ES2477141B2

ES2477141B2 - Sistema basado en un vector viral de expresión transitoria que permite múltiples aplicaciones

Info

Publication number: ES2477141B2
Application number: ES201290074A
Authority: ES
Inventors: O. DAWSON William; Svetlana FOLIMONOVA
Original assignee: University of Florida; University of Florida Research Foundation Inc
Current assignee: University of Florida; University of Florida Research Foundation Inc
Priority date: 2010-04-08
Filing date: 2011-04-08
Publication date: 2015-02-23
Anticipated expiration: 2031-04-08
Also published as: WO2011127340A3; BRPI1101853A2; CN102933713B; CN102933713A; CN105087638B; ES2477141A2; CN105087638A; ES2477141R1; WO2011127340A2; ZA201208259B

Abstract

Sistema basado en un vector viral de expresión transitoria que permite múltiples aplicaciones.#Se describen unos vectores virales adecuados para su transfección en árboles leñosos con el fin de transportar y expresar genes beneficiosos. Se ejemplifican específicamente vectores para transfectar árboles de cítricos. Los vectores permiten la expresión de proteínas útiles, tales como aquellas que pueden proteger a los árboles de enfermedades. Se ejemplifican específicamente métodos para transfectar plantas leñosas que permiten múltiples aplicaciones de los vectores mientras se evita la exclusión de la superinfección.

Description

DESCRIPCIÓN

Sistema basado en un vector viral de expresión transitoria que permite múltiples aplicaciones.

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS 5

Esta solicitud se relaciona con la solicitud de patente norteamericana provisional nº US 81/321.970, presentada el 8 de abril de 2010 y con la solicitud de patente norteamericana provisional nº 81/440.445, presentada el 8 de febrero de 2011. Se reivindica la prioridad de dichas solicitudes en base a la norma 35 USC 119. 10

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Realizaciones principales de la invención se refieren a un vector de expresión transitoria basado en un virus que expresa genes foráneos en los árboles durante largos períodos de tiempo que permitirán la aplicación de 15 un vector similar a los mismos árboles al mismo tiempo o en tiempos posteriores. Otras realizaciones se refieren a construcciones de vectores virales y a métodos que permiten evitar la exclusión de la superinfección, y, a su vez, a múltiples aplicaciones de los vectores.

ANTECEDENTES 20

Los vectores de expresión transitoria basados en virus son herramientas habituales utilizadas en los laboratorios de biología molecular de plantas en todo el mundo para la expresión rápida o el silenciamiento de genes en las plantas. También pueden ser importantes herramientas en genómica de plantas para seleccionar secuencias desconocidas para la función. Sin embargo, los vectores disponibles se han 25 desarrollado a partir de un número limitado de virus bastante similares de plantas herbáceas. Ejemplos notables son los vectores basados en el virus del mosaico del tabaco (TMV) (Dawson et al., 1989; Donson et al., 1991; Shivprasad et al., 1999; Rabindran & Dawson, 2001). Los cultivos arbóreos presentan retos especiales. Incluso si los vectores existentes pudieran infectar árboles, el tiempo requerido para la infección sistémica y el análisis de los genes expresados en los árboles generalmente exceden la estabilidad de los 30 vectores conocidos basados en virus. Sin embargo, los retos de las restricciones de reproducción y las décadas requeridas para mejorar los árboles aumentan enormemente la necesidad de desarrollar vectores útiles basados en virus.

El virus de la tristeza de los cítricos (CTV) es un miembro de la familia compleja Closteroviridae que contiene 35 virus con genomas mono-, bi-y tri-partitos transmitidos por una amplia gama de insectos vectores, incluyendo áfidos, moscas blancas y cochinillas (Bar-Joseph et al., 1979; Doija et al., 1994; Agranovsky, 1996; Karasev, 2000). Los viriones largos flexuosos (2000 nm x 10-12 nm) de CTV están encapsidados por dos proteínas de cubierta: la proteína de la cubierta mayoritaria (CP), que cubre aproximadamente el 97% del virión y la proteína de cubierta minoritaria (CPm) que completan la encapsidación del otro extremo. El genoma de ARN 40 monocatenario de CTV es de aproximadamente 19,3 kb, dividido en doce marcos de lectura abiertos (ORFs) (Pappu et al., 1994; Karasev et al. 1995) (Fig. 1). El ORF 1a codifica una poliproteína de 349 kDa que contiene dos dominios de proteasa de tipo papaína más unos dominios de tipo metiltransferasa y helicasa. La traducción de la poliproteína se cree que ocasionalmente continúa a través del dominio de tipo polimerasa (ORF 1 b) por un desplazamiento del marco +1. Los ORFs 1a y 1b más los extremos no traducidos son todo 45 lo que se requiere para la replicación en protoplastos (Satyanarayana et al., 1999). Diez 3’ ORFs se expresan mediante ARNm 3’ co-terminal subgenómicos (sg) (Hilf et al., 1995; Karasev et al., 1997). Además de las dos proteínas de la cubierta, p65 (homólogo de HSP70) y p61 son necesarios para un ensamblaje eficiente del virión, y son necesarios para el paso del virus de un protoplasto a otro protoplasto con el fin de amplificar el inóculo para la infección de los árboles de cítricos (Satyanarayana et aI., 2000). La proteína p6 es necesaria 50 para la infección de las plantas así como las proteínas p20 y p23, que junto con CP, son supresores del silenciamiento del ARN (Lu et al., 2004).

CTV puede infectar y moverse a lo largo de algunas variedades de cítricos con algunos de los genes virales delecionados. CTV contiene cinco genes, p6, p33, p18, p13, y p20, en la mitad 3’ del genoma que no son 55 necesarios para la replicación o la formación de viriones. p33, p18 y p13 no están conservadas entre otros miembros de este grupo de virus, y se ha propuesto que han evolucionado para interacciones específicas con el cítrico hospedador. Hemos encontrado que deleciones dentro de los ORFs de p33, p18 o p13, individualmente, no dieron lugar a una pérdida significativa de la capacidad del virus para infectar, multiplicarse y propagarse a través de los árboles de cítricos (Tatineni et al., 2008). Además, las deleciones 60 en los genes p33, p18 y p13 en todas las combinaciones posibles, incluyendo deleciones en los tres genes, permitió al virus invadir sistémicamente árboles de cítricos. Variantes de CTV marcados con la proteína fluorescente verde con deleciones en el ORF de p33 o en los ORFs de p33, p18 y p13 pusieron de manifiesto que el movimiento y la distribución de estos mutantes de deleción fueron similares a los del virus de tipo silvestre. 65

La exclusión de la superinfección o interferencia homóloga es un fenómeno en el que una infección viral preexistente previene de una infección secundaria con el mismo virus o con un virus estrechamente relacionado, mientras que la infección por virus no relacionados puede no verse afectada. El fenómeno fue observado por primera vez por McKinney (McKinney, 1926; 1929) entre dos genotipos del virus del mosaico del tabaco (TMV) y más tarde con bacteriófagos (Dulbecco, 1952; Visconti, 1953). Desde entonces, el 5 fenómeno se ha observado con frecuencia en virus de animales (Adams & Brown, 1985; Bratt & Rubin, 1988; Delwart & Panganiban, 1989; Geib et al., 2003; Johnston et al., 1974; Karpf et al., 1997; Lee et al., 2005; Singh et al., 1997; Steck & Rubin, 1988; Strauss & Strauss, 1994; Whitaker-Dowling et al., 1983; Wildum et al., 2008) y plantas (Bennett, 1951; Fulton, 1978; Gai-On & Shiboleth, 2005; Hull & Plaskitt, 1970; Hull, 2002; Lecoq et al., 1991; Salaman, 1933; Walkey et al., 1992). En virología vegetal, se utilizaron inicialmente las 10 interferencias homólogas como una prueba de la relación de un virus para definir si dos aislados virales eran “cepas” del mismo virus o constituían virus diferentes(McKinney, 1929; Salaman, 1933). Posteriormente, se convirtió en una herramienta de gestión para reducir las pérdidas de los cultivos infectando las plantas deliberadamente con aislados suaves de un virus para reducir la infección y las pérdidas debidas a aislados más severos, los que se conoce como “protección cruzada” (revisado por Gal-On & Shiboleth, 2005 y Hull, 15 2002).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIG.1. (A) Representación esquemática de la organización del genoma de CTV T36 de tipo silvestre (T36 20 CTV9R). (B) y (C) Representación esquemática de la construcción delta p33 CTV y de la construcción híbrida con la sustitución de la región líder de las proteasas, respectivamente. Las cajas abiertas representan ORFs y sus productos de traducción. PRO, dominio de proteasa de tipo papaína; MT, metiltransferasa; HEL, helicasa; RdRp, una ARN polimerasa dependiente de ARN; HSP70h, homólogo de HSP70; CPm, proteína de cubierta minoritaria; CP, proteína de cubierta mayoritaria. El recuadro negro indica la secuencia de T68-1 sustituida 25 dentro del genoma de T36, respectivamente. La flecha muestra la posición de la deleción del ORF de p33.

FIG. 2. Esquema del virus híbrido con la sustitución de la región de las proteasas del aislado T68-1 (recuadro negro) en el genoma de T36. Abajo: La detección de la multiplicación del virus en plantas infectadas con el aislado T36 o con el híbrido solo L1L2h (carriles 2, 3); el carril 4 muestra la multiplicación de L1L2h en plantas 30 previamente infectadas con T36. La amplificación del virus fue analizada mediante reacción de transcripción inversa-PCR con los 2 conjuntos de cebadores en cada mezcla de reacción: un conjunto específico para la región de las proteasas de T36, el otro para la región de las proteasas de T68 para discriminar entre T36 y L1L2h.

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DESCRIPCIÓN DETALLADA

Los virus tienden a evitar la superinfección por virus relacionados. La adición de un vector transitorio basado en un virus normalmente impediría la aplicación de ese o de otro vector relacionado a los mismos árboles. Los inventores se han dado cuenta ahora, también, de que hay ocasiones en las que sería valioso tener la 40 capacidad de añadir el vector al organismo diana (por ejemplo, árbol o planta) después de que dicho organismo diana ya hubiera sido infectado con un vector similar. Por ejemplo, ha llegado a la atención de los inventores que sería valioso poder añadir vectores si el vector ha dejado de expresar el gen foráneo en una planta; si se ha encontrado un gen más beneficioso para expresarlo árboles; y/o sise necesita expresar más de un gen. También ha llegado a la atención de los inventores que es deseable poder administrar un vector 45 de una cepa viral a una planta que ya esté infectada con un tipo silvestre de esa cepa. Los inventores han descubierto que modificaciones dirigidas dentro de ciertas porciones de un vector viral pueden evitar el fenómeno de exclusión de la superinfección.

Para ciertas realizaciones de la invención se describen en esta descripción unas construcciones de virus 50 manipulados basadas en el virus de la tristeza de los cítricos (CTV), un closterovirus de ARN de sentido positivo, que son capaces de causar superinfección en plantas que han sido infectadas con un virus de una cepa similar. Los inventores han descubierto que las construcciones virales manipuladas a través de la modificación de un virus CTV de tipo silvestre tales como las que contienen una secuencia líder de la proteasa sustituida por una secuencia líder de una proteasa de una cepa viral diferente son capaces de 55 superar la exclusión de la superinfección.

De acuerdo con otras determinadas realizaciones, la invención se refiere a construcciones de virus manipuladas basadas en el virus de la tristeza de los cítricos (CTV), un closterovirus de ARN de sentido positivo, que son capaces de permitir la superinfección con construcciones de virus basadas en CTV 60 introducidas posteriormente. Los inventores han descubierto que las construcciones de virus manipuladas vía modificación del virus CTV de tipo silvestre tales como las que carecen del gen para la proteína p33 funcional no proporcionan protección frente a la infección causada por el virus de tipo silvestre. Cuando la construcción viral que carece de la proteína p33 y el CTV de tipo silvestre se utilizaron para la inoculación secuencial de plantas, la infección primaria de las plantas con la construcción del virus mutante por deleción no tuvo ningún 65

efecto notable sobre el establecimiento de la infección secundaria por el virus de tipo silvestre. Por tanto, la deleción del ORF de p33 resultó en una variante “no-protección cruzada” del CTV.

Anteriormente, los inventores examinaron las relaciones entre los diferentes genotipos del virus de la tristeza de los cítricos (CTV) en términos de su capacidad para prevenir la superinfección por otro aislado del virus. 5 Demostraron que la exclusión de la superinfección se produjo sólo entre aislados de la misma cepa de CTV. Cuando se utilizaron aislados de la misma cepa para la inoculación secuencial de plantas, la infección primaria proporcionó la exclusión completa del aislado de descarga (“challenge”). Uno de los ejemplos de protección cruzada completa entre virus de CTV puso de manifiesto que hubo una inhibición completa de la infección de CTV en plantas previamente infectadas con el CTV de tipo silvestre perteneciente a la misma 10 cepa T36.

De acuerdo con una realización, los inventores examinaron la exclusión de la superinfección de construcciones virales manipuladas basadas en un clon de ADNc infeccioso de la cepa T36 de CTV. Se ha demostrado que las construcciones virales manipuladas mediante la modificación del virus CTV de tipo 15 silvestre, tales como las que carecen del gen para la proteína p33 funcional o que contienen una sustitución de la región líder de la proteasa de otra cepa de CTV (T68), fallan en proporcionar la exclusión de la superinfección por la infección del virus de tipo silvestre. Cuando cualquiera de estas construcciones virales se utilizó para la inoculación inicial de los árboles de cítricos seguido por la inoculación secuencial de plantas con CTV de tipo silvestre, la infección primaria de las plantas con las construcciones de virus mutante no tuvo 20 ningún efecto notable sobre el establecimiento de la infección secundaria por el virus de tipo silvestre. Por lo tanto, la deleción de la ORF de p33 así como la sustitución de la región líder de la proteasa dio como resultado unas variantes “no-protección cruzada” de CTV. Esas construcciones potencialmente pueden ser utilizadas como vectores para árboles que permiten múltiples aplicaciones.

25

En otra realización, la invención se refiere a una construcción de un vector viral, en donde la construcción está manipulada para tener una secuencia líder de la proteasa de un aislado de una cepa diferente de una especie viral común sustituida por la secuencia líder de la proteasa endógena del vector viral. Las cepas de CTV se definen como linajes filogenéticamente distintos del virus en base a análisis de las secuencias de nucleótidos del ORF 1a (Hilf et al., 2005). Usando esta definición, T36 y T68 son designados como cepas. 30 Las muestras de virus individuales se designan como aislados de una de estas cepas. Cada cepa se nombra después de un “aislado tipo” y se compone de aislados con una divergencia en la secuencia pequeña con respecto a la del miembro tipo. En una realización más específica, el vector viral es un aislado de CTV en el que se ha sustituido una secuencia líder de la proteasa de un aislado de una cepa diferente de CTV. En una realización aún más específica, el vector de CTV está manipulado en base a un aislado de la cepa T36 en el 35 que su secuencia líder de la proteasa está sustituida por la secuencia líder de la proteasa de un aislado de la cepa T68 de CTV. En una realización más específica, la secuencia de la proteasa sustituida es un dominio de proteasa de tipo papaína.

Según otra realización, las invenciones se refieren a un método para aliviar la exclusión de la superinfección 40 de vectores virales de CTV provocada por inoculaciones sucesivas de virus. El método incluye la inoculación de una planta diana con un primer vector viral de CTV que tiene un ORF de p33 omitido o interrumpido, dejar que el primer vector viral de CTV infecte la planta diana con lo que se produce una planta infectada y, posteriormente, la inoculación de la planta infectada con un segundo vector viral de CTV que comprende, o no comprende, un gen de p33 o un gen de p33 interrumpido. Al segundo vector viral de CTV se le permite 45 infectar a la planta ya infectada previamente. En una realización específica, la planta diana es un árbol de un cítrico. En otra realización específica, el primer y/o el segundo vector de CTV es manipulado para incluir una secuencia expresable que codifica una proteína heteróloga.

Según otra realización, las invenciones se refieren a un método para aliviar la exclusión de la superinfección 50 de vectores virales de CTV provocada por inoculaciones sucesivas de virus. El método incluye la inoculación de un organismo diana con un primer y con un segundo vector viral. El primer vector viral de CTV se manipula de forma tal que una secuencia líder de la proteasa sea modificada por sustitución con una secuencia líder de una proteasa de un aislado de otra cepa de CTV. En una realización específica, los vectores virales primero y segundo derivan de una especie viral común. En una realización aún más 55 específica, los vectores virales primero y segundo contienen regiones líder de la proteasa procedentes de aislados de diferentes cepas de CTV. En una realización específica, el organismo diana es una planta, y en realizaciones aún más específicas, es un árbol, e incluso en realizaciones aún más específicos, un árbol de un cítrico. En otra realización específica, el primer y/o el segundo vector de CTV es manipulado para incluir una secuencia expresable que codifica una proteína heteróloga. 60

Los inventores se han dado cuenta de que hay ocasiones en las que sería valioso tener la capacidad de añadir el vector al organismo diana (por ejemplo, árbol o planta) después de que el organismo diana ya hubiera sido infectado con un vector similar. Por ejemplo, ha llegado a la atención de los inventores que sería valioso poder añadir vectores si el vector ha dejado de expresar el gen foráneo en una planta; si se ha 65 encontrado un gen más beneficioso para expresarlo árboles; y/o sise necesita expresar más de un gen.

También ha llegado a la atención de los inventores que es deseable poder administrar un vector de una cepa viral a una planta que ya esté infectada con un tipo silvestre de esa cepa. En consecuencia, los inventores han descubierto que modificaciones dirigidas dentro de ciertas porciones de un vector viral pueden evitar el fenómeno de exclusión de la superinfección.

5

Los inventores han descubierto que construcciones virales manipuladas mediante la modificación del virus CTV de tipo silvestre, tales como aquellas que contienen una secuencia líder de proteasa sustituida por una secuencia líder de proteasa de una cepa viral diferente, son capaces de superar la exclusión de la superinfección.

10

Se han examinado las relaciones entre los diferentes genotipos del virus de la tristeza de los cítricos (CTV) en términos de su capacidad para prevenir la superinfección por otro aislado del virus. Se ha demostrado que la exclusión de la superinfección se produjo sólo entre aislados de la misma cepa de CTV. Cuando los aislados de la misma cepa se utilizaron para la inoculación secuencial de plantas, la infección primaria proporcionó la exclusión completa del aislado de descarga. Uno de los ejemplos de protección cruzada completa entre virus 15 CTV puso de manifiesto que hubo una inhibición completa de la infección de CTV en plantas previamente infectadas con el CTV de tipo silvestre perteneciente a la misma cepa T36 (Folimonova et al., 2010).

De acuerdo con una realización, los inventores examinaron la exclusión de la superinfección de construcciones virales manipuladas basadas enun clon de ADNc infeccioso de la cepa T36 de CTV. Se ha 20 demostrado que las construcciones virales manipuladas a través de la modificación del virus CTV de tipo silvestre, tales como las que contienen la sustitución de la región de la proteasa L1L2 con una secuencia conocida procedente de una cepa viral diferente, permiten al vector viral manipulado evitar la exclusión de la superinfección incluso en plantas ya infectadas con la misma cepa del virus. Por consiguiente, las realizaciones de los vectores virales de la presente invención pueden ser utilizadas como vectores para 25 árboles previamente infectados con el virus de la misma cepa, tales como los árboles que crecen en el campo que resultaron infectados por transmisión natural del virus o árboles que resultaron infectados como resultado de una aplicación anterior de un vector de CTV manipulado basado en la misma cepa del virus, para evitar la exclusión de la infección secundaria por el vector viral.

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En otra realización, la invención se refiere a una construcción de un vector viral, en donde la construcción está manipulada para tener una secuencia líder de la proteasa de un aislado de una cepa diferente de una especie viral común sustituida por la secuencia líder de la proteasa endógena del vector viral. Las cepas de CTV se definen como linajes filogenéticamente distintos del virus en base a análisis de las secuencias de nucleótidos del ORF 1a (Hilf et al., 2005). Usando esta definición, T36 y T68 son designados como cepas. 35 Las muestras de virus individuales se designan como aislados de una de estas cepas. Cada cepa se nombra después de un “aislado tipo” y se compone de aislados con una divergencia en la secuencia pequeña con respecto a la del miembro tipo. En una realización más específica, el vector viral es un aislado de CTV en el que se ha sustituido una secuencia líder de la proteasa de un aislado de una cepa diferente de CTV. En una realización aún más específica, el vector de CTV está manipulado en base a un aislado de la cepa T36 en el 40 que su secuencia líder de la proteasa está sustituida por la secuencia líder de la proteasa de un aislado de la cepa T68 de CTV. En una realización más específica, la secuencia de la proteasa sustituida es el dominio L1L2.

Según otra realización, la invención se refiere a un método para aliviar la exclusión de la superinfección de 45 vectores virales de CTV provocada por inoculaciones sucesivas de virus. En una realización específica, el método puede incluir la inoculación a una planta diana con un primer vector viral de CTV manipulado basado en una primera cepa de CTV, dejar que el primer vector viral de CTV infecte la planta diana con lo que se produce una planta infectada, y, posteriormente, la inoculación de la planta infectada con un segundo vector viral de CTV construido basado en la misma cepa de CTV pero que ha sido modificada para incluir una 50 secuencia líder de la proteasa de una cepa diferente (segunda) del virus. El segundo vector viral de CTV también puede incluir un gen de interés que expresa una proteína destinada a lograr un efecto beneficioso. En una realización específica, la primera cepa es T36 y la segunda cepa es T68. El segundo vector viral de CTV puede infectar a la planta ya infectada previamente. En una realización específica, la planta diana es un árbol de un cítrico. En otra realización específica, el vector de CTV primero y/o segundo está manipulado 55 para incluir una secuencia expresable que codifica una proteína heteróloga.

Según otra realización, las invenciones pertenecen a un método para aliviar la exclusión de la superinfección de vectores virales. El método incluye la inoculación de un organismo diana con un vector viral de una cepa que ya ha infectado al organismo diana. El segundo vector viral es manipulado de tal manera que se modifica 60 una secuencia líder de la proteasa mediante sustitución con una secuencia líder de una proteasa conocida procedente de un aislado de otra cepa de CTV. En una realización específica, los vectores virales primero y segundo derivan de una especie viral común. En una realización aún más específica, los vectores virales primero y segundo contienen regiones líder de la proteasa procedentes de aislados de cepas de CTV diferentes. En una realización más específica, la secuencia líder de la proteasa comprende un fragmento de 65 una secuencia líder de la proteasa completa que comprende 800 pares de bases (pb) o menos, 700 pb o

menos, 600 pb o menos, 500 pb o menos, 400 pb o menos, 300 pb o menos, a 200 pb o menos, o 100 pb o menos. Alternativamente, el vector comprende al menos un fragmento de 100 pb, 200 pb, 300 pb, 400 pb, ó 500 pb de una secuencia líder de la proteasa completa. Una descripción no limitativa de ejemplos de secuencias líder de proteasas conocidas se mencionan más adelante en la sección de referencias. En una realización específica, el organismo diana es una planta, y en realizaciones aún más específicas es un árbol, 5 e incluso en realizaciones aún más específicas, un árbol de un cítrico. En otra realización específica, el primer y/o segundo vector de CTV está manipulado para incluir una secuencia expresable que codifica una proteína heteróloga.

Tal como se usa en la presente descripción, una especie de virus es una población de virus con 10 características similares que infectan el mismo (o casi) rango de especies hospedadoras. La referencia a "cepa(s) viral(es)" se refiere a un virus clasificado bajo una especie tal como CTV, u otras especies virales, pero que poseen secuencias génicas, o alguna otra característica, que son identificativamente diferentes de otro virus clasificado en la misma especie.

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EJEMPLOS

EJEMPLO 1

Construcción delta p33 de CTV

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Los inventores han examinado varias construcciones virales conteniendo todas ellas la deleción del ORF de p33 que han sido manipuladas previamente basadas en el clon de ADNc infeccioso de T36 de CTV (Tatineni et al., 2008) por su capacidad para prevenir la superinfección de CTV que expresa GFP. Esos mutantes de deleción han demostrado ser capaces de multiplicarse en y de invadir sistemáticamente árboles de la mayoría de variedades de cítricos (Tatineni et al., 2008). Para evaluar el efecto de una infección primaria de 25 una planta hospedadora con un mutante de deleción de p33 de CTV sobre la capacidad CTV marcado con GFP de establecer superinfección en el mismo hospedador, árboles pequeños de Citrus macrophyilla fueron inoculados primero con el virus mutante. Como control para este experimento, otro conjunto de plantas fue inoculado con CTV de tipo silvestre, véase la Figura 1 que muestra una representación esquemática del CTV de tipo silvestre (A) y de la construcción del mutante de deleción de p33 (B). En ambas series, las infecciones 30 primarias se establecieron mediante el injerto de tejido infectado por virus en el tallo de los árboles. Las hojas superiores fueron recortadas para forzar el crecimiento de un nuevo conjunto de hojas. A las seis semanas tras la inoculación, las infecciones sistémicas de las nuevas hojas fueron confirmadas por ELISA. Las plantas se expusieron a continuación a un ensayo de descarga (“challenge”) mediante la inserción de un segundo injerto de tejido de corteza que contenía CTV-BC5/GFP. Cuando el injerto cicatrizó, las hojas superiores 35 fueron de nuevo recortadas para inducir otro nuevo brote de crecimiento. Después del desarrollo de la segunda serie de hojas nuevas (comenzando alrededor de 6 semanas) la capacidad del virus de descarga a superinfectar árboles fue determinada mediante observación visual de la fluorescencia de GFP en el tejido de la corteza de las hojas nuevas. Como resultado, el CTV de tipo silvestre previno completamente la superinfección por el virus que expresa GFP: no se detectó fluorescencia por la GFP en plantas sometidas a 40 una infección primaria con CTV9R. Por el contrario, todas las plantas que habían sido sometidas a infección primaria con el virus mutante que carecía de la proteína p33 funcional mostraron una fluorescencia por GFP similar a la observada en las plantas que no habían sido sometidas a infección primaria y en las que únicamente se había inoculado el virus de descarga CTV-BC5/GFP, lo que indicaba que el mutante de deleción no ejercía ninguna interferencia con la infección por CTV marcado con GFP. 45

EJEMPLO 2

Construcción de CTV con sustitución de la región líder de las proteasas

50

En un experimento similar, los inventores examinaron construcciones virales híbridas en las que la región líder de las proteasas (posiciones de los nucleótidos 108-3.040 en el genoma de CTV) fue sustituida por la correspondiente región del genoma T68-1, mientras que el resto de la construcción híbrida contenía secuencia de T36 (una representación esquemática de la construcción se puede observar en la Figura 1 (C)). T68-1 representa un aislado de la cepa T68 de CTV. De forma similar a la del experimento descrito 55 anteriormente, la construcción ha sido utilizada para la inoculación inicial de plantas de cítricos, que más tarde (después de la confirmación del establecimiento de la infección por ELISA) fueron inoculados con virus de descarga CTV-BC5/GFP. CTV de tipo silvestre fue utilizado para la inoculación primaria de los árboles de control (como en el experimento anterior). Comenzando a las 6 semanas después de la inoculación de la descarga la capacidad del virus de descarga de superinfectar árboles fue determinada mediante observación 60 visual de la fluorescencia por GFP en el tejido de la corteza de las hojas nuevas. Como era de esperar, el CTV de tipo silvestre previno completamente la superinfección por el virus que expresaba GFP: no se detectó fluorescencia por GFP en plantas sometidas a infección primaria con CTV9R. Por el contrario, las plantas que habían sido sometidas a infección primaria con el virus híbrido que portaban la sustitución de la región líder de la proteasa mostraron fluorescencia por GFP similar a la observada en las plantas que no habían sido 65 sometidas a infección primaria y a las que únicamente se las había inoculado el virus de descarga CTV-

BC5/GFP, lo que indicaba que este virus híbrido no ejercía ninguna interferencia con la infección por CTV marcado con GFP.

EJEMPLO 3 5

Virus con la sustitución de la región de la proteasa supera la exclusión

Recientemente, se examinó si la modificación de la región líder de las proteasas proporcionaría la capacidad del virus para superar la exclusión. Hemos manipulado una construcción viral híbrida en la que una región en el clon de ADNc de T36 conteniendo dos secuencias líder de proteasas L1 y L2 (posiciones de los 10 nucleótidos 108-3.039 en el genoma de CTV) ha sido sustituida por la correspondiente región del genoma del aislado T68-1 de la cepa T68, mientras que el resto de la construcción del híbrido contenía la secuencia de T36 (Fig. 2). La construcción viral descrita se utilizó para la inoculación de la descarga de plantas sometidas a infección primaria con el virus CTV T36 parental. Tal como hemos demostrado anteriormente, la infección primaria con un aislado de CTV excluye completamente la infección con otro aislado de la misma cepa. Por 15 ejemplo, la infección con un aislado de la cepa T36 excluyó la infección secundaria con otros aislados de la cepa T36 así como excluyó la infección con el virus basado en T36 marcado con GFP. Además, la infección con el aisaldo T36 excluyó completamente las infecciones secundarias por los virus híbridos construidos en base al aislado T36 en el que las secuencias de 8 genes en la mitad 3’ del genoma fueron sustituidas (secuencias de genes individuales o de varios genes en combinaciones) por las correspondientes secuencias 20 de los aislados de las cepas T30 o T68. Sorprendentemente, el virus híbrido con la región líder de las proteasas de T68 sustituido en el genoma T36 demostró un comportamiento único: el virus mutante era capaz de infectar sistémicamente plantas previamente infectadas con el virus parental T36, mostrando niveles de acumulación de virus similares a los niveles del mismo virus cuando se inoculó en plantas sanas (Fig. 1; comparar el carril 4 con los otros carriles de inoculaciones de control). 25

REFERENCIAS

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40 Satyanarayana, T., Gowda, S., Boyko, V.P., Albiach- arti, .R., Mawassi, M., Navas-Castillo, J., Karasev, A.V., Dolja, V., Hilf, M.E., Lewandowski, D.J., Moreno, P., Bar-Joseph, M., Garnsey, S., Dawson, W.O., 1999. An engineered closterovirus RNA replicon and analysis of heterologous terminal sequences for replication. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 7433-7438.

45 Satyanarayana, T., Gowda, S., Mawassi, ML, Albiach-Marti, M.R., Ayllon, M.A., Robertson, C, Garnsey, S.M., Dawson, W.O., 2000. Closterovirus encoded HSP70 homolog and p61 in addition to both coat proteins function in efficient virion assembly. Virology 278, 253-265.

Satyanarayana, T., Bar-Joseph, M., Mawassi, M., Aibiach-Martf, M.R., Ayllon, M.A., Gowda, S., Hilf, M.E., 50 Moreno, P., Garnsey, S.M., Dawson, W.O., 2001. Amplification of Citrus tristeza virus from a cDNA clone and infection of citrus trees. Virology 280, 87-96.

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20 Wildum, S. M., M. Schindler, J. Munch, and F. Kirchhoff. 2006. Contribution of Vpu, Env, and Nef to CD4 down-modulation and resistance of human immunodeficiency virus type !-infected T cells to superinfection. J. Virol. 80:8047-8059.

Ver también Foliminova et al., J Virol. (2010) 84:1314-1325, para la divulgación en la producción de 25 construcciones virales y su uso para la infección en plantas.

Las enseñanzas de las referencias citadas a lo largo de la descripción se incorporan aquí en su totalidad por referencia en la medida en que no sean incompatibles con las presentes enseñanzas. Se debe entender que los ejemplos y las realizaciones descritas aquí son para propósitos ilustrativos solamente y que varias 30 modificaciones o cambios a la luz de los mismos serán sugeridas a los expertos en la técnica y han de incluirse dentro del espíritu y alcance de la presente solicitud.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para aliviar la exclusión de la superinfección de vectores virales de CTV asociada con transfecciones sucesivas de virus a una planta diana, comprendiendo dicho método:

5

inocular una planta diana con un primer vector viral de CTV que tiene un gen de p33 del mismo o interrumpido de otra manera;

dejar que el primer vector viral de CTV infecte la planta diana para producir una planta infectada primariamente, e 10

inocular la planta infectada primariamente con un segundo vector viral de CTV que comprende, o no comprende, un gen de p33 o un gen de p33 interrumpido, en donde el segundo vector viral de CTV infecta además a la planta infectada primariamente para producir una planta infectada secundariamente. 15
2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha planta diana es un árbol de un cítrico.
3. El método de la reivindicación 1, en el que el primer y/o segundo vector viral de CTV está manipulado para incluir una secuencia expresable que codifica una proteína heteróloga. 20
4. Un método para aliviar la exclusión de la superinfección de vectores virales asociada con inoculaciones sucesivas a un organismo diana con un primer y un segundo vector viral, en donde el primer vector viral está manipulado para tener una secuencia líder de la proteasa de otra cepa de CTV sustituida en el mismo, comprendiendo dicho método: 25

inocular el organismo diana con el primer vector viral;

dejar que el primer vector viral infecte el organismo diana para producir un organismo infectado primariamente, e 30

inocular el organismo infectado primariamente con el segundo vector viral, en donde el segundo vector viral de CTV infecta además al organismo infectado primariamente para producir un organismo infectado secundariamente.

35
5. El método de la reivindicación 4, en el que dicho organismo diana es una planta.
6. El método de la reivindicación 4, en el que dicho organismo diana es un árbol.
7. El método de la reivindicación 6, en el que dicho organismo diana es un árbol de un cítrico. 40
8. El método de la reivindicación 4, en el que dicho primer y segundo vector viral están manipulados de manera que contienen las regiones líder de proteasas de cepas diferentes de una especie viral común.

45
9. El método de la reivindicación 8, en el que dicha especie viral común es CTV.
10. El método de la reivindicación 9, en el que dicho primer vector viral está manipulado basado sobre la cepa T36 de CTV.

50
11. El método de la reivindicación 9, en el que dicho segundo vector viral está manipulado basado sobre la cepa T36 de CTV en el que la región líder de la proteasa ha sido sustituida por una región conocida de un aislado de la cepa T68 de CTV.
12. El método de la reivindicación 4, en el que dicho primer y/o segundo vector viral está manipulado 55 para incluir una secuencia expresable que codifica una proteína heteróloga.
13. El método de la reivindicación 9, en el que dicha secuencia líder de la proteasa codifica una proteasa de tipo papaína.

60
14. Un vector viral manipulado para tener una secuencia líder de una proteasa de una cepa diferente de una especie viral común sustituida por una secuencia líder de una proteasa endógena, y está manipulado para incluir una secuencia expresable que codifica una proteína heteróloga.
15. El vector viral de la reivindicación 14, en el que dicho vector viral es una cepa de CTV en el que se 65 ha sustituido una secuencia líder de la proteasa de una cepa diferente de CTV.
16. El vector viral de la reivindicación 15, en el que dicha cepa de CTV es T36 en el que su secuencia líder de la proteasa está sustituida por una secuencia líder de la proteasa de la cepa T68 de CTV.
17. El vector viral de la reivindicación 15, en el que la secuencia de la proteasa sustituida es un dominio 5 de proteasa de tipo papaína.
18. Un método para aliviar la exclusión de la superinfección de vectores virales asociada con transfecciones sucesivas de virus en una planta diana previamente infectada con una primera cepa viral, comprendiendo dicho método: 10

inocular la planta pre-infectada con un vector viral de dicha primer cepa viral, comprendiendo dicho vector viral una construcción que comprende una secuencia de proteasa de una segunda cepa viral y que comprende una proteína heteróloga de interés, en donde el vector viral infecta además a la planta infectada primariamente para producir una planta infectada 15 secundariamente.
19. El método de la reivindicación 18, en el que dicha proteína heteróloga de interés es expresada en dicha planta infectada secundariamente.

20
20. El método de la reivindicación 18, en el que dicho vector viral es CTV.
21. El método de la reivindicación 18, en el que dicha planta diana es un árbol de un cítrico.
22. El método de la reivindicación 18, en el que dicha primera cepa viral es T36. 25
23. El método de la reivindicación 18, en el que dicha segunda cepa viral es T68.
24. El método de la reivindicación 18, en el que dicha secuencia de la proteasa es una secuencia líder de una proteasa de una región conocida de la segunda cepa viral. 30
25. El método de la reivindicación 18, en el que dicha secuencia de la proteasa es una secuencia del dominio L1L2.
26. Un vector viral manipulado para tener una secuencia líder de una proteasa de una cepa diferente de 35 una especie viral común sustituida por una secuencia líder de una proteasa endógena, y está manipulado para incluir una secuencia expresable que codifica una proteína heteróloga.
27. El vector viral de la reivindicación 28, en el que dicho vector viral es un aislado de una cepa de CTV en el que se ha sustituido una secuencia líder de la proteasa de una cepa diferente de CTV. 40
28. El vector viral de la reivindicación 27, en el que la cepa de CTV es T36 en el que su secuencia líder de la proteasa está sustituida por una secuencia líder de la proteasa de la cepa T68 de CTV.
29. El vector viral de la reivindicación 27, en el que la secuencia de la proteasa sustituida es del dominio 45 L1L2.