CN105087734A - 一种以鱼皮、鱼鳞制备胶原蛋白粉的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物类胶原蛋白的提取领域，具体涉及一种以鱼皮、鱼鳞制备胶原蛋白粉的方法。将鱼皮、鱼鳞经臭氧水处理、酸处理脱钙、碱处理脱杂蛋白后，采用复合蛋白酶对鱼皮、鱼鳞分别进行酶解处理，在此条件下，胶原蛋白的提取率高；最后采用三级膜系统进行处理，分别截留得到不同分子量的胶原蛋白肽产物。通过多重膜过滤，可以获得不同大小分子量的胶原蛋白提取产物，肽的损失几乎为零，可去除90%以上的小分子氨基酸，提高了短肽的纯度，制得了一种纯度高的胶原蛋白粉。
Description
技术领域
本发明属于动物类胶原蛋白的提取领域，具体涉及一种以鱼皮、鱼鳞制备胶原蛋白粉的方法。
背景技术
罗非鱼，俗称非洲鲫鱼，非鲫、越南鱼、南洋鲫等，现在是世界水产业的重点科研培养的淡水养殖鱼类，且被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一。罗非鱼鱼鳞主要由蛋白质和灰分组成，粗蛋白含量高达50%以上；氨基酸组成显示淡水鱼鳞羟脯氨酸含量丰富，是制备水解胶原蛋白的良好原料。公布号为CN104498573A的专利申请公开了一种罗非鱼鳞胶原蛋白提取方法，其是将鱼鳞加盐酸脱钙，再除杂蛋白后，蒸馏水清洗然后烘干、酶解、过滤取清液后干燥制得胶原蛋白。采用该方法制得的鱼鳞胶原蛋白还含有很多小分子氨基酸，活性短肽的纯度不高，影响其功效。
现有使用鱼鳞生产胶原蛋白的商家多数宣称自己使用的是野生罗非鱼，但中国野生罗非鱼数量非常稀少。现在国内的鱼鳞胶原有90%是商家使用养殖罗非鱼提取的，罗非鱼因其生长于淡水，适温22～35℃，向阳喜光，不耐低高温，繁殖强等特性利于人工养殖。大规模养殖业很难避免鱼类传染病的发生，解决办法就是使用一定的抗生素。还有渔民在养殖过程中为了提高鱼群的生长速度或多或少的喂一些含有激素的鱼食。所以，人工养殖的罗非鱼或多或少会含有激素和抗生素，以这样的原料制成的胶原蛋白粉安全性得不到保障。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种以鱼皮、鱼鳞制备胶原蛋白粉的方法。本发明采用臭氧水处理鱼皮、鱼鳞，可降解鱼皮鱼鳞中残留的激素和抗生素，然后经复合蛋白酶对鱼皮、鱼鳞分别进行酶解，能最大程度提取鱼皮、鱼鳞中的胶原蛋白，再经三级膜处理，能去除90%以上的小分子氨基酸，极大提高了短肽的纯度。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种以鱼皮、鱼鳞制备胶原蛋白粉的方法，包括以下步骤：
（1）臭氧水处理：将鱼皮、鱼鳞经分选除杂、清洗后，分别堆铺成0.5~1cm厚，将浓度为9-11毫克/升的臭氧水雾化后，均匀喷洒于鱼皮、鱼鳞上；采用频率为20~30kHz、功率60~80w/cm2的超声波对鱼皮、鱼鳞进行超声消解，超声2-4小时；臭氧溶于水后产生氧气和原子态氧，这个原子态氧非常容易与细菌、激素、抗生素等分子结构中的各种“环”发生化学反应，使其很快失去毒性而变为对人体无毒无害的稳定化合物，达到高效降解毒性的作用，超声波消解则有助于臭氧水充分与鱼皮鱼鳞接触；臭氧水雾化可采用压力雾化、离心雾化或超声雾化；
（2）将臭氧水处理后的鱼皮、鱼鳞烘干、粉碎后分别制得鱼皮粉、鱼鳞粉，
然后采用酸处理脱钙，采用碱处理除去鱼皮、鱼鳞中的非胶原杂蛋白；
（3）鱼皮、鱼鳞分别进行酶处理：鱼皮的酶处理条件为：以0.5mol/L复合蛋白酶乙酸溶液作为提取剂，酶量4000U/g，提取温度37℃，提取时间为6h，固液比为1:4，在此条件下得胶原蛋白的提取率在600%以上；鱼鳞的酶处理条件为：处理温度55℃、复合蛋白酶与底物比为3wt%、底物浓度100g/L、酶解处理时间2h；
（4）脱色：酶解液经离心、过滤、脱色、脱腥处理后，加入至三级膜系统中；
（5）膜处理：经三级膜系统处理后，截留得到不同分子量的胶原蛋白肽产物；
（6）低温真空浓缩：不同分子量的胶原蛋白肽产物经过低温真空浓缩、喷雾干燥、过筛工序后分别进行包装制得胶原蛋白粉。
步骤（5）中所述的三级膜系统具体为：
（1）一级膜处理：将脱腥后的酶解液在pH值6~7、温度40~50℃、压力0.2~0.3MPa的条件下，采用500nm的陶瓷膜进行分离，平均通量为120kg/m2·h，进行一级膜处理；
（2）二级膜处理：在pH值6~7、温度35~40℃、压力1.1~1.3MPa的条件下，采用分子量为2500Da的卷式膜分离，进行二级膜处理，截留分子量500~800Da的活性短肽；
（3）三级膜处理：在pH值6~7、温度35~40℃、压力2.5~3.0MPa的条件下，进行三级膜处理，去除90wt%以上的小分子氨基酸；
步骤（1）中对鱼皮进行处理时：臭氧水用量为鱼皮重量的0.5%，对鱼鳞进行处理时：臭氧水用量为鱼皮重量的0.8~1.2%；
步骤（2）所述的烘干、粉碎为在65~80℃条件下，烘干至水分含量≤12wt%，粉碎后过30目筛；
步骤（2）所述的酸处理条件为：HCl浓度0.4mol/L，料液比1:20，脱钙时间6h；碱处理条件为：NaOH浓度0.15mol/L，料液比l:20，处理时间12h，在此工艺条件下，得到的鱼鳞胶原蛋白纯度高，品质佳；
步骤（3）中鱼皮酶处理时，所述的复合蛋白酶为胰蛋白酶和碱性蛋白酶按质量比5-6:1混合而成的；鱼鳞酶处理时，所述的复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶按质量比3-4:1混合而成的；加入不同的复合酶提取得到酶促溶性胶原蛋白，这样得到的胶原蛋白仍有完整的三股螺旋结构，更降低了胶原的抗原性，适用于作为医用生物材料及原料。
本发明的脱色、低温真空浓缩均是采用本领域的常规技术。
本发明的有益效果在于：
（1）以罗非鱼为例，鱼皮、鱼鳞主要由蛋白质和灰分组成，粗蛋白含量高达50%以上；氨基酸组成显示淡水鱼鳞羟脯氨酸含量丰富，是制备水解胶原蛋白的良好原料，但是小分子氨基酸残留在胶原蛋白提取物中，会影响短肽的纯度；本发明采用复合蛋白酶处理可以最大程度地提取鱼皮鱼鳞中的胶原蛋白，再经三级膜系统处理，可去除90wt%以上的小分子氨基酸，提高短肽的纯度，可以获得不同大小分子量的胶原蛋白提取产物；
（2）本发明将雾化臭氧水喷洒于鱼皮、鱼鳞上，经超声波消解后，可将鱼皮、鱼鳞中的激素或抗生素等降解为无毒物质，达到了高效降解毒性的作用，为制得一种安全性能高、质量好的胶原蛋白粉打下了良好的基础；而且针对鱼鳞中残留的激素或抗生素比鱼皮中更高，鱼皮、鱼鳞所采用的臭氧量也不同；
（3）本发明针对鱼皮、鱼鳞，加入不同的复合酶进行酶解，提取得到酶促溶性胶原蛋白，这样得到的胶原蛋白仍有完整的三股螺旋结构，更降低了胶原的抗原性，适用于作为医用生物材料及原料。
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
实施例1
一种以罗非鱼鱼皮、鱼鳞制备胶原蛋白粉的方法，包括以下步骤：（1）臭氧水处理：将鱼皮、鱼鳞经分选除杂、清洗后，分别堆铺成0.5~1cm厚，将浓度为10毫克/升的臭氧水雾化后，均匀喷洒于鱼皮（臭氧水用量为鱼皮重量的0.5%）、鱼鳞上（臭氧水用量为鱼皮重量的1.0%）；采用频率为25kHz、功率70w/cm2的超声波对鱼皮、鱼鳞进行超声消解，鱼皮超声2小时，鱼鳞超声4h；
（2）酸处理：将经臭氧水处理的鱼皮、鱼鳞经分选除杂、清洗，在65℃条件下，烘干至水分含量≤12wt%，粉碎后过30目筛后；分别制得鱼皮粉、鱼鳞粉，然后采用酸处理脱钙；酸处理条件为：HC1浓度0.4mol/L，料液比1:20，脱钙时间6h；
（3）碱处理：采用碱处理除去鱼皮、鱼鳞中的非胶原杂蛋白；工艺条件为：NaOH浓度0.15mol/L，料液比l:20，脱杂蛋白时间12h；在此工艺条件下，得到的鱼鳞胶原蛋白纯度高，品质佳；
（4）酶处理：鱼皮的酶处理条件为：以0.5mol/L的复合蛋白酶乙酸溶液作为提取剂，酶量4000U/g，提取温度37℃，提取时间为6h，固液比为1:4，所述的复合蛋白酶为胰蛋白酶和碱性蛋白酶按质量比5:1混合而成的，在此条件下得胶原蛋白的提取率在600%以上；鱼鳞的酶处理条件为：处理温度55℃、复合蛋白酶与底物比为3wt%、底物浓度100g/L、酶解处理时间2h，所述的复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶按质量比3:1混合而成的；加入不同的复合酶提取得到酶促溶性胶原蛋白，这样得到的胶原蛋白仍有完整的三股螺旋结构，更降低了胶原的抗原性，适用于作为医用生物材料及原料；
（5）脱色：酶解液经离心、过滤、脱色、脱腥处理后，加入至三级膜系统中；
（6）膜处理：经三级膜系统处理后，截留得到不同分子量的胶原蛋白肽产物；
一级膜处理：将脱腥后的酶解液在pH值6、温度45℃、压力0.2MPa的条件下，采用500nm的陶瓷膜进行分离，平均通量为120kg/m2·h，进行一级膜处理；
二级膜处理：在pH值6、温度35℃、压力1.1MPa的条件下，采用分子量为2500Da的卷式膜分离，进行二级膜处理，截留分子量500~800Da的活性短肽；
三级膜处理：在pH值6、温度35℃、压力2.5MPa的条件下，进行三级膜处理，去除90wt%以上的小分子氨基酸；
（7）低温真空浓缩：不同分子量的胶原蛋白肽产物经过-5℃真空浓缩、喷雾干燥、过筛工序后分别进行包装制得胶原蛋白粉。
实施例2
一种以罗非鱼鱼皮、鱼鳞制备胶原蛋白粉的方法，包括以下步骤：（1）臭氧水处理：将鱼皮、鱼鳞经分选除杂、清洗后，分别堆铺成0.5~1cm厚，将浓度为9毫克/升的臭氧水雾化后，均匀喷洒于鱼皮（臭氧水用量为鱼皮重量的0.5%）、鱼鳞上（臭氧水用量为鱼皮重量的1.2%）；采用频率为30kHz、功率80w/cm2的超声波对鱼皮、鱼鳞进行超声消解，鱼皮超声3小时，鱼鳞超声3h；
（2）酸处理：将经过碱处理的鱼皮、鱼鳞经分选除杂、清洗，在70℃条件下，烘干至水分含量≤12wt%，粉碎后过30目筛后；分别制得鱼皮粉、鱼鳞粉，然后采用酸处理脱钙；酸处理条件为：HC1浓度0.4mol/L，料液比1:20，脱钙时间6h；
（3）碱处理：采用碱处理除去鱼皮、鱼鳞中的非胶原杂蛋白；工艺条件为：NaOH浓度0.15mol/L，料液比l:20，脱杂蛋白时间12h；在此工艺条件下，得到的鱼鳞胶原蛋白纯度高，品质佳；
（4）酶处理：鱼皮的酶处理条件为：以0.5mol/L的复合蛋白酶乙酸溶液作为提取剂，酶量4000U/g，提取温度37℃，提取时间为6h，固液比为1:4，所述的复合蛋白酶为胰蛋白酶和碱性蛋白酶按质量比6:1混合而成的，在此条件下得胶原蛋白的提取率在600%以上；鱼鳞的酶处理条件为：处理温度55℃、复合蛋白酶与底物比为3wt%、底物浓度100g/L、酶解处理时间2h，所述的复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶按质量比4:1混合而成的；加入不同的复合酶提取得到酶促溶性胶原蛋白，这样得到的胶原蛋白仍有完整的三股螺旋结构，更降低了胶原的抗原性，适用于作为医用生物材料及原料；
（5）脱色：酶解液经离心、过滤、脱色、脱腥处理后，加入至三级膜系统中；
（6）膜处理：经三级膜系统处理后，截留得到不同分子量的胶原蛋白肽产物；
一级膜处理：将脱腥后的酶解液在pH值6、温度40℃、压力0.3MPa的条件下，采用500nm的陶瓷膜进行分离，平均通量为120kg/m2·h，进行一级膜处理；
二级膜处理：在pH值7、温度40℃、压力1.2MPa的条件下，采用分子量为2500Da的卷式膜分离，进行二级膜处理，截留分子量500~800Da的活性短肽；
三级膜处理：在pH值7、温度40℃、压力3.0MPa的条件下，进行三级膜处理，去除90wt%以上的小分子氨基酸；
（7）低温真空浓缩：不同分子量的胶原蛋白肽产物经过-10℃真空浓缩、喷雾干燥、过筛工序后分别进行包装制得胶原蛋白粉。
实施例3
一种以罗非鱼鱼皮、鱼鳞制备胶原蛋白粉的方法，包括以下步骤：（1）臭氧水处理：将鱼皮、鱼鳞经分选除杂、清洗后，分别堆铺成0.5~1cm厚，将浓度为11毫克/升的臭氧水雾化后，均匀喷洒于鱼皮（臭氧水用量为鱼皮重量的0.5%）、鱼鳞上（臭氧水用量为鱼皮重量的0.8%）；采用频率为20kHz、功率60w/cm2的超声波对鱼皮、鱼鳞进行超声消解，鱼皮超声2小时，鱼鳞超声4h；
（2）酸处理：将经过碱处理的鱼皮、鱼鳞经分选除杂、清洗，在80℃条件下，烘干至水分含量≤12wt%，粉碎后过30目筛后；分别制得鱼皮粉、鱼鳞粉，然后采用酸处理脱钙；酸处理条件为：HC1浓度0.4mol/L，料液比1:20，脱钙时间6h；
（3）碱处理：采用碱处理除去鱼皮、鱼鳞中的非胶原杂蛋白；工艺条件为：NaOH浓度0.15mol/L，料液比l:20，脱杂蛋白时间12h；在此工艺条件下，得到的鱼鳞胶原蛋白纯度高，品质佳；
（4）酶处理：鱼皮的酶处理条件为：以0.5mol/L的复合蛋白酶乙酸溶液作为提取剂，酶量4000U/g，提取温度37℃，提取时间为6h，固液比为1:4，所述的复合蛋白酶为胰蛋白酶和碱性蛋白酶按质量比5:1混合而成的，；在此条件下得胶原蛋白的提取率在600%以上；鱼鳞的酶处理条件为：处理温度55℃、复合蛋白酶与底物比为3wt%、底物浓度100g/L、酶解处理时间2h，所述的复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶按质量比3:1混合而成的；加入不同的复合酶提取得到酶促溶性胶原蛋白，这样得到的胶原蛋白仍有完整的三股螺旋结构，更降低了胶原的抗原性，适用于作为医用生物材料及原料；
（4）脱色：酶解液经离心、过滤、脱色、脱腥处理后，加入至三级膜系统中；
（5）膜处理：经三级膜系统处理后，截留得到不同分子量的胶原蛋白肽产物；
一级膜处理：将脱腥后的酶解液在pH值7、温度50℃、压力0.3MPa的条件下，采用500nm的陶瓷膜进行分离，平均通量为120kg/m2·h，进行一级膜处理；
二级膜处理：在pH值7、温度37℃、压力1.3MPa的条件下，采用分子量为2500Da的卷式膜分离，进行二级膜处理，截留分子量500~800Da的活性短肽；
三级膜处理：在pH值7、温度37℃、压力2.8MPa的条件下，进行三级膜处理，去除90wt%以上的小分子氨基酸；
（6）低温真空浓缩：不同分子量的胶原蛋白肽产物经过-5℃真空浓缩、喷雾干燥、过筛工序后分别进行包装制得胶原蛋白粉。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (6)
1.一种以鱼皮、鱼鳞制备胶原蛋白粉的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）臭氧水处理：将鱼皮、鱼鳞经分选除杂、清洗后，分别堆铺成0.5~1cm厚，将浓度为9-11毫克/升的臭氧水雾化后，均匀喷洒于鱼皮、鱼鳞上；采用频率为20~30kHz、功率60~80w/cm2的超声波对鱼皮、鱼鳞进行超声消解，超声2-4小时；
（2）将臭氧水处理后的鱼皮、鱼鳞烘干、粉碎后分别制得鱼皮粉、鱼鳞粉，
然后采用酸处理脱钙，采用碱处理除去鱼皮、鱼鳞中的非胶原杂蛋白；
（3）鱼皮、鱼鳞分别进行酶处理：鱼皮的酶处理条件为：以0.5mol/L复合蛋白酶乙酸溶液作为提取剂，酶量4000U/g，提取温度37℃，提取时间为6h，固液比为1:4；鱼鳞的酶处理条件为：处理温度55℃、复合蛋白酶与底物比为3wt%、底物浓度100g/L、酶解处理时间2h；
（4）脱色：酶解液经离心、过滤、脱色、脱腥处理后，加入至三级膜系统中；
（5）膜处理：经三级膜系统处理后，截留得到不同分子量的胶原蛋白肽产物；
（6）低温真空浓缩：不同分子量的胶原蛋白肽产物经过低温真空浓缩、喷雾干燥、过筛工序后分别进行包装制得胶原蛋白粉。
2.根据权利要求1所述的以鱼皮、鱼鳞制备胶原蛋白粉的方法，其特征在于：步骤（5）中所述的三级膜系统具体为：
（1）一级膜处理：将脱腥后的酶解液在pH值6~7、温度40~50℃、压力0.2~0.3MPa的条件下，采用500nm的陶瓷膜进行分离，平均通量为120kg/m2·h，进行一级膜处理；
（2）二级膜处理：在pH值6~7、温度35~40℃、压力1.1~1.3MPa的条件下，采用分子量为2500Da的卷式膜分离，进行二级膜处理，截留分子量500~800Da的活性短肽；
（3）三级膜处理：在pH值6~7、温度35~40℃、压力2.5~3.0MPa的条件下，进行三级膜处理，去除90wt%以上的小分子氨基酸。
3.根据权利要求1所述的以鱼皮、鱼鳞制得胶原蛋白粉的方法，其特征在于：步骤（1）中对鱼皮进行处理时：臭氧水用量为鱼皮重量的0.5%，对鱼鳞进行处理时：臭氧水用量为鱼皮重量的0.8~1.2%。
4.根据权利要求1所述的以鱼皮、鱼鳞制得胶原蛋白粉的方法，其特征在于：步骤（2）所述的烘干、粉碎为在65~80℃条件下，烘干至水分含量≤12wt%，粉碎后过30目筛。
5.根据权利要求1所述的以鱼皮、鱼鳞制备胶原蛋白粉的方法，其特征在于：步骤（2）所述的酸处理条件为：HCl浓度0.4mol/L，料液比1:20，脱钙时间6h；碱处理条件为：NaOH浓度0.15mol/L，料液比l:20，处理时间12h。
6.根据权利要求1所述的以鱼皮、鱼鳞制备胶原蛋白粉的方法，其特征在于：步骤（3）中鱼皮酶处理时，所述的复合蛋白酶为胰蛋白酶和碱性蛋白酶按质量比5-6:1混合而成的；鱼鳞酶处理时，所述的复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶按质量比3-4:1混合而成的。
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