CN105087638B - 具有多功能的瞬时表达病毒载体体系 - Google Patents

具有多功能的瞬时表达病毒载体体系 Download PDF

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Abstract

本申请揭示了适用于木本树木转染的病毒载体，主要用于传递和表达有益的基因。本申请具体说明的是用于感染柑橘属果树的载体。该载体可以表达有用的蛋白质，例如那些可以保护树木不受疾病伤害的蛋白质。本申请具体说明的是转染木本树木的方法，可以在避免双重感染的同时实现载体的多样化应用。

Description

具有多功能的瞬时表达病毒载体体系
相关申请的交叉参考
本申请根据美国法典第35篇第119条(35USC 119)要求2010年8月8日提交的美国专利申请第61/321,970号和2011年2月8日提交的美国专利申请第61/440,445号的优先权。
发明领域
发明的初始实施例与一个基于病毒的瞬时表达载体有关，该载体可以长时间在子系中表达外来基因，从而允许在同一时间或者稍后对同个子系使用相似的载体。其他实施例与病毒载体结构和方法有关，这些方法可以避免排除双重感染，从而使载体的应用多样化。
背景技术
基于病毒的瞬时表达载体是世界上植物分子生物学实验所用的常用工具，它可以快速表达或者沉默植物中的基因。它们也是植物基因组学中的重要工具，可以筛选某功能的位置序列。但是，只能从草本植物的有限数量的类似病毒中开发可用的载体。比较著名的例子有基于烟草花叶病毒(TWV)的载体(Dawson et al.，1989；Donson et al.，1991；Shivprasad et al.，1999；Rabindran和Dawson，2001)。木本植物的挑战更为特殊。即使存在可以感染树木的载体，系统感染和分析树木中表达基因所需的时间一般都超出了已知基于病毒的载体的稳定性。但是生殖限制以及改良树木所需的几十年时间带来的挑战增加了有用的基于病毒的载体的需求。
柑橘特里斯德察病毒(CTV)是复杂的长线病毒家族中的一员，该家族的病毒有单分、双分和三分的基因组，由部分昆虫载体传递，包括蚜虫，烟粉虱和粉蚧(Bar-Joseph etal.，1979；Dolja et al.，1994；Agranovsky，1996；Karasev，2000)。CTV的长弯曲病毒子(2000nm X 10-12nm)被两个外壳蛋白包被：主要的外壳蛋白(CP)覆盖大约97％的病毒子，而非主要的外壳蛋白(CPm)负责将另一个末端包入壳内。CTV的单链RNA基因大约为19.3kb，被分成十二个开放阅读框(ORFs)(Pappu et al.，1994；Karasev et al.，1995)(图1)。ORF1a编码一个349kDa大小的多蛋白质，此蛋白包括两个类木瓜蛋白酶的蛋白酶区域以及类转甲基酶和类解旋酶区域。多蛋白的翻译被认为通过在类聚合酶区域(ORF 1b)的a+1移码可以继续进行。ORFs 1a和1b加上非编码末端都是原生质体复制所必需的(Satyanarayana etal.，1999)。十个3′ORFs通过3′共末端亚基因(sg)mRNAs表达(Hilf et al.，1995；Karasevet al.，1997)。除了两个外壳蛋白质外，p65(HSP70同源)和p61是有效的病毒体组装所需的，而且是病毒在原生质体之间传代所需的，从而丰富柠檬树感染的接芽(Satyanarayanaet al.，2000)。p6蛋白质是植物感染所需的，同时p20和p23蛋白质以及CP是RNA沉默的抑制子(Lu et al.，2004)。
CTV可以感染并在一些被删除部分病毒基因的柑橘属果树变种中移动。CTV在病毒体复制或者形成中不需要的基因组的3’部分中包含五个基因，即p6、p33、p18、p13和p20。p33、p18和p13在此类病毒群的其他成员中并不保守，而且被认为已经进化从而保证与柑橘属宿主的特异相互作用。我们发现，p33、p18或者p13ORF中的删除分别都会导致病毒感染、扩增和在柑橘属果树之间的传播能力发生不严重的丢失(Tatineni et al.，2008)。而且p33、p18或者p13基因中任意组合的删除会使病毒从整体上侵染相橘属果树，包括所有三个基因的删除。绿色荧光蛋白标记的CTV突变和p33ORF或者p33、p18和p13ORF中的删除证明这些删除变异的移动和分布与野生型的病毒类似。
在双重感染排除或者同源干扰中，先前存在的感染会阻止同个或者相近的病毒的二次感染，但是不能影响无关病毒的感染。此现象首先由McKinney(McKinney，1926；1929)在两个基因型的烟草花叶病毒(TMV)之间发现，随后也在噬菌体(Dulbecco，1952；Visconti，1953)中发现。自此之后，经常也在动物(Adams和Brown，1985；Bratt和Rubin，1968；Delwart和Panganiban，1989；Geib et al.，2003；Johnston et al.，1974；Karpf etal.，1997；Lee et al.，2005；Singh et al.，1997；Steck和Rubin，1966；Strauss和Strauss，1994；Whitaker-Dowling et al.，1983；Wildum et al.，2006)和植物(Bennett，1951；Fulton，1978；Gal-On和Shiboleth，2005；Hull和Plaskitt，1970；Hull，2002；Lecoqet al.，1991；Salaman，1933；Walkey et al.，1992)病毒中观察到这一现象。在植物病毒学中，同源干扰最先被用作病毒相关性的检测，用来确定两个病毒分离株是同个病毒的“品系”或者是代表着不同的病毒(McKinney，1929；Salaman，1933)。随后，这项技术被发展成一个管理工具，通过使用温和病毒分离株有目的地感染植物来减少更严重的病毒分离株的感染以及造成的损失，从而减少了农作物的损失，这被称为“交叉保护”(见Gal-On和Shiboleth，2005以及Hull，2002的综述)。
附图说明
图1中(A)为野生型CTV T36(T36CTV9R)基因组织的简图。(B)和(C)分别为Δp33CTV结构和被前蛋白酶区域取代的杂交结构图示。空白方框表示ORF及其翻译产物。PRO，类木瓜蛋白酶区域；MT，转甲基酶；HEL，解旋酶；RdRp，一个RNA依赖的RNA聚合酶；HSP70h，HSP70同源物；CPm，非主要的外壳蛋白质；CP，主要外壳蛋白质。黑框分别表示T36基因组中替代的T68-1序列。箭头指出p33 ORF删除的位置。
图2显示了被来自T68-1分离株(黑框)蛋白酶区域进入到T36基因组替代的杂交病毒的图示。下方：感染T36分离株或者单独感染杂交L1L2h(第2、3道)检测病毒在植物中的增殖；第4道表示的是L1L2h在预感染T36的植物中的增殖。通过反转录PCR反应来分析病毒扩增，其中每个反应混合物中都有1套引物：一套是T36蛋白酶特异性，另一套是针对T68的蛋白酶区域，从而区分T36和L1L2h。
发明详述
病毒倾向于通过相关的病毒来防止双重感染。加入基于病毒的瞬时载体一般会阻止在同样的树木中使用该载体或者相关载体。发明者现在也意识到目标生物已经被感染有一个相似的载体之后，有时候在目标生物(例如树木或者植物)中加入载体仍然具有意义。例如，发明者发现如果一个植物丢失了正在表达的外来基因，那么能够加入载体将会很必要；如果发现一个更好的基因在树木中表达；和/或者如果需要表达不止一个基因。同样，发明者也意识到有必要将一个病毒品系的载体应用到一个已感染有该品系的野生型的植物中。发明者发现对病毒载体的相应部分作出目标明确的修改可以避免双重感染排除现象。
此处描述的本发明的相应实施例为基于柑橘特里斯德察病毒(CTV)和一个正链RNA长线型病毒构造的病毒结构，它们能够在已经被一个相似品系的病毒感染的植物中进行双重感染。发明者发现通过修改野生型CTV病毒来构造的病毒结构能够解决双重感染排除的问题，比如，让他们的前蛋白酶被一个不同病毒品种的前蛋白酶序列所替代。
根据其他的具体实施例，本发明也关系到了基于其他柑橘特里斯德察病毒(CTV)和一个正链RNA长线型病毒构造的病毒结构，这些病毒能够实现之后引入的基于CTV病毒结构的双重感染。发明者发现通过修改野生型CTV病毒来构造的病毒结构无法对野生型病毒的感染提供保护，比如这些病毒缺乏编码功能性p33蛋白质的基因。当连续的植物接芽使用缺乏p33蛋白质的病毒结构和野生型CTV时，植物初次感染具有删除变异的病毒结构，此次感染对野生型病毒的二次感染的建立没有显著的影响。因而，删除p33 ORF会产生一个CTV的“非交叉保护”变异。
在之前，发明者检查了柑橘特里斯德察病毒(CTV)不同基因型在阻止其他病毒分离株双重感染能力之间的关系。只有同个CTV品系的分离株之间才会发生双重感染排除。当使用同个品系的分离株来进行按次序的植物接芽时，首次感染会提供危险分离株的全面防护。注意到CTV病毒之间的完全交叉保护的一个例子是在初次感染了属于同个T36品系的野生型CTV的植物中，表达GFP的CTV感染被完全抑制。
根据一个实施例，发明者检查了基于CTV的T36品系的感染cDNA克隆构造的病毒结构的双重感染排除。结果表明，通过修改野生型CTV病毒构造的病毒结构不能为野生型病毒感染提供双重感染排除，例如这些病毒缺乏编码功能性p33蛋白质的基因或者有一个来自于其他CTV品系(T68)的前蛋白酶区域替代物。当其中一种病毒结构被用于柑橘属果树的初次接芽，之后使用野生型CTV接芽，植物初次感染的变异病毒对野生型病毒的二次感染没有显著的影响。因而，p33 ORF删除以及前蛋白酶区域的替代会产生CTV的“非交叉保护”变异。这些病毒结构可以被用作植物载体，从而实现多样化应用。
在另一个实施例中，发明关系到一个病毒载体结构，此处该病毒结构被设计成使用来自于一个常用病毒品种不同品系的分离株的前蛋白酶来替代病毒载体的内源前蛋白酶。CTV的品系被定义为根据1aORF核苷酸序列分析病毒从系统上的不同品系(Hilf etal.，2005)。使用这一定义，T36和T68是品系。每个病毒样本都被称为这些品系中的一个的分离株。每个品系都被命名为“类型分离株”，并且由与类型成员序列差异较小的分离株组成。在一个更为具体的实施例中，病毒载体是前蛋白酶序列被另一个CTV品系的分离株取代的CTV分离株。在一个比前一个更加具体的实施例中，CTV载体是根据T36品系分离株构造的，它的前蛋白酶序列被T68CTV品系的一个分离株的前蛋白酶序列所替代。在一个更具体的实施例中，被替代的蛋白酶序列是类木瓜蛋白酶区域。
根据另一个实施例，发明与一个减轻连续病毒接芽带来的CTV病毒载体双重感染排除的方法有关。该方法包括让目标植物首次接芽p33 ORF丢失或者被破坏的CTV病毒载体，从而使首次CTV病毒载体感染目标植物而产生一个已感染的植物，然后让这个已感染的植物接芽第二个CTV病毒载体，该载体或有或没有pss基因或者已破坏的p33基因。第二个CTV病毒载体能够感染已经被感染的植物。在具体的实施例中，目标植物是柑橘属果树。在另一个具体的实施例中，首次和/或者二次CTV载体被构造成包括一个编码异源蛋白质的可表达序列。
根据另一个实施例，发明与一个减轻连续病毒接芽带来的CTV病毒载体双重感染排除的方法有关。该方法包括让目标植物相继接芽第一个和第二个病毒载体。第一个病毒载体被构造成一个前蛋白酶序列被一个来自于另一个CTV品系分离株的同源前蛋白酶序列所替代。在具体的实施例中，第一个和第二个病毒载体来自于一个常用的病毒品种。在一个更具体的实施例中，第一个和第二个病毒载体包含有来自于不同CTV品系的分离株的前蛋白酶区域。在具体的实施例中，目标生物是植物，而且在一个更为具体的实施例中，该植物是柑橘属果树。在另一个具体的实施例中，第一个和/或者第二个CTV载体被构造成包括一个编码异源蛋白质的可表达序列。
发明者意识到有时候在目标生物已经被感染有一个相似的载体之后，在目标生物(例如树木或者植物)中加入载体仍然具有意义。例如，发明者发现如果一个植物中的载体丢失了正在表达的外来基因，那么能够加入载体将会很必要；如果发现一个更好的基因在树木中表达；和/或者如果需要表达不止一个基因。同样，发明者也意识到有必要将一个病毒品系的载体应用到一个已感染有该品系的野生型的植物中。发明者发现对病毒载体的相应部分作出目标明确的修改可以避免双重感染排除现象。
发明者发现通过修改野生型CTV病毒来构造的病毒结构能够解决双重感染排除的问题，比如，让它们的前蛋白酶被一个不同病毒品种的前蛋白酶序列所替代。
检查了不同基因型柑橘特里斯德察病毒(CTV)在阻止其他病毒分离株双重感染的能力之间的关系。结果表明，双重感染排除只在同个CTV品系的分离株之间发生。当使用同个品系的分离株来进行按次序的植物接芽时，第一次感染为危险分离株提供了全面的排除。注意到CTV病毒之间的完全交叉保护的一个例子是在初次感染了属于同个T36品系的野生型CTV的植物中，表达GFP的CTV感染被完全抑制(Folimonova et al.，2010)。
根据一个实施例，发明者检查了基于CTV的T36品系的感染cDNA克隆构造的病毒结构的双重感染排除。结果表明，通过修改野生型CTV病毒构造的病毒结构，例如将L1L2蛋白酶区域替代成一个来自不同病毒品系的同源序列，使得构造的病毒载体即使在已经被同个病毒品系感染过的植物中也能避免双重感染排除。相应地，可以将本发明的病毒载体实施例用作之前已感染过同品系病毒的树木的载体，例如在田野中生长的树木通过病毒的自然传播被感染或者由于早期使用一个基于同个病毒品系构造的CTV载体而导致的树木感染，从而避免二次病毒载体感染的排除。
在另一个实施例中，发明关系到一个病毒载体结构，此处该病毒结构被设计成使用来自于一个常用病毒品种不同品系的分离株的前蛋白酶来替代病毒载体的内源前蛋白酶。CTV的品系被定义为根据1a ORF核苷酸序列分析病毒从系统上的不同品系(Hilf etal.，2005)。使用这一定义，T36和T68是品系。每个病毒样本都被称为这些品系中的一个的分离株。每个品系都被命名为“类型分离株”，并且由与类型成员序列差异较小的分离株组成。在一个更为具体的实施例中，病毒载体是前蛋白酶序列被另一个CTV品系的分离株取代的CTV分离株。在一个比前一个更加具体的实施例中，CTV载体是根据T36品系分离株构造的，它的前蛋白酶序列被T68 CTV品系的一个分离株的前蛋白酶序列所替代。在一个更具体的实施例中，被替代的蛋白酶序列是L1L2区域。
根据另一个实施例，发明与一个减轻连续病毒接芽带来的CTV病毒载体双重感染排除的方法有关。在一个具体的实施例中，该方法可能包括让目标植物接芽第一个基于CTV的第一个品系构造的CTV病毒载体，从而使首次CTV病毒载体感染目标植物而产生一个已感染的植物，然后让这个已感染的植物接芽第二个基于同个CTV品系但是已被修改成包括一个不同病毒品系(第二个)的前蛋白酶序列的CTV病毒载体。第二个CTV病毒载体也可以包括表达一个可以获得有益结果的蛋白质的基因。在一个具体的实施例中，第一个品系是T36，第二个品系是T68。第二个CTV病毒载体被允许感染已经感染过的植物。在一个具体的实施例中，目标植物是柑橘属果树。在另一个具体的实施例中，第一个和/或者第二个CTV载体被构造成包括一个编码异源蛋白质的可表达序列。
根据另一个实施例，发明与一个减轻病毒载体双重感染排除的方法有关。该方法包括让目标植物接芽一个已经感染过目标植物的病毒载体品系。第二个病毒载体被构造成一个前蛋白酶序列被一个来自于另一个CTV品系分离株的同源前蛋白酶序列所替代。在具体的实施例中，第一个和第二个病毒载体来自于一个常用的病毒品种。在一个更具体的实施例中，第一个和第二个病毒载体包含有来自于不同CTV品系的分离株的前蛋白酶区域。在一个更为具体的实施例中，前蛋白酶序列包含一个完整前蛋白序列片断，分别由800个碱基对(bp)或者更少、700bp或者更少、600bp或者更少、500bp或者更少、400bp或者更少、300bp或者更少、200bp或者更少或者100bp或者更少组成。或者，载体由一个至少为100bp、200bp、300bp、400bp或者500bp片段的完整前蛋白酶序列组成。已知前蛋白酶序列例子的无限制描述在下文的参考章节进行讨论。在一个具体的实施例中，目标生物是植物，而在一个更为具体的实施例中，目标生物是树，而再一个更加具体的实施例中，目标生物是柑橘属果树。在另一个实施例中，第一个/第二个CTV载体被构造出包括一个编码异源蛋白质的可表达序列。
此处使用的病毒品种是一群具有相似特征的病毒，而且可以感染相同(或者近似)的宿主品种。参考至“病毒品系”表示被分为一类的病毒，例如CTV或者其他病毒品种，但是他们的基因序列或者一些其他特征与被分成同一类的其他病毒不同。
实施例：
实施例1：CTVΔP33结构
发明者检查了几个病毒结构，所有的病毒都包含基于T36CTV的感染cDNA克隆而构造的p33 ORF删除(Tatineni et al.，2008)，从而可以防止表达GFP的CTV的双重感染。结果表明这些删除变异可以在树木中扩增，也能从整体上侵染大部份柑橘属变种树(Tatineniet al.，2008)。为了评估一个初次感染了CTV p33删除变异的宿主植物在同个宿主中双重感染的GFP标记CTV的能力，小的大叶来檬树首先接芽变异的病毒。作为此实验的对照组，将另外一组的植物接芽野生型CTV，参见图1，表示了野生型CTV(A)和p33删除变异结构(B)的图示。对于这两组，通过嫁接病毒感染的组织到树干上来建立初次感染。修剪上方的叶子来促使新的叶子生成。接芽后六周，通过ELISA来确认新的叶子的系统感染。然后在植物中加入第二个含有CTV-BC5/GFP的树皮组织。当嫁接愈合之后，再次修剪上方的叶子来诱导新的生长。第二次新叶子长成之后(开始于6周)，通过观察新生部分的树皮组织中的GFP荧光来确定病毒对树木的双重感染。结果野生型CTV完全地阻止了GFP表达病毒的双重感染：首次感染了CTV9R的植物中未检测到GFP荧光。相反地，首次感染了缺乏功能性p33蛋白质的变异病毒的植物都显示了GFP荧光，与没有初次感染而且只接芽了实验病毒CTV BC5/GFP的树木一样。这表明删除变异对GFP标记的CTV感染没有影响。
实施例2：前蛋白酶区域被取代的CTV结构
在一个类似的实验中，发明者检查了前蛋白酶区域(CTV基因组中核苷酸位置108-3040)被取代成T68-1基因组相应区域的杂交病毒结构，杂交结构的其余部分包含T36的序列(该结构的图示见图1(C))。T68-1表示CTV T68品系中的一个分离株。与上述实验相类似，该结构被用于初次接芽柑橘属植物，之后(通过ELISA确认以建立感染之后)再使用CTV-BC5/GFP。野生型CTV被用来初次接芽对照树木(如上述实验)。第二次接芽之后的6周，通过观察新生部分的树皮组织中的GFP荧光来确定病毒对树木的双重感染。与预期的一样，野生型CTV完全地阻止了GFP表达病毒的双重感染：首次感染了CTV9R的植物中未检测到GFP荧光。相比之下，首次感染了含有替代的前蛋白酶区域的病毒的植物都显示了GFP荧光，与没有初次感染而且只接芽了实验病毒CTV BC5/GFP的树木一样。这表明杂交病毒对GFP标记的CTV感染没有影响。
实施例3：蛋白酶区域被替代的病毒可以解除排除。最近，实验研究了前蛋白酶区域的修改是否会为病毒提供解除排除的能力。我们构造了一个杂交病毒结构，在这个病毒中，含有两个前蛋白酶L1和L2(CTV基因组中的nts位置位108-3039)的T36cDNA克隆中的一个区域被T68品系的T68-1分离株的相应区域所取代，杂交结构的其余部分则包含T36的序列(图2)。使用描述的病毒结构来再次接芽已经感染有T36CTV病毒的植物。如我们之前证明的一样，初次感染CTV分离株之后，可以完全地排除再次感染同个品系的另一个分离株。例如，感染T36品系的一个分离株可以排除再次感染T36品系的其他分离株，而且可以排除感染基于T36的GFP标记的病毒。而且，感染T36分离株可以完全排除二次感染基于T36分离株构造的杂交病毒，在这个病毒中3’基因组部分的8个基因的序列被取代(单个基因序列或者几个基因组合的序列)成T30或者T68品系分离株的相应序列。明显地，T68前蛋白酶区域被取代成T36基因组的杂交病毒被证明有一个特殊的行为：变异的病毒能够从整体上感染已经被母本T36病毒感染过的植物，而且病毒积累的水平和感染相同病毒的健康植物的病毒积累水平一样(图2；比较第4道和对照接芽的其他道)。
参考文献
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Also，see Foliminova et al.，J Virol.(2010)84：1314-1325，for disclosureon making viral constructs and using same for infection in plants.
在不与本文中的教导相矛盾的前提下，在本文中引用的任何参考文献的揭示通过完整引用结合在本发明中。需要知道此处描述的例子和实施例只是以更好地说明为目的，而且建议本领域的技术人员可由此做出各种修改或者更改，而此种修改或更改应在本发明的精神和范围之内。

Claims (3)

1.一种减轻与对柑橘属果树进行第一个和第二个具有相同CTV品系的CTV病毒载体连续接芽有关的病毒载体双重感染排除的方法，所述相同CTV品系为T36品系，所述第一个CTV病毒载体被构造成一个L1L2区域的前蛋白酶序列被来自CTV的一个T68品系的同源区域所替代，所述的方法包括：
使柑橘属果树接芽第一个CTV病毒载体；
使第一个CTV病毒载体感染柑橘属果树，从而产生首次感染的柑橘属果树，并且
使初次感染的柑橘属果树接芽第二个CTV病毒载体，而第二个CTV病毒载体进一步感染初次感染的柑橘属果树以产生一个二次感染的柑橘属果树。
2.根据权利要求1的方法，其中所述第一个和/或者第二个CTV病毒载体被构造成包括一个异源可表达序列。
3.一种T36品系的CTV病毒载体，其中所述载体被构造成其内源前蛋白酶序列被来自CTVT68品系的L1L2前蛋白酶区域所替代，并且其中所述CTV病毒载体被构造成包含一个可表达的异源序列。
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Functional Specialization and Evolution of Leader Proteinases in the Family Closteroviridae;CHIH-WEN PENG et.al.;《JOURNAL OF VIROLOGY》;20011231;第75卷(第24期);摘要、第12154页左栏第3段，第12156页TABLE3，FIG.1-4
Infection with Strains of Citrus Tristeza Virus Does Not Exclude Superinfection by Other Strains of the Virus;Svetlana Y. Folimonova et.al.;《JOURNAL OF VIROLOGY》;20100228;第84卷(第3期);摘要，第1314页右栏第1段，第1316页Table1，第1317页右栏最后1段，第1318页FIG.2
Svetlana Y. Folimonova et.al..Infection with Strains of Citrus Tristeza Virus Does Not Exclude Superinfection by Other Strains of the Virus.《JOURNAL OF VIROLOGY》.2010,第84卷(第3期),摘要，第1314页右栏第1段，第1316页Table1，第1317页右栏最后1段，第1318页FIG.2.
烟草花叶与黄瓜花叶病毒复合或重复侵染番茄后在体内TMV浓度及致病性的比较;张智惠;《北京农业大学学报》;19951231;第11卷(第3期);第305-310页

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