BRPI1101853A2 - Sistema de vetor de expressão transitória com base viral que permite múltiplas aplicações - Google Patents

Abstract

Sistema de vetor de expressão transitória com base viral que permite múltiplas aplicações. São divulgados aqui os vetores virais apropriados para transfecção em árvores troncosas para finalidades de liberação e expressão de genes benéficos. São especificamente exemplificados aqui os vetores para transfecção em árvores de citrus. Os vetores permitem a expressão de protelnas úteis, tais como aquelas que podem proteger a árvore da doença. São especificamente exemplificados aqui os métodos de transfecção em árvores troncosas que permitem múltiplas aplicações de vetores ao evitar a exclusão de superinfecção.

Description

SISTEMA DE VETOR DE EXPRESSÃO TRANSITÓRIA COM BASE VIRAL QUE PERMITE MÚLTIPLAS APLICAÇÕES

REFERÊNCIA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido é relacionado ao Pedido Provisório US N° 61/321.970; depositado em 8 de abril de 2010 e o Pedido Provisório US N° 61/440.445; depositado em 8 de fevereiro de 2011. A prioridade a tais pedidos é reivindicada sob 35 USC 119.

CAMPO DA INVENÇÃO

As modalidades primárias da invenção relacionam-se a um vetor de expressão transitória à base de vírus que expressa genes estrangeiros em árvores por longos períodos de tempo que permitirá a aplicação de um vetor similar às mesmas árvores ao mesmo tempo ou em momentos mais tarde. Outras modalidades relacionam-se às construções de vetor viral e métodos que permitem a evasão de exclusão de superinfecção, e por sua vez múltiplas aplicações de vetores.

FUNDAMENTO

Os vetores de expressão transitória à base de vírus são ferramentas rotineiras usadas em laboratórios de biologia molecular de planta no mundo inteiro para rapidamente expressar ou silenciar genes em plantas. Também podem ser ferramentas importantes na genômica de planta para selecionar sequências desconhecidas para a função. Contudo, os vetores disponíveis foram desenvolvidos de um número limitado de vírus pouco similares de plantas herbáceas. Os exemplos notáveis são os vetores baseados no vírus do mosaico do tabaco (TMV) (Dawson e col., 1989;

Donson e col., 1991; Shivprasad e col., 1999; Rabindran e Dawson, 2001). As culturas de árvore oferecem desafios especiais. Mesmo se os vetores existentes pudessem infectar as árvores, o tempo exigido para a infecção sistêmica e a análise dos genes expressos em árvores geralmente excede a estabilidade de vetores à base de virus conhecidos. Contudo, os desafios de limitações de cruzamento e as décadas exigidas para melhorar árvores extremamente aumentam a necessidade para vetores à base de vírus úteis. O vírus tristeza dos citrus (CTV) é um membro da família Closteroviridae complexa que contém os vírus com os genomas mono-, bi-, e tripartidos transmitidos por uma variedade de vetores de inseto incluindo afídios, moscas brancas, e cochonilhas pulverulentas (Bar-Joseph e col., 1979; Dolja e col., 1994; Agranovsky, 1996; Karasev, 2000). Os virions flexuosos longos (2000 nm X 10-12 nm) de CTV são encapsidados por duas proteínas de revestimento: a proteína de revestimento (CP) principal cobrindo aproximadamente 97% do virion e a proteína de revestimento menor (CPm) completando a encapsidação do outro terminal. O genoma de RNA de fita simples de CTV ê aproximadamente 19,3 kb, dividido em doze quadros de leitura abertos (ORFs) (Pappu e col., 1994; Karasev e col., 1995) (Fig. 1). ORF la codifica uma poliproteína de 349 kDa contendo dois domínios de protease tipo papaína mais domínios tipo metiltransferase e tipo helicase. A tradução da poliproteína é pensada ocasionalmente continuar através do domínio tipo polimerase (ORF lb) por um deslocamento de quadro +1. ORFs la e lb mais os terminais não traduzidos são todos exigidos para a replicação em protoplastos (Satyanarayana e col., 1999) . Dez 3' ORFs são expressos por mRNAs 3' co-terminal subgenômico (sg) (Hilf e col., 1995; Karasev e col., 1997).

Além das duas proteínas de revestimento, p65 (homólogo HSP70) e p61 são exigidas para a montagem de vlrion eficiente, e são necessárias para a passagem do virus de protoplasto a protoplasto a fim de amplificar o inóculo para a infecção das árvores de citrus (Satyanarayana e col., 2000) . A proteína p6 é necessária para a infecção de plantas como são as proteínas p20 e p23, as quais juntas com CP, são supressores de silenciamento de RNA (Lu e col., 2004). CTV pode infectar e se mover através de algumas variedades de citrus com alguns dos genes virais deletados. CTV contém cinco genes, p6, p33, pl8, pl3, e p20, na metade 3' do genoma que não são exigidos para a replicação ou formação de vírions. p33, pl8 e pl3 não são conservados entre outros membros deste grupo de vírus, e foram propostos por terem evoluído para interações específicas com o hospedeiro citrus. Descobrimos que as deleções dentro de p33, pl8 ou pl3 ORF individualmente resultaram em nenhuma perda significativa da habilidade do vírus para infectar, multiplicar, e se espalhar através das árvores de citrus (Tatineni e col., 2008). Além disso, as deleções nos genes p33, pl8 e pl3 em todas as combinações possíveis incluindo deleções em todos três genes permitiram o vírus sistematicamente invadir as árvores de citrus. As variantes de CTV marcadas de proteína fluorescente verde com deleções no ORF p33 ou ORFs p33, pl8 e pl3 demonstraram que o movimento e a distribuição destes mutantes de deleção eram similares aos do vírus tipo selvagem. A exclusão de superinfecção ou interferência de homólogo é um fenômeno em que uma infecção viral preexistente previne uma infecção secundária com o mesmo ou vírus estreitamente relacionado, visto que a infecção por vírus não relacionados pode ser não afetada. O fenômeno foi primeiramente observado por McKinney (McKinney, 1926; 1929) entre dois genótipos de vírus do mosaico do tabaco (TMV) e mais tarde com bacteriófagos (Dulbecco, 1952; Visconti, 1953). Desde então, o fenômeno foi observado frequentemente para vírus de animais (Adams e Brown, 1985; Bratt e Rubin, 1968; Delwart e Panganiban, 1989; Geib e col., 2003; Johnston e col., 1974; Karpf e col., 1997; Lee e col., 2005; Singh e col., 1997; Steck e Rubin, 1966; Strauss e Strauss, 1994; Whitaker-Dowling e col., 1983; Wildum e col., 2006) e plantas (Bennett, 1951; Fulton, 1978; Gal-On e Shiboleth, 2005; Hull e Plaskitt, 1970; Hull, 2002; Lecoq e col., 1991; Salaman, 1933; Walkey e col., 1992). Na virologia de planta, a interferência de homólogo foi usada inicialmente como um teste de parentesco de vírus para definir se dois isolados de vírus eram cepas do mesmo vírus ou vírus diferentes representados (McKinney, 1929; Salaman, 1933). Subsequentemente, foi desenvolvido em uma ferramenta de gestão para reduzir as perdas de cultura ao propositadamente infectar plantas com isolados suaves de um vírus para reduzir a infecção e perdas devido aos isolados mais severos, que é referido como "proteção cruzada" (revisto em Gal-On e Shiboleth, 2005 e Hull, 2002) .

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS FIG.l (A) : Diagrama esquemático da organização de genoma do tipo selvagem CTV T3 6 (T3 6 CTV9R) . (B) e (C) : representação esquemática da construção de CTV delta p33 e de construção híbrida com a substituição da região de proteases lider, respectivamente. As caixas abertas representam ORFs e seus produtos de tradução. PRO, domínio de protease tipo papaina; MT, metiltransferase; HEL, helicase; RdRp, uma RNA polimerase dependente de RNA; HSP70h, HSP70 homólogo; CPM, proteína de revestimento menor; CP, proteína de revestimento principal. A caixa negra indica a sequência T68-1 substituída dentro do genoma T36, respectivamente. A seta mostra a posição da deleção de ORF p33. (B) Delta P33 T36CTV9R e (C) Construções híbridas Y36/T68 com substituições de proteases líderes. FIG. 2: Esquema do vírus híbrido com a substituição da região de proteases do isolado T68-1 (caixa negra) no genoma T36. (Híbrido T36/T68 com a susbtituição de proteases líderes (LlL2h)) Abaixo: Detecção da multiplicação de vírus em plantas infectadas com o isolado T36 ou com o híbrido LlL2h sozinho (faixas 2, 3) ; a faixa 4 demonstra a multiplicação de LlL2h em plantas pré-infectadas com T36. A amplificação de vírus foi analisada através da reação de PCR de transcrição reversa com os 2 conjuntos de primers em cada mistura de reação: um conjunto específico à região de proteases de T36, o outro: a região de proteases de T68 para discriminar entre T36 e LlL2h.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Os vírus tendem a prevenir a superinfecção por vírus relacionados. A adição de um vetor transitório à base de vírus normalmente preveniría a aplicação daquele ou um vetor relacionado âs mesmas árvores. Os inventores também descobriram agora que há ocasiões em que seria valioso ter a habilidade de adicionar o vetor ao organismo alvo (por exemplo, árvore ou planta) após tal organismo alvo já ter sido infectado com um vetor similar. Por exemplo, veio à atenção dos inventores que seria valioso ser capaz de adicionar vetores se o vetor em uma planta perdeu o gene estrangeiro sendo expresso; se um gene mais benéfico foi encontrado por expressar em árvores; e/ou se mais de um gene precisa ser expresso. Também, veio à realização dos inventores que é desejoso ser capaz de administrar um vetor de cepa viral a uma planta já infectada com um tipo selvagem dessa cepa. Os inventores descobriram que as modificações direcionadas dentro de determinadas porções de um vetor viral podem evitar o fenômeno de exclusão de superinfecção. São descritas aqui para determinadas modalidades da invenção as construções de virus projetadas baseadas no vírus de tristeza dos citrus (CTV), um closterovirus de RNA senso positivo, que são capazes de superinfecção em plantas que foram infectadas com um vírus de uma cepa similar. Os inventores descobriram que as construções de vírus projetadas através da modificação do vírus de CTV tipo selvagem, tal como contêm uma protease líder substituída com uma sequência de protease líder de cepa viral diferente são capazes de superar a exclusão de superinfecção.

De acordo com outras determinadas modalidades, a invenção pertence às construções de vírus projetadas baseadas no vírus tristeza dos citrus (CTV), um closterovirus de RNA senso positivo, que são capazes de permitir a superinfecção da construção de vírus â base de CTV introduzida subsequente. Os inventores descobriram que as construções de vírus projetadas através da modificação do vírus de CTV tipo selvagem, tal como faltam o gene para a proteína p33 funcional falha em fornecer a proteção contra a infecção de vírus tipo selvagem. Quando a construção de vírus faltando a proteína p33 e o CTV tipo selvagem foram usados para a inoculação de planta sequencial, a infecção primária de plantas com a construção de vírus de mutante de deleção não teve nenhum efeito visível no estabelecimento da infecção secundária pelo vírus tipo selvagem. Assim, a deleção do ORF p33 resultou em uma variante "proteção não cruzada" de CTV.

Previamente, os inventores examinaram relações entre genótipos diferentes de vírus tristeza dos citrus (CTV) em termos de sua habilidade de prevenir a superinfecção por outro isolado do vírus. Eles mostraram que a exclusão de superinfecção ocorreu somente entre isolados da mesma cepa de CTV. Quando os isolados da mesma cepa foram usados para a inoculação de planta sequencial, a infecção primária forneceu a exclusão completa do isolado de desafio. Um dos exemplos de proteção cruzada completa entre os vírus de CTV notados foi a inibição total da infecção de CTV expressando GFP em plantas pré-infectadas com CTV do tipo selvagem pertencendo a mesma cepa T36.

De acordo com uma modalidade, os inventores examinaram a exclusão de superinfecção das construções de vírus projetadas baseadas no clone de cDNA infeccioso de cepa T36 de CTV. Mostrou-se que as construções de vírus projetadas através da modificação do vírus de CTV tipo selvagem, tal como a falta do gene para a proteína p3 3 funcional ou contendo uma substituição da região de protease líder de outra cepa de CTV (T68) , falham em fornecem a exclusão de superinfecção da infecção de vírus tipo selvagem. Quando qualquer uma dessas construções de vírus foi usada para a inoculação inicial de árvores de citrus seguida pela inoculação de planta sequencial com o CTV tipo selvagem, a infecção primária de plantas com as construções de vírus mutante não teve nenhum efeito visível no estabelecimento da infecção secundária pelo vírus tipo selvagem. Assim, a deleção da ORF p33 assim como a substituição da região de protease líder resultou em variantes de "proteção não cruzada" de CTV. Essas construções podem potencialmente ser usadas como vetores para árvores que permitem múltiplas aplicações.

Em outra modalidade, a invenção pertence a uma construção de vetor viral, em que a construção é projetada para ter uma protease líder de um isolado de uma cepa diferente de uma espécie viral comum substituída para a protease líder endógena do vetor viral. As cepas de CTV são definidas como linhagens filogeneticamente distintas dos vírus baseados na análise de sequências de nucleotídeo da ORF la (Hilf e col. , 2005) . Usando esta definição, T36 e T68 são designadas como cepas. As amostras de vírus individuais são designadas como isolados de uma destas cepas. Cada cepa é nomeada após um "tipo isolado" e é composta de isolados com a divergência de sequência menor do tipo membro. Em uma modalidade mais específica, o vetor viral é um isolado de CTV que substituiu no mesmo uma sequência de protease líder de um isolado de uma cepa diferente de CTV. Em uma modalidade ainda mais específica, o vetor de CTV é projetado baseado no isolado de cepa T3 6 em que sua sequência de protease líder é substituída por uma sequência de protease líder de um isolado da cepa de CTV T68. Em uma modalidade mais específica, a sequência de protease substituída é um domínio de protease tipo papaína.

De acordo com outra modalidade, as invenções pertencem a um método de aliviar a exclusão de superinfecção de vetores virais de CTV causada por inoculações sucessivas de vírus. O método inclui a inoculação de uma planta alvo com um primeiro vetor viral de CTV tendo um ORF p33 omitido ou interrompido, permitindo o primeiro vetor viral de CTV infectar a planta alvo, desse modo para produzir uma planta infectada, e então subsequentemente inocular a planta infectada com um segundo vetor viral de CTV que compreende ou não compreende um gene p33 ou gene p3 3 interrompido. O segundo vetor viral de CTV é permitido infectar a planta já pré-infectada. Em uma modalidade específica, a planta alvo é uma árvore de citrus. Em outra modalidade específica, o primeiro e/ou segundo vetor de CTV é projetado para incluir uma sequência expressível codificando uma proteína heteróloga.

De acordo com outra modalidade, as invenções pertencem a um método de aliviar a exclusão de superinfecção de vetores virais causados por inoculações sucessivas de vírus. O método inclui sucessivamente inocular um organismo alvo com um primeiro e segundo vetor viral. O primeiro vetor viral é projetado tal que uma sequência de protease líder é modificada pela substituição com uma sequência de protease líder cognata de um isolado de outra cepa de CTV. Em uma modalidade específica, o primeiro e segundo vetores virais são derivados de uma espécie viral comum. Em uma modalidade ainda mais específica, o primeiro e segundo vetores virais contêm as regiões de protease lider dos isolados de cepas diferentes de CTV. Em uma modalidade específica, o organismo alvo é uma planta, e em modalidades ainda mais específicas uma árvore, e em modalidades ainda mais específicas, uma árvore de citrus. Em outra modalidade específica, o primeiro e/ou segundo vetor de CTV é projetado para incluir uma sequência expressível codificando uma proteína heteróloga.

Os inventores perceberam que há ocasiões em que seria valioso ter a habilidade de adicionar o vetor ao organismo alvo (por exemplo, árvore ou planta) após tal organismo alvo já ter sido infectado com um vetor similar. Por exemplo, veio à atenção dos inventores que seria valioso ser capaz de adicionar vetores se o vetor em uma planta perdeu o gene estrangeiro sendo expresso; se um gene mais benéfico foi descoberto por expressar em árvores; e/ou se mais de um gene precisa ser expresso. Também, veio à percepção dos inventores que é desejoso poder administrar um vetor de cepa viral a uma planta já infectada com um tipo selvagem dessa cepa. Consequentemente, os inventores descobriram que as modificações direcionadas dentro de determinadas porções de um vetor viral podem evitar o fenômeno de exclusão de superinfecção.

Os inventores descobriram que as construções de vírus projetadas através da modificação do vírus de CTV tipo selvagem,, tal como contendo uma protease líder substituída com uma sequência de protease líder da cepa viral diferente, podem superar a exclusão de superinfecção.

As relações entre genótipos diferentes de vírus tristeza dos citrus (CTV) em termos de sua habilidade para prevenir a superinfecção por outro isolado do vírus foram examinados. Mostrou-se que a exclusão de superinfecção ocorreu somente entre os isolados da mesma cepa de CTV. Quando os isolados da mesma cepa foram usados para a inoculação de planta sequencial, a infecção primária forneceu a exclusão total do isolado de desafio. Um dos exemplos de proteção cruzada completa entre os vírus de CTV notados foi a inibição total da infecção de CTV expressando GFP em plantas pré-infectadas com o CTV tipo selvagem pertencendo à mesma cepa T36 (Folimonova e col., 2010).

De acordo com uma modalidade, os inventores examinaram a exclusão de superinfecção de construções de vírus projetadas baseadas no clone de cDNA infeccioso da cepa T36 de CTV. Mostrou-se que as construções de vírus projetadas através da modificação do vírus de CTV tipo selvagem, tal como contêm a substituição da região de protease L1L2 com uma sequência cognata de uma cepa viral diferente, permite o vetor viral projetado evitar a exclusão de superinfecção mesmo em plantas já infectadas com a mesma cepa do vírus. Consequentemente, as modalidades de vetor viral da presente invenção podem ser utilizadas como vetores para as árvores pré-infectadas com o vírus da mesma cepa, tal como as árvores crescidas no campo que se tornaram infectadas através da transmissão natural do vírus ou as árvores que se tornaram infectadas como um resultado de uma aplicação antecipada de um vetor de CTV projetado baseado na mesma cepa de vírus, para evitar a exclusão da infecção secundária de vetor viral.

Em outra modalidade, a invenção pertence a uma construção de vetor viral, em que a construção é projetada para ter uma protease líder de um isolado de uma cepa diferente de uma espécie viral comum substituída pela protease lider endógena do vetor viral. As cepas de CTV são definidas como linhagens filogeneticamente distintas do vírus baseado na análise de sequências de nucleotideo da ORF la (Hilf e col., 2005). Usando esta definição, T36 e T68 são designadas como cepas. As amostras de vírus individuais são designadas como isolados de uma destas cepas. Cada cepa é nomeada após um "tipo isolado" e é composta de isolados com menor divergência de sequência do tipo membro. Em uma modalidade mais específica, o vetor viral é um isolado de CTV que substituiu no mesmo uma sequência de protease líder de um isolado de uma cepa diferente de CTV. Em uma modalidade ainda mais específica, o vetor de CTV é projetado baseado no isolado da cepa T36 em que sua sequência de protease líder é substituída por uma sequência de protease líder de um isolado da cepa de CTV T68. Em uma modalidade mais específica, a sequência de protease substituída é o domínio L1L2.

De acordo com outra modalidade, a invenção pertence a um método de aliviar a exclusão de superinfecção de vetores virais de CTV causados por inoculações sucessivas de vírus. Em uma modalidade específica, o método pode incluir a inoculação de uma planta alvo com um primeiro vetor viral de CTV projetado baseado em uma primeira cepa de CTV, permitindo ao primeiro vetor viral de CTV infectar a planta alvo desse modo para produzir uma planta infectada, e então subsequentemente inocular a planta infectada com um segundo vetor viral de CTV construído baseado na mesma cepa de CTV, mas que foi modificado para incluir uma sequência de protease líder de uma cepa diferente (segunda) do vírus. O segundo vetor viral de CTV pode também incluir um gene de interesse que expressa uma proteína pretendida conseguir um efeito benéfico. Em uma modalidade específica, a primeira cepa é T36 e a segunda cepa é T68. O segundo vetor viral de CTV é permitido infectar a planta já pré-infectada. Em uma modalidade específica, a planta alvo é uma árvore de citrus. Em outra modalidade específica, o primeiro e/ou segundo vetor de CTV é projetado para incluir uma sequência expressível codificando uma proteína heteróloga.

De acordo com outra modalidade, as invenções pertencem a um método de aliviar a exclusão de superinfecção de vetores virais. O método inclui a inoculação de um organismo alvo com um vetor viral de uma cepa que já infectou o organismo alvo. O segundo vetor viral é projetado tal que uma sequência de protease líder é modificada por substituição com uma sequência de protease líder cognata de um isolado de outra cepa de CTV. Em uma modalidade específica, o primeiro e segundo vetores virais são derivados de uma espécie viral comum. Em uma modalidade ainda mais específica, o primeiro e segundo vetores virais contêm regiões de protease líder dos isolados de cepas diferentes de CTV. Em uma modalidade mais específica, a sequência de protease líder compreende um fragmento de uma sequência de protease líder total compreendendo 800 pares de base (pb) ou menos, 700 pb ou menos, 600 pb ou menos, 5 00 pb ou menos, 4 00 pb ou menos, 30 0 pb ou menos, 20 0 pb ou menos, ou 100 pb ou menos. Alternativamente, o vetor compreende pelo menos 100 pb, 200 pb, 300pb, 400 pb, ou 500 pb de fragmento de uma sequência de protease líder total.

Uma descrição não limitante de exemplos das sequências de protease lider conhecidas é discutida na seção de referências abaixo. Em uma modalidade especifica, o organismo alvo é uma planta, e em modalidades ainda mais especificas uma árvore, e em modalidades ainda mais especificas, uma árvore de citrus. Em outra modalidade especifica, o primeiro e/ou segundo vetor de CTV é projetado para incluir uma sequência expressivel codificando uma proteina heteróloga.

Como usado aqui, uma espécie de virus é uma população de vírus com características similares mais que infecta a mesma (ou quase) variedade de espécie hospedeira. Referência à(s) "cepa(s) viral(s)", se refere a um vírus classificado sob uma espécie, tal como CTV, ou outras espécies virais, mas que possuem sequências de gene, ou alguma outra característica, que são identificáveis diferentes de outro vírus classificado sob a mesma espécie. EXEMPLOS: EXEMPLO 1: CONSTRUÇÃO de DELTA P33 CTV

Os inventores examinaram diversas construções de vírus todas contendo a deleção da ORF p33 que foram projetadas previamente baseadas no clone de cDNA infeccioso do CTV T36 (Tatineni e col., 2008) para sua habilidade para prevenir a superinfecção do CTV expressando GFP. Aqueles mutantes de deleção foram mostrados por poderem multiplicar em e sistematicamente invadir árvores da maioria de variedades de citrus (Tatineni e col., 2008). Para avaliar o efeito de uma infecção primária de uma planta hospedeira com o mutante de deleção p33 de CTV na habilidade do CTV marcado de GFP para estabelecer a superinf ecção no mesmo hospedeiro, as árvores pequenas de Citrus macrophylla. foram primeiramente inoculadas com o virus mutante. Como um controle para este experimento, outro conjunto de plantas foi inoculado com o CTV tipo selvagem, visto na FIG. 1 que mostra uma representação esquemática do CTV tipo selvagem (A) e a construção de mutante de deleção p33 (B) . Para ambos conjuntos, as infecções primárias foram estabelecidas ao enxertar o tecido infectado por virus no tronco das árvores. As folhas superiores foram aparadas para forçar o crescimento de um novo conjunto de folhas. Em seis semanas após a inoculação, as infecções sistêmicas das novas folhas foram confirmadas por ELISA. As plantas foram então desafiadas ao inserir um segundo enxerto de tecido de casca contendo o CTV-BC5/GFP. Quando o enxerto curou, as folhas superiores foram aparadas novamente para induzir outro novo rebento de crescimento. Após o desenvolvimento do segundo conjunto de novas folhas (começando aproximadamente 6 semanas) a habilidade do virus desafiante âs árvores de superinfecção foi determinada por observação visual de fluorescência de GFP no tecido de casca do novo rebento. Como resultado, o CTV tipo selvagem preveniu completamente a superinfecção pelo virus expressando GFP: nenhuma fluorescência de GFP foi detectada em plantas primariamente infectadas com o CTV9R. Em contraste, as plantas que tiveram infecções primárias com o virus mutante faltando a proteína p33 funcional todas exibiram a fluorescência de GFP similar à observada em plantas que não tiveram nenhuma infecção primária e foram inoculadas somente com o vírus de desafio CTV-BC5/GFP, indicando que o mutante de deleção não teve nenhuma interferência com a infecção pelo CTV marcado de GFP.

EXEMPLO 2: CONSTRUÇÃO DE CTV COM SUBSTITUIÇÃO DA

REGIÃO DE PROTEASES LÍDER

Em um experimento similar, os inventores examinaram as construções de vírus híbridas em que a região de proteases líderes (posições de nucleotídeo 108-3040 no genoma de CTV) foi substituída com a região correspondente do genoma T68-1, enquanto o resto da construção híbrida continha a sequência de T36 (a representação esquemática da construção é dada na FIG. 1 (Ο) . T68-1 representa um isolado da cepa T68 de CTV. Similarmente ao experimento descrito acima, a construção foi usada para a inoculação inicial de plantas de citrus, que mais tarde (sob confirmação do estabelecimento da infecção por ELISA) foram desafiadas com CTV-BC5/GFP. O CTV tipo selvagem foi usado para a inoculação primária das árvores de controle (como no experimento acima). Começando em 6 semanas após a inoculação de desafio a habilidade do vírus desafiante de superinfectar árvores foi determinada pela observação visual de fluorescência de GFP no tecido de casca do novo rebento. Como foi esperado, o CTV tipo selvagem completamente preveniu a superinfecção pelo vírus expressando GFP: nenhuma fluorescência de GFP foi detectada em plantas primariamente infectadas com o CTV9R. Em contraste, as plantas que tiveram infecções primárias com o vírus híbrido carregando a substituição da região de protease líder mostraram a fluorescência de GFP similar à observada em plantas que não tiveram nenhuma infecção primária e foram inoculadas somente com o vírus de desafio CTV-BC5/GFP, indicando que este vírus híbrido não teve nenhuma interferência com infecção pelo CTV marcado de GFP.

EXEMPLO 3 : O VÍRUS COM A SUBSTITUIÇÃO DA REGIÃO DE PROTEASE SUPERA A EXCLUSÃO.

Recentemente, foi examinado se a modificação da região de proteases lideres fornecería a habilidade do virus de superar a exclusão. Projetamos uma construção de virus hibrida em que uma região no clone de cDNA T3 6 contendo duas proteases líderes LI e L2 (posições nts 108-3039 no genoma de CTV) foi substituída com a região correspondente do genoma de isolado T68-1 da cepa T68, enquanto o resto da construção híbrida continha a sequência de T36 (Fig. 2). A construção de vírus descrita foi usada para a inoculação desafio de plantas primárias infectadas com o vírus de CTV T36 progenitor. Como demonstrado anteriormente, a infecção primária com um isolado de CTV completamente exclui a infecção com outro isolado da mesma cepa. Por exemplo, a infecção com um isolado da cepa T3 6 excluiu a infecção secundária com outros isolados da cepa T36 assim como excluiu a infecção com o vírus marcado de GFP baseado em T36. Além disso, a infecção com o isolado de T36 inteiramente excluiu as infecções secundárias pelos vírus híbridos construídos baseados no isolado de T36 em que as sequências de 8 genes na metade 3' do genoma foram substituídas (sequências de genes individuais ou diversos genes em combinações) com as sequências correspondentes dos isolados das cepas T30 ou T68 . Notavelmente, o vírus híbrido com a região de proteases líderes T68 substituída no genoma T36 demonstrou um comportamento único: o vírus mutante foi capaz de sistematicamente infectar as plantas pré-infectadas com o vírus T36 progenitor, mostrando níveis de acumulação de vírus similares aos níveis do mesmo vírus quando inoculado em plantas saudáveis (Fig. 1; compare a faixa 4 âs outras faixas das inoculações de controle).

REFERÊNCIAS

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Também, veja Foliminova e col., J Virol. (2010) 84:1314-1325, para divulgação da fabricação de construções virais e usando as mesmas para infecção em plantas.

Os ensinamentos das referências mencionadas através do relatório descritivo são incorporados aqui em sua totalidade por esta referência à extensão que não são inconsistentes com os ensinamentos aqui. Deve-se compreender que os exemplos e as modalidades descritas aqui são para finalidades ilustrativas somente e que várias modificações ou mudanças em luz das mesmas serão sugeridas âs pessoas hábeis na técnica e devem ser incluídas dentro do conceito inventivo e escopo deste pedido.

Claims (29)

1. Método de aliviar a exclusão de superinfecção de vetores virais de CTV associados com as transfecções sucessivas de vírus a uma planta alvo, o referido método caracterizado por compreender: inocular a planta alvo com um primeiro vetor viral de CTV tendo um gene p33 omitido do mesmo ou interrompido de outra maneira; permitir o primeiro vetor viral de CTV infectar a planta alvo desse modo para produzir uma planta primeiramente infectada, e inocular a planta primeiramente infectada com um segundo vetor viral de CTV que compreende ou não compreende um gene p3 3 ou gene p33 interrompido, por meio de que o segundo vetor viral de CTV adicionalmente infecta a planta primariamente infectada para produzir uma planta secundariamente infectada.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida planta alvo é uma arvore de citrus.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro e/ou segundo vetor de CTV é projetado para incluir uma sequência expressível codificando uma proteína heteróloga.

4. Método de aliviar a exclusão de superinfecção de vetores virais associados com sucessivamente inocular um organismo alvo com um primeiro e segundo vetor viral, o primeiro vetor viral projetado para ter uma sequência de protease líder de outra cepa de CTV substituída no mesmo, o referido método caracterizado por compreender: inocular o organismo alvo com o primeiro vetor viral; permitir o primeiro vetor viral infectar o organismo alvo desse modo para produzir um organismo primeiramente infectado, e inocular o organismo primeiramente infectado com o segundo vetor viral, em que o segundo vetor viral adicionalmente infecta o organismo primeiramente infectado para produzir um organismo secundariamente infectado.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido organismo alvo é uma planta.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido organismo alvo é uma árvore.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido organismo alvo é uma árvore de citrus.

8. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que os referidos primeiro e segundo vetores virais são projetados para conter regiões de protease lider de cepas diferentes de uma espécie viral comum.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida espécie viral comum é CTV.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido primeiro vetor viral é projetado baseado na cepa T36 de CTV.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido segundo vetor viral é projetado baseado na cepa T3 6 de CTV em que a região de protease lider foi substituída com uma região cognata de um isolado de cepa T68 de CTV.

12. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido primeiro e/ou segundo vetor viral é projetado para incluir uma sequência expressível codificando uma proteína heteróloga.

13. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de protease lider codifica a protease tipo papaína.

14. Vetor viral caracterizado por ser projetado para ter uma protease lider de uma cepa diferente de uma espécie viral comum substituído para uma sequência de protease líder endógena, e sendo ainda projetado para compreender uma sequência expressível codificando uma proteína heteróloga.

15. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o referido vetor viral é uma cepa de CTV que tem substituída na mesma uma sequência de protease líder de uma cepa diferente de CTV.

16. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a cepa de CTV é T3 6 em que sua sequência de protease líder é substituída por uma sequência de protease líder de uma cepa de CTV T68.

17. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a sequência de protease substituída é o domínio de protease tipo papaína.

18. Método de aliviar a exclusão de superinfecção de vetores virais associados com as transfecções sucessivas de vírus em uma planta alvo previamente infectada com uma primeira cepa viral, o referido método caracterizado por compreender: inocular a planta pré-infectada com um vetor viral da referida primeira cepa viral, o referido vetor viral compreendendo uma construção que compreende uma sequência de protease de uma segunda cepa viral e que compreende uma proteína heteróloga de interesse, em que o vetor viral adicionalmente infecta a planta primariamente infectada para produzir uma planta secundariamente infectada.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a referida proteína heteróloga de interesse é expressa na referida planta secundariamente infectada.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o referido vetor viral é CTV.

21. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a referida planta alvo é uma árvore de citrus.

22. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a referida primeira cepa viral é T36.

23. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a referida segunda cepa viral é T68.

24. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de protease é uma sequência de protease líder de uma região cognata da segunda cepa viral.

25. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de protease é uma sequência do dominio L1L2.

26. Vetor viral caracterizado por ser projetado para ter uma protease lider de uma cepa diferente de uma espécie viral comum substituída por uma sequência de protease líder endógena, e sendo ainda projetado para compreender uma sequência expressível codificando uma proteína heteróloga.

27. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o referido vetor viral é um isolado de uma cepa de CTV que tem substituída na mesma uma sequência de protease líder de uma cepa diferente de CTV.

28. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a cepa de CTV é T36 em que sua sequência de protease líder é substituída por uma sequência de protease líder de uma cepa de CTV T68.

29. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a sequência de protease substituída é do domínio L1L2.