重复操作步骤h，直到测得的灰分小于或等于0.1%。
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